Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af den National Natural Science Foundation of China (grant numre 81573573, 81473338 og 81503344) og klassisk recept grundlæggende forskning hold på Beijing Universitet i kinesisk medicin.

Alle de dyre procedurer udføres i denne undersøgelse er blevet godkendt af den etiske bedømmelsesudvalg på Beijing University of kinesiske medicin (godkendelse nummer 2016BZYYL00109).
Bemærk: Kvindelige BALB/c mus (8 uger gammel) blev immuniseret med hapten-carrier protein konjugater. Når det anvendes alene, et lille molekyle (< 1000 Da) ikke kan fremkalde en immunrespons. Men de tråddannende den lille molekyle til et luftfartsselskab makromolekyle resultater i antigen syntese. I denne ...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Vi præsenterer her, en protokol for den vellykkede produktion af mAbs mod naturlige produkt, der stammer små molekyler. De afgørende trin i proceduren er blevet skitseret, og vi har vist nytten af denne protokol bruger NAR som et eksempel lille molekyle. Eksempel spektre, reaktivitet analyser og icELISA resultater viser alle repræsentant eksperimentelle og kontroldata, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol. Eksempler på billeder af hybridomer give en visuel repræsentation af hvad forskeren bør være på ...

Monoklonale antistoffer (papagøjesyge), også kendt som mono-specifikke antistoffer, er fremstillet af et enkelt B-lymphocyte klon og er sammensat af monovalent antistoffer at alle binder sig til den samme epitop1. I de seneste år, har været brugt mange plante-afledt naturlige lægemidler til behandling af forskellige sygdomme2. Faktisk, mange små molekylære forbindelser oprindeligt stammer fra naturlige produkter anvendes nu som første-line lægemidler, såsom artemisinin mod malaria og paciltaxel (taxol) for kræft2,3. Undersøgelse af naturlige produkter har gjort hurtige fremskridt, hovedsagelig på grund af den enorme udvikling og optimering af konventionelle analyseteknikker, herunder højtryksvæskekromatografi (HPLC) samt massespektrometri (MS). Men der er stadig nogle begrænsninger i forbindelse med disse metoder, såsom deres komplekse forbehandling protokoller og dermed forbundne omkostninger med hensyn til tid, labor/ekspertise og nødvendige instrumenter4.
For nylig, mAb-baserede enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) er blevet anvendt for kvalitativt og kvantitativt at analysere fødevarer og naturlige produkter. I virkeligheden, denne metode er blevet anvendt til både biologiske prøver analyse og klinisk afprøvning og har vist sig at være præcise, følsomme og meget effektiv samtidig også undgå de kedelige forbehandling trin forbundet med andre analyser5, 6.
Når du bruger mAb-baserede ringprøver for at studere komplekse naturprodukter, er forberedelse af monoklonale antistoffer et af de centrale trin. Desværre, den mAbs specifikke til de lille bioaktive komponenter i disse typer af stoffer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 er ofte begrænsede i forhold til protein antigener. For at omgå dette problem, har vi udviklet en protokol til at specifikt generere mAbs mod små forbindelser. Protokollen præsenteres her indeholder kunstige antigen syntese, mus immunisering, cellefusion, indirekte konkurrerende ELISA og monoklonale hybridom forberedelse.
Navnlig, har vores forskergruppe at studere dannelsen af mAbs mod små bioaktive stoffer fra traditionel kinesisk medicin og udvikle deres programmer for år. I vores igangværende undersøgelser, har vi udviklet mAbs mod baicalin16, puerarin17, et syre18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121og mange andre små molekyler. Vores ELISA protokoller baseret på disse mAbs har været brugt i en række undersøgelser for at vurdere farmakokinetik af disse små molekyler samt deres interaktioner med andre bioaktive stoffer. Derudover har bruger disse mAbs, vi også udviklet immunoaffinity kromatografi metoder til adskillelse af strukturelle analogstoffer deraf, herunder epimers. For nylig har forberedt vi en immunassay baseret på lateral strømning ved hjælp af vores anti-puerarin-mAb, der blev senere brugt til hurtige, on-site detektion af dette stof. Vores resultater viser, at vores mAb-baserede assays er uundværlig og praktiske værktøjer til at studere biologi og kvalitet af naturlige-produkt-afledte forbindelser, især dem, der anvendes i traditionel kinesisk medicin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

