Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door de nationale Natural Science Foundation van China (subsidie nummers 81573573, 81473338 en 81503344) en het klassieke recept Basic onderzoeksteam aan de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde.

Alle dierlijke procedures uitgevoerd in deze studie zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de beoordeling op de Universiteit van Peking van Chinese geneeskunde (goedkeuring nummer 2016BZYYL00109).
Opmerking: Vrouwelijke BALB/c muizen (8 weken oud) werden geïmmuniseerd met hapten-carrier eiwit geconjugeerde. Wanneer gebruikt alleen een klein molecuul (< 1.000 Da) een immuunrespons kan niet uitlokken. Echter, conjugating de kleine molecuul aan een vervoerder macromolecule worden antige...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Hier presenteren we een protocol voor de succesvolle productie van mAbs tegen natuurlijke product afkomstige kleine moleculen. De essentiële stappen in de procedure hebben uitgestippeld, en we hebben laten zien het nut van dit protocol NAR gebruiken als een voorbeeld klein molecuul. De voorbeeld-spectra, reactiviteit analyses en resultaten van de icELISA alle Toon vertegenwoordiger experimentele gegevens en controles die wordt verkregen met behulp van dit protocol. Voorbeeld van de beelden van de hybridomas bieden een v...

Monoclonal antilichamen (mAbs), ook bekend als mono-specifieke antistoffen, geproduceerd door een enkele lymfocyt kloon en zijn samengesteld uit monovalent antilichamen die alle aan hetzelfde epitoop1 koppelt. In de afgelopen jaren hebben vele plantgerelateerde natuurlijke geneesmiddelen gebruikt bij de behandeling van verschillende ziekten2. Inderdaad, veel kleine moleculaire verbindingen oorspronkelijk afgeleid van natuurlijke producten zijn nu toegepast als eerstelijns drugs, zoals artemisinine tegen malaria en paciltaxel (taxol) voor kanker2,3. De studie van natuurlijke producten heeft snelle vorderingen gemaakt, grotendeels te wijten aan de enorme ontwikkeling en optimalisatie van conventionele analysetechnieken, met inbegrip van hogedrukvloeistofchromatografie (HPLC) en massaspectrometrie (MS). Er zijn echter nog enkele beperkingen die zijn gekoppeld aan deze methoden, zoals hun complexe voorbehandelingsplatformen protocollen en kosten met betrekking tot tijd, arbeid/expertise en vereiste instrumenten4.
Onlangs, mAb gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) zijn toegepast om kwalitatief en kwantitatief te analyseren voedingsmiddelen en natuurlijke producten. In feite, deze methode is toegepast bij zowel biologische monsters analyses en klinische tests en gebleken te zijn nauwkeurig, gevoelig en hoogefficiënte terwijl ook het vermijden van de vervelende voorbehandelingsplatformen stappen die zijn gekoppeld aan andere analyses5, 6.
Bij het gebruik van mAb gebaseerde ELISAs om te studeren van complexe natuurlijke producten, is voorbereiding van het monoclonal antilichamen een van de stappen van de kern. Helaas, de mAbs specifiek voor de kleine bioactieve componenten aanwezig zijn in dit soort stoffen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 zijn vaak beperkt in vergelijking met de eiwit antigenen. Om dit probleem te omzeilen, hebben we een protocol voor het genereren van specifiek mAbs tegen kleine verbindingen. Het hier gepresenteerde protocol bevat kunstmatige antigeen synthese, muis immunisatie celfusie, indirecte competitieve ELISA en monoclonal hybridoma voorbereiding.
Met name is onze onderzoeksgroep het bestuderen van de vorming van mAbs tegen kleine bioactieve stoffen uit de traditionele Chinese medicijnen en ontwikkelen van hun toepassingen voor jaren. In onze aan de gang zijnde onderzoeken, hebben we mAbs tegen baicalin16, puerarin17, glycyrrizine zuur18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121en vele andere kleine moleculen. Onze ELISA-protocollen op basis van deze mAbs zijn gebruikt in een aantal studies om te evalueren van de farmacokinetiek van deze kleine moleculen, alsmede hun interacties met andere bioactieve stoffen. Bovendien, met behulp van deze mAbs, we hebben ook immunoaffinity chromatografie methodes ontwikkeld voor de scheiding van structuuranalogons daarvan, met inbegrip van epimers. Onlangs, wij bereid een laterale-flow-immunoassay met behulp van onze anti-puerarin mAb die vervolgens werd gebruikt voor snelle, on-site detectie van dit samengestelde. Onze resultaten wijzen erop dat onze mAb-gebaseerd testen onmisbaar en handige hulpmiddelen zijn voor de studie van de biologie en de kwaliteit van de natuurlijke product-afkomstige stoffen, met name die worden gebruikt in traditionele Chinese medicijnen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

