Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale de sciences naturelles de Chine (subvention numéros 81573573, 81473338 et 81503344) et le classique Prescription base équipe de recherche à l’Université de Pékin de médecine chinoise.

Toutes les procédures d’animaux dans cette étude ont été approuvés par le Comité d’examen éthique à l’Université de Pékin de médecine chinoise (agrément numéro 2016BZYYL00109).
Remarque : La souris femelles BALB/c (8 semaines) ont été immunisés avec conjugués de protéines Haptène-carrier. Lorsqu’il est utilisé seul, une petite molécule (< 1 000 Da) ne peut pas déclencher une réponse immunitaire. Cependant, conjuguant la petite molécule à un résultats de macro...

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	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. 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F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Nous présentons ici un protocole pour le succès de la production du mAbs contre naturels produit dérivé de petites molécules. Les étapes essentielles de la procédure ont été exposées, et nous avons démontré l’utilité du présent protocole à l’aide de NAR comme une petite molécule d’exemple. Les spectres de l’exemple, les analyses de réactivité et icELISA résultats tous montrent représentant expérimental et les données de contrôle qui sont obtenues à l’aide de ce protocole. Images d’exem...

Anticorps monoclonaux (ACM), également connu sous le nom des anticorps mono spécifiques, sont produites à partir d’un seul clone de lymphocyte et sont composés d’anticorps monovalents que tous se lient au même épitope1. Ces dernières années, de nombreux produits naturels provenant de plantes médicinales ont été utilisés dans le traitement de diverses maladies2. En effet, les nombreux petits composés moléculaires initialement dérivés de produits naturels sont maintenant appliquées comme des médicaments de première ligne, tels que de l’artémisinine pour le paludisme et paciltaxel (taxol) pour cancer2,3. L’étude des produits naturels a rapidement progressé, en grande partie en raison de l’énorme développement et l’optimisation des techniques d’analyse classiques, y compris la chromatographie liquide haute performance (HPLC) et spectrométrie de masse (MS). Cependant, il y a encore quelques limitations associées à ces méthodes, telles que leurs protocoles complexes de prétraitement et les coûts connexes en ce qui concerne le temps, du travail et des compétences et instruments requis4.
Récemment, les analyses axées sur le mAb immuno-enzymatique (Elisa) ont été appliquées pour analyser qualitativement et quantitativement les aliments et produits naturels. En fait, cette méthode a été appliquée pour l’analyse des échantillons biologiques et des tests cliniques et a été montrée pour être précise, sensible et hautement efficace tout en évitant aussi les étapes de prétraitement fastidieux associés à d’autres analyses5, 6.
Lors de l’utilisation de tests Elisa axée sur le mAb pour étudier les produits naturels complexes, préparation des anticorps monoclonaux est une des étapes essentielles. Malheureusement, le mAbs spécifiques aux petits composants bioactifs présents dans ces types de substances6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sont souvent limitées par rapport aux antigènes protéiques. Pour contourner ce problème, nous avons développé un protocole pour générer précisément mAbs contre petits composés. Le protocole présenté ici comprend la synthèse de l’antigène artificiel, immunisation de souris, fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte et la préparation de l’hybridome monoclonale.
Notamment, notre groupe de recherche a été étudier la formation du mAbs contre petits composés bioactifs des médecines traditionnelles chinoises et développer leurs applications pour des années. Dans nos études en cours, nous avons développé des ACM contre baicaline16, puerarin17, acide glycyrrhizique18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121et beaucoup d’autres petites molécules. Nos protocoles d’ELISA basés sur ces mAbs ont été utilisés dans un certain nombre d’études pour évaluer les propriétés pharmacocinétiques de ces petites molécules ainsi que leurs interactions avec d’autres composés bioactifs. En outre, à l’aide de ces ACM, nous avons également développé méthodes de chromatographie d’immunoaffinité pour la séparation des analogues structuraux, y compris les épimères. Récemment, nous avons préparé un immunoessai écoulement latéral à l’aide de notre mAb anti-puerarin qui a ensuite été utilisé pour la détection rapide, sur place de ce composé. Nos résultats indiquent que nos analyses mAb sont des outils indispensables et commodes pour l’étude de la biologie et la qualité de composés dérivés du naturel-produit, en particulier celles utilisées dans les médecines traditionnelles chinoises.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