Analysen af de bioaktive komponenter i fødevarer og naturlige produkter er blevet et populært område af undersøgelse i mange områder, herunder traditionel kinesisk medicin og fødevarer sikkerhed/toksikologi. Mange af de klassiske analyseteknikker kræver dyrt udstyr og/eller ekspertise. Navnlig, er enzym-forbundet immunosorbent assays (ringprøver) blevet en nye metode til analyse af fødevarer og naturlige produkter. Denne metode er baseret på antistof-medieret påvisning af target-komponenter. Men som mange af de bioaktive komponenter i naturlige produkter er små (< 1000 Da) og ikke fremkalde en immunrespons, oprettelse af monoklonale antistoffer (papagøjesyge) mod dem er ofte vanskelig. I denne protokol giver vi en detaljeret redegørelse for de foranstaltninger til at generere mAbs mod målmolekyler samt de nødvendige for at oprette tilknyttede indirekte konkurrencedygtige (ic) ELISA til hurtig analyse af sammensat i flere prøver. Proceduren beskriver syntese af den kunstige antigen (dvs. hapten-carrier konjugat), immunisering, cellefusion, monoklonale hybridom forberedelse, karakterisering af mAb og ELISA-baserede anvendelsen af mAb. Hapten-carrier konjugat blev syntetiseret af natrium periodate metode og evalueret af MALDI-TOF-MS. Efter immunisering, splenocytes blev isoleret fra immuniserede mus med den højeste antistof titer og sammenvoksede med hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) - følsomme mus myelomatose cellelinie Sp2/0 - Ag14 ved hjælp af en polyethylenglycol (PEG)-baseret metode. Hybridomer secernerende mAbs reaktiv til target-antigen blev screenet ved icELISA for specificitet og krydsreaktivitet. Desuden, den begrænsende fortynding metode blev anvendt til at forberede monoklonale hybridomer. De endelige mAbs blev yderligere karakteriseret ved icELISA og derefter udnyttes i et ELISA-baseret program til hurtig og bekvem påvisning af eksempel hapten (naringin (NAR)) i naturprodukter.

Generation af monoklonale hybridomer
Molekylevægt af hapten-carrier konjugat blev bekræftet af MALDI-TOF-MS analyse. Molekylevægt af både BSA og NAR er kendt, kunne antallet af små molekyler konjugeret med BSA beregnes. Figur 1 viser repræsentative spektrale resultater for NAR-BSA22, som viser en bred peak på m/z 77,058. Da ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Denne artikel giver en detaljeret protokol for forberedelse og evaluering af monoklonale antistoffer mod naturlige produkter til brug i forskellige immunassays. Denne procedure omfatter vaccination, cellefusion, indirekte konkurrerende ELISA for positive klon screening og monoklonale hybridom forberedelse. Specifikationer for antistof karakterisering ved hjælp af MALDI-TOF-MS og ELISA analyser er også tilgængelige.