De analyse van de bioactieve componenten aanwezig zijn in de voedingsmiddelen en natuurlijke producten uitgegroeid tot een populaire gebied van studie op vele terreinen, met inbegrip van traditionele Chinese geneeskunde en voedsel veiligheid/toxicologie. Veel van de klassieke analysetechnieken vereisen dure apparatuur en/of expertise. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) geworden met name, een nieuwe methode voor de analyse van de voedingsmiddelen en natuurlijke producten. Deze methode is gebaseerd op antilichaam-gemedieerde detectie van de doel-componenten. Echter, zoals veel van de bioactieve componenten in natuurlijke producten zijn klein (< 1.000 Da) en doen niet het opwekken van een immuunrespons, het creëren van monoclonal antilichamen (mAbs) tegen hen is vaak moeilijk. In dit protocol bieden wij een gedetailleerde uitleg over de stappen die nodig zijn voor het genereren van mAbs tegen doel moleculen, alsmede degenen die nodig zijn voor het maken van de bijbehorende indirecte concurrerende (ic) ELISA voor de snelle analyse van de stof in meerdere monsters. De procedure wordt beschreven voor de synthese van de kunstmatige antigeen (dat wil zeggen, de geconjugeerde hapten-carrier) immunisatie, celfusie, monoklonaal hybridoma voorbereiding, karakterisatie van de mAb, en de ELISA gebaseerde toepassing van de mAb. De geconjugeerde hapten-carrier werd gesynthetiseerd door de natrium Perjodaat methode en geëvalueerd door de MALDI-TOF-MS. Na immunisatie, splenocytes werden geïsoleerd van de geïmmuniseerde muis met de hoogste antilichaam titer en gesmolten met de hypoxanthine-aminopterin-thymidine (hoed) - gevoelige muis myeloma cellijn Sp2/0 - Ag14 met behulp van een polyethyleenglycol (PEG)-op basis van de methode. De hybridomas afscheidende mAbs reactieve aan de target-antigeen waren gescreend door de icELISA voor de specificiteit en Kruisallergie. Bovendien, de beperkende verdunning-methode werd toegepast om te bereiden monoclonal hybridomas. De definitieve mAbs waren verder gekenmerkt door icELISA en vervolgens gebruikt in een ELISA gebaseerde toepassing voor de snelle en gemakkelijke opsporing van de voorbeeld hapten (naringin (NAR)) in natuurlijke producten.

Generatie van monoclonal hybridomas
Het molecuulgewicht van de geconjugeerde hapten-carrier werd bevestigd door MALDI-TOF-MS-analyse. Zoals het molecuulgewicht van zowel BSA en de NAR worden genoemd, kon het aantal kleine moleculen geconjugeerd met BSA worden berekend. Figuur 1 toont representatieve spectrale resultaten voor NAR-BSA22, waar...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Dit artikel bevat een gedetailleerd protocol voor de voorbereiding en de evaluatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten voor gebruik in verschillende immunoassay. Deze procedure omvat immunisatie, celfusie, indirecte competitieve ELISA voor positieve kloon screening en monoclonal hybridoma voorbereiding. De specificaties voor de karakterisering van het antilichaam met behulp van MALDI-TOF-MS en ELISA analyses zijn ook beschikbaar.

Generatie van monoklonale antistoffen tegen natuurlijke producten

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonale antilichamen staan bekend als mono-specifieke antilichamen die worden geproduceerd uit een enkele B-lymfocyten kloon en de monovalente antilichamen die binden aan dezelfde epitoop. Onlangs is de monoklonale antilichaamgebaseerde ELISA uitgegroeid tot ons opkomende platform voor de kwalitatieve of kwantitatieve analyse van voedingsmiddelen of natuurlijke producten. Deze methode is een nauwkeurige, gevoelige en effectieve methode zonder vervelende voorbehandelingsstappen.Dat is dus essentieel voor biologische monsters en de toekomstige klinische toepassingen. De voorbereiding van de mAB's van TCM is een essentiële stap in studies naar complexe systeemkenmerken van TCM-formule. We hebben een protocol ontwikkeld om mAB's te genereren tegen de kleine moleculaire verbindingen, waaronder kunstmatige antigeensynthese, muisvaccinatie en celfusie.De hapten is verbonden met het dragereiwit om het kunstmatige antigeen te synthetiseren. Kunstmatig antigeen en complete hulpstoffen worden gemengd en geëmulgeerd. De muis werd geïmmuniseerd door onderhuidse injectie.Neem de milt van de geïmmuniseerde muis en maak eencellige suspensie. Meng de myeloomcellen. Splenocyten worden geïsoleerd en gefuseerd met HAT-gevoelige muis myeloom cellijn door PEG methode.Selecteer een cellijn die door ELISA antilichamen kan voorbereiden. Hybridomen die monoklonale antilichamen afscheiden die reactief zijn op antigeen, worden gekloond. Stel vast dat de hybridoma cellijn cryopreserved is.Periodate oxidatie procedure werd gebruikt voor de synthese van een narigine BSA conjugaat. Ten eerste werd narigine opgelost bij een laatste concentratie van één milligram per milliliter bij 100 microliter vers bereide natriumpariodateoplossing tot vijf milliliter van de narigineoplossing. Roer het mengsel op kamertemperatuur gedurende een uur.Ten tweede, voeg twee milliliter dragereiwit toe aan het narigine natriumpastareactiemengsel. Pas het mengsel aan op pH negen-oplossing en blijf zes tot acht uur reageren. Ten derde werd het kunstmatige antigeen drie dagen lang gezuiverd met dialysemethode in PDS om het CBS te vervreemden.Freund's complete adjuvans en onvolledige adjuvans werden gebruikt voor muisvaccinatie. Meng voor de vaccinatie 50 microgram conjugaat met een gelijk volume van Freund's volledige adjuvans en emulgeer volledig. Administrate 100 microgram van dit mengsel aan elke BALB/c muis via dorsale onderhuidse injectie.Lever een booster vaccinatie via onderhuidse injectie twee weken later met dezelfde hoeveelheid conjugaat gemengd met onvolledige adjuvans. Voor primaire immunisatie werden Freund's volledige adjuvans en immunogen gebruikt via onderhuidse injectie. Voor booster immunisatie werden Freund's onvolledige adjuvans en het immunogen gebruikt via onderhuidse injectie.Voor botsimmunisatie zonder adjuvans werd alleen immunogen gebruikt via onderhuidse injectie of intraperineale injectie. Feed laag cellen voornamelijk afkomstig van abdominale epitheliale cellen of macrofaag. RPMI 1640 FBS en HAT werden gebruikt voor de voorbereiding van HAT-schermmedium.HAT supplement werd opgelost in 10 milliliter RPMI medium, vervolgens toegevoegd aan 500 milliliter RPMI 1640 met 20%FBS. En ICR muis werd gesteriliseerd door 75% ethylalcohol gedurende vijf minuten. Na het verwijderen van de vacht uit de buik met hemostatische tangen, desinfecteren gebied met 75%ethanol.Snijd de buitenste huid om de buikholte bloot te leggen. Injecteer drie milliliter steriele RPMI 1640 medium in de buik. Masseer vervolgens de buik om extra cellen los te maken in de oplossing.Aspirate de foetale cel suspensie in een 15 milliliter centrifuge buis. Na het centrifugeren van de celsuspensie gedurende 10 minuten bij 1,000 g, gooi de supernatant weg en schort u de foetale cellen opnieuw op om een celsuspensie te krijgen. Los na deze procedure de cellen op met hat-medium.Tel de cellen om het 100.000 per milliliter van celleden te maken. Breng de cellen in 96 goed celkweekplaten. Incubeer de platen 's nachts op 37 graden, 5%kooldioxide.De gekozen geïmmuniseerde muis werd gesteriliseerd door 75% ethylalcohol gedurende vijf minuten. Aanzuigen rpmi 1640 medium als de wasbuffer. Verwijder de huid en het spierweefsel met behulp van een schaar om de milt bloot te leggen.Isoleer de milt voorzichtig met de pincet. Was vervolgens de milt in de RPMI 1640. Isoleer de milt en snijd in stukken.Sla langzaam de milt. Vervolgens werd het behandeld met een RMPI 1640 medium om de cellen op te lossen om een miltcelsuspensie voor te bereiden. Daarna werden de cellen gefilterd door 800 mesh cell zeef.Spijker de milt voorzichtig om de grote weefsels te verwijderen. Het vermijden van grote weefsels beïnvloeden de fusie van cellen. Was de miltcelsuspensie met RPMI 1640 medium.Vervolgens werd de celsuspensie toegevoegd aan de centrifugebuis. Oogst de miltcellen door centrifugatie op 1.000 g gedurende 10 minuten. En