Generation af monoklonale antistoffer mod naturprodukter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonale antistoffer kaldes monospecifikke antistoffer, som fremstilles af en enkelt B-lymfocyt klon og de monovalente antistoffer, der binder sig til den samme epitop. For nylig er den monoklonale antistofbaserede ELISA blevet vores nye platform for kvalitativ eller kvantitativ analyse af fødevarer eller naturlige produkter. Denne metode er en nøjagtig, følsom og effektiv metode uden kedelige forbehandlingstrin.Så det er afgørende for biologiske prøver og de fremtidige kliniske anvendelser. Forberedelse af mAB'er af TCM er et afgørende skridt i undersøgelser af komplekse systemkarakteristika af TCM formel. Vi har udviklet en protokol til at generere mABs mod de små molekylære forbindelser, herunder kunstig antigensyntese, musimmunisering og cellefusion.Hapten er forbundet med bærerproteinet for at syntetisere det kunstige antigen. Kunstige antigen og komplette adjuvanser blandes og emulgeres. Musen blev immuniseret ved subkutan injektion.Tag milten af immuniseret mus ud og lav encellede suspension. Bland myelomatosecellerne. Miltytter isoleres og sammensmeltes med HAT-følsomme musemærelomcellelinje efter PEG-metode.Vælg en cellelinje, der kan forberede antistoffer ved HJÆLP AF ELISA. Hybridomaer udskiller monoklonale antistoffer, der er reaktive over for antigen, klones. Etablere hybridoma celle linje er kryoreserveret.Periodatoxidation blev anvendt til syntese af en narigin BSA konjugat. For det første blev narigin opløst ved en endelig koncentration på 1 mg pr. milliliter ved 100 mikroliter frisklavet natriumpariodatopløsning til fem milliliter nariginopløsning. Rør blandingen ved stuetemperatur i en time.For det andet tilsættes to milliliter luftfartsselskab protein til narigin natrium periodat reaktion blandingen. Blandingen justeres til pH ni opløsning og fortsætte med at reagere i seks til otte timer. For det tredje blev det kunstige antigen renset med dialysemetode i PDS i tre dage for at fremmedgøre CBS.Freunds komplette adjuvans og ufuldstændige adjuvans blev brugt til musimmunisering. Til vaccination blandes 50 mikrogram konjugat med et tilsvarende volumen af Freunds komplette adjuverende og emulgerer helt. Administrate 100 mikrogram af denne blanding til hver BALB / c mus via dorsale subkutane injektion.Levere en booster vaccination via subkutan injektion to uger senere med den samme mængde konjugat blandet med ufuldstændig adjuverende. Til primær immunisering blev Freunds fuldstændige adjuvans og immunogen anvendt via subdermal injektion. Til boosterimmunisering blev Freunds ufuldstændige adjuvans og immunogenet anvendt via subdermal injektion.Til eksimmunisering uden adjuvans blev der kun anvendt immunogen via subdermal injektion eller intraperinal injektion. Foderlagsceller stammer hovedsageligt fra abdominale epitelceller eller makrofag. RPMI 1640 FBS og HAT blev brugt til at forberede HAT skærmmediet.HAT-tillægget blev opløst i 10 milliliter RPMI medium, derefter tilsat i 500 milliliter RPMI 1640 indeholdende 20% FBS. Og ICR mus blev steriliseret med 75% ethylalkohol i fem minutter. Efter fjernelse af pelsen fra maven med hæmostatiske stænde, desinficere området med 75% ethanol.Skær den ydre hud til at afsløre bughulen. Injicer tre milliliter sterilt RPMI 1640 medium ind i maven. Masser derefter maven for at løsne yderligere celler i opløsningen.Aspirere fostercellesuspensionen ind i et 15 milliliter centrifugerør. Efter centrifugering af cellesuspensionen i 10 minutter ved 1,000g kasseres supernatanten og gensustres fostercellerne for at få en enkelt cellesuspension. Efter denne procedure opløses cellerne ved hjælp af HAT-mediet.Tæl cellerne for at gøre det 100,000 per milliliter fra cellemedlemmer. Overfør cellerne i 96 brøndcellekulturplader. Inkuber pladerne natten over ved 37 grader, 5% kuldioxid.Den valgte immuniserede mus blev steriliseret med 75% ethylalkohol i fem minutter. Aspirate RPMI 1640 medium som vaskebuffer. Fjern hud og muskelvæv ved hjælp af en saks til at udsætte milten.Isoler milten med pincet omhyggeligt. Derefter vaskes milten i RPMI 1640. Isoler milten og skær i stykker.Langsomt pund milten. Derefter blev det behandlet med en RMPI 1640 medium til at opløse cellerne til at forberede en milt celle suspension. Derefter blev cellerne filtreret af 800 mesh celle si.Søm milten omhyggeligt for at fjerne de store væv. Undgå store væv påvirke fusion af celler. Var miltcelleaffjedringen med RPMI 1640 medium.Derefter blev celleaffjedringen tilsat centrifugerøret. Høst miltcellerne ved centrifugering ved 1,000 g i 10 minutter. Og kassér så