gooi dan de supernatant weg.De miltcellen zouden een miljard tot 10 miljard bedragen. Verwijder de gecultiveerde en versterkte myeloomcellen uit de couveuse en schud de kolf voorzichtig om een celsuspensie te verkrijgen. Was de vering met RPMI twee keer.Meng de spleencelopening en de myeloomcellen. Tel de cellen en pas de concentratie aan. Het uiteindelijke rantsoen van miltcellen naar myeloomcellen moet één tot vijf tot één tot 10 zijn.Centrifugeren het celmengsel en verwijder vervolgens de supernatant. Voeg een milliliter van 50% polyethyleenglycoloplossing toe aan de cellen en roer gedurende een minuut zachtjes op 37 graden. Permanent voor 30 seconden, voeg twee milliliter RPMI 1640 medium en incubeer op 37 graden gedurende twee minuten om de reactie te beëindigen.Voeg in twee milliliter RPMI voor een andere een minuut. Voeg vervolgens toe aan 10 milliliter RPMI 1640. Centrifuge op 800g gedurende 10 minuten.Gooi de supernatant, voeg HAT-oplossing toe en blijf de cellen zeven dagen cultiveren met 37 graden 5%kooldioxide. Na zeven dagen werden celsupernatants in 96 putplaten na celfusie aangezogen en toegevoegd aan ELISA-platen die voorgecoat zijn met coatingantgeen. Gecultiveerd op 37 graden voor een uur, secundaire antilichaam werd toegevoegd en gecultiveerd voor een half uur.Na voeg 100 microliter van substraat oplossing. Stop de reactie. Om de ELISA platen in de microplate reader, eindpunt methode werd gebruikt lees de gegevens op 450 nanometer.Gemeten absorptie op 450 nanometer en scherm de positieve hybridomen. Gebruik de beperkende verdunningsmethode om de monoklonale hybridomen voor te bereiden. Nadat u het HD-medium uit de geselecteerde hybridomen hebt verwijderd, hangen de cellen opnieuw op in RPMI 1640 en tellen ze.Verdun de cellen van een concentratie van één cel, twee cellen en vier cellen per put door RPMI 1640 in een 96 putplaat en -cultuur. Breng cellen van de hybridomen die positief zijn tot 24 putplaten, 25 en 75 vierkante centimeter kolven voor de teelt. Bewaar de myodoma's in een gradiënt koelbox op min 80 graden gedurende 24 uur.Breng vervolgens over op vloeibare stikstof voor langdurige opslag. Titer van antiserums werden bepaald door indirecte ELISA. Muis een tot vier werd geïmmuniseerd met narigin BSA conjugaat was aanzienlijk hoger dan de controle muis zonder geïmmuniseerd.De titer van 1 tot 5.000 is voldoende diffusie. Het moleculaire gewicht van de hapten conjugaat werd bevestigd door MALDI-TOF analyse. Zoals blijkt uit figuur twee, als een moleculair gewicht van BSA-standaard en narigin zijn bekend, kunnen we berekenen en bepalen dat de moleculen van narigin werden geconjugeerd met BSA.Alleen de hybridoma kan overleven en groeien in HAT selectie media. Na zeven dagen groei kan de celkweek worden getest door ELISA. De positieve hybridomen werden opnieuw gekloond en uitgebreid.Deze beelden tonen de conventionele uitkomst voor stabiele monoklonale en polyklonale hybridoma cellijnen. Het kritieke punt van dit experiment is het screenen van de mAbs specifiek voor de hapten, maar niet drager eiwit. De specificiteit van de mAb werd vervolgens onderzocht in aanwezigheid van andere structureel verwante verbindingen.De kruisreactiviteit werd berekend om de mAb specificiteit voor het antigeen te evalueren. De kalibratiecurve van naringin en het linerbereik werden verkregen. De antigeenspecifieke monoklonale hybridomen werden uitgebreid en cryopreserved in vloeibare stikstof voor langdurige opslag.Na het bekijken van deze video, ik hoop dat je een goed begrip voor hoe monoklonale antilichamen te genereren tegen een kleine moleculaire verbindingen. Dus dat is alles. Bedankt voor uw kijken en veel geluk voor uw experimenten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passieve Toediening van monoklonale antilichamen tegen H. capsulatum Ea schimmels

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Een Parasiet Rescue and Transformation Assay voor antileishmania Screening tegen intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Human acute monocytische leukemiecellijn

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandeling van bloedplaatjes Producten met riboflavine en UV-licht: Effectiviteit tegen hoge titer bacteriële besmetting

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generering van recombinant humaan IgG Monoclonal Antibodies uit Onsterfelijk gesorteerde B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Meten Influenza neuraminidase Remming antilichaamtiters door Enzyme-linked lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generatie van Escape varianten van het Influenza Virus monoklonale antistoffen neutraliseren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generatie van discriminatoire menselijke monoklonale antistoffen uit zeldzame antigeen-specifieke B-cellen in bloed circuleert

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigene liposomen voor generatie van ziekte-specifieke antilichamen

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...