supernatanten.Miltcellerne skulle være på et beløb af en milliard til 10 milliarder. De dyrkede og forstærkede myelomatoseceller fjernes fra inkubatoren, og kolben rystes forsigtigt for at opnå en cellesuspension. Var suspensionen med RPMI to gange.Bland miltcellesuspensionen og myelomatosecellerne. Tæl cellerne og juster koncentrationen. Den endelige ration af miltceller til myelomatoseceller bør være en til fem til en til 10.Centrifuge cellen blandingen og derefter fjerne supernatant. Der tilsættes en milliliter 50% polyethylenglycolopløsning til cellerne, og rør forsigtigt ved 37 grader i et minut. Stående i 30 sekunder, tilsæt to milliliter RPMI 1640 medium og inkuberes ved 37 grader i to minutter for at afslutte reaktionen.Tilføj i to milliliter RPMI i yderligere et minut. Derefter tilsættes i 10 milliliter RPMI 1640. Centrifuge ved 800g i 10 minutter.Kassér supernatanten, tilsæt HAT-opløsning, og fortsæt med at dyrke cellerne i syv dage ved 37 graders 5% kuldioxid. Efter syv dage blev cellesupernatanter i 96 brøndplader indsugning efter cellefusion og tilsat ELISA-plader forbelagt med overfladebehandlingsantigen. Dyrket ved 37 grader i en time, sekundære antistof blev tilføjet og dyrket i en halv time.Efter tilsættes 100 mikroliter af substratopløsning. Stop reaktionen. Til ELISA-pladerne i mikropladelæseren blev slutpunktsmetoden anvendt, læs dataene ved 450 nanometer.Målt absorbans ved 450 nanometer og screen de positive hybridomer. Brug den begrænsende fortyndingsmetode til at forberede monoklonale hybridomer. Når HD-mediet er fjernet fra de valgte hybridomer, skal cellerne i RPMI 1640 igen suspenderes, og de tælles.Cellerne i en koncentration af en celle, to celler og fire celler pr. brønd fortyndes med RPMI 1640 i en 96 brøndplade og kultur. Overfør celler fra hybridomar, der er positive til 24 brøndplader, 25 og 75 kvadratcentimeter kolber til dyrkning. Opbevar myodomas i en gradient køleboks på minus 80 grader i 24 timer.Derefter overføres til flydende nitrogen til langtidsopbevaring. Titer af antiserums blev bestemt af indirekte ELISA. Mus en til fire blev immuniseret med narigin BSA konjugat var betydeligt højere end kontrolmusen uden immuniseret.Titeren på en til 5.000 er tilstrækkelig diffusion. Hapten konjugatets molekylvægt blev bekræftet ved MALDI-TOF-analyse. Som vist i figur to, som en molekylvægt af BSA standard og narigin har været kendt, kan vi beregne og fastslå, at molekylerne af narigin blev konjugeret med BSA.Kun hybridom kan overleve og vokse i HAT udvælgelse medier. Efter syv dages vækst kan cellekulturen testes af ELISA. De positive hybridomer blev re-klonet og udvidet.Disse billeder viser det konventionelle resultat for stabile monoklonale og polyklonale hybridomcellelinjer. Det kritiske punkt i dette eksperiment er screening af mAbs specifikke for hapten, men ikke bæreprotein. MAb's specificitet blev derefter undersøgt ved tilstedeværelse af andre strukturelt beslægtede forbindelser.Krydsreaktiviteten blev beregnet til at vurdere mAb-specificiteten for antigenet. Kalibreringskurven for naringin og linerområdet blev opnået. Antigenespecifikke monoklonale hybridomer blev udvidet og kryoreserveret i flydende nitrogen til langtidsopbevaring.Efter at have set denne video, håber jeg du har en god forståelse for, hvordan man kan generere monoklonale antistoffer mod en lille molekylær forbindelser. Så det er alt. Tak for dit øje og held og lykke til dine eksperimenter.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue og transformationsassay for Antileishmanial Screening mod intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoter i THP1 human akut monocytisk leukæmi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandling af blodplade Produkter med riboflavin og UV-lys: effektivitet mod højtiter bakteriel forurening

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Fremstilling af rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra Immortaliserede Sorteret B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling Influenza neuraminidase Inhibering Antistoftitere af Enzyme-linked lectin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Frembringelse af murine monoklonale antistoffer ved hybridomteknologi

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation af undslippe varianter af neutraliserende Influenza Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation af diskriminerende menneskelige monoklonale antistoffer fra sjældne Antigen-specifikke B celler cirkulerer i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigene Liposomer for Generation af sygdoms-specifikke antistoffer

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...