L’analyse des composants bioactifs présents dans les aliments et produits naturels est devenu un quartier populaire d’étude dans de nombreux domaines, y compris traditionnelle sécurité/toxicologie chinoise médecine et de la nourriture. Plusieurs des techniques classiques d’analyse nécessitent des équipements coûteux ou des compétences. Notamment, les dosages immuno-enzymatiques (Elisa) sont devenus une méthode nouvelle pour l’analyse des aliments et des produits naturels. Cette méthode est basée sur médiée par les anticorps de détection des composants cible. Cependant, comme de nombreux éléments bioactifs dans les produits naturels sont de petite taille (< 1 000 Da) et ne pas provoquer une réponse immunitaire, la création d’anticorps monoclonaux (ACM) contre eux est souvent difficile. Dans ce protocole, nous fournir une explication détaillée des étapes requises pour générer des ACM contre les molécules cibles ainsi que celles nécessaires pour créer les associés indirects concurrentiel (ic) ELISA pour l’analyse rapide de ce composé dans des échantillons multiples. La procédure décrit la synthèse de l’antigène artificiel (c.-à-d., le conjugué de l’Haptène-carrier), fusion cellulaire, vaccination, préparation d’hybridome monoclonale, caractérisation du Lam et l’application par ELISA de la mAb. Le conjugué de l’Haptène-carrier a été synthétisé par le sodium periodate méthode et évaluées par MALDI-TOF-MS. Après l’immunisation, les splénocytes ont été isolés chez la souris immunisée avec le titre d’anticorps plus élevé et fusionné avec l’hypoxanthine-aminoptérine-thymidine (HAT) - lignée de cellules d’un myélome de souris sensibles Sp2/0 - Ag14 utilisant un polyéthylène glycol (PEG)-méthode de base. Les hybridomes sécrétant mAbs réagissant à l’antigène cible ont été criblés par icELISA de spécificité et de la réactivité croisée. En outre, la méthode de dilution limite a été appliquée pour préparer les hybridomes monoclonales. Le mAbs final ont été davantage caractérisé par icELISA et ensuite utilisé dans une application par ELISA pour la détection rapide et commode de l’Haptène exemple (naringine (NAR)) en produits naturels.

Génération des hybridomes monoclonales
Le poids moléculaire du conjugué Haptène-carrier a été confirmé par analyse de MALDI-TOF-MS. Comme le poids moléculaire de BSA et de la NAR sont connus, le nombre de petites molécules conjuguées avec BSA pourrait être calculé. La figure 1 montre les résultats spectrales représentatifs de la NAR-BSA<sup class="x...

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Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation et l’évaluation des anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels destinés à divers tests immunologiques. Cette procédure comprend l’immunisation, la fusion cellulaire, ELISA concurrent indirecte positive clone de dépistage, et la préparation de l’hybridome monoclonale. Les spécifications pour la caractérisation d’anticorps à l’aide de MALDI-TOF-MS et analyses ELISA sont également fournies.

Génération d’anticorps monoclonaux dirigés contre des produits naturels

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Les anticorps monoclonaux sont connus sous le nom d’anticorps mono-spécifiques qui sont produits à partir d’un seul clone de lymphocyte B et des anticorps monovalents qui se lient à la même épitope. Récemment, l’ELISA monocoque à base d’anticorps est devenue notre plate-forme émergente pour l’analyse qualitative ou quantitative des aliments ou des produits naturels. Cette méthode est une méthode précise, sensible et efficace sans étapes fastidieuses de prétraitement.C’est donc l’essentiel pour les échantillons biologiques et les futures applications cliniques. La préparation des MABs de TCM est une étape essentielle dans les études sur les caractéristiques complexes du système de la formule TCM. Nous avons développé un protocole pour générer des mWB contre les petits composés moléculaires, y compris la synthèse artificielle d’antigène, la vaccination de souris, et la fusion cellulaire.L’hapten est relié à la protéine porteuse pour synthétiser l’antigène artificiel. Les antigènes artificiels et les adjuvants complets sont mélangés et émulsifiés. La souris a été vaccinée par injection sous-cutanée.Sortez la rate de la souris immunisée et faites une suspension unicellule. Mélanger les cellules du myélome. Les splenocytes sont isolés et fusionnés avec la lignée cellulaire de myélome de souris HAT-sensible par la méthode PEG.Sélectionnez une lignée cellulaire capable de préparer des anticorps par ELISA. Hybridomas sécrétant des anticorps monoclonaux qui sont réactifs à l’antigène sont clonés. Établir la lignée cellulaire hybridoma est cryopréservée.La procédure périodique d’oxydation a été employée pour la synthèse d’un conjugué de BSA de narigin. Tout d’abord, le narigin a été dissous à une concentration finale d’un milligramme par millilitre à 100 microlitres de solution de pariodate de sodium fraîchement préparée à cinq millilitres de la solution narigin. Remuer le mélange à température ambiante pendant une heure.Deuxièmement, ajouter deux millilitres de protéines porteuse au mélange de réaction par période de sodium narigin. Réglez le mélange à la solution pH neuf et continuez à réagir pendant six à huit heures. Troisièmement, l’antigène artificiel a été purifié avec la méthode de dialyse dans PDS pendant trois jours pour éloigner le CBS.L’adjuvant complet et l’adjuvant incomplet de Freund ont été utilisés pour la vaccination des souris. Pour la vaccination, mélanger 50 microgrammes de conjugué avec un volume égal de l’adjuvant complet de Freund et émulsionner complètement. Administrer 100 microgrammes de ce mélange à chaque souris BALB/c par injection sous-cutanée dorsale.Livrer une vaccination de rappel par injection sous-cutanée deux semaines plus tard avec la même quantité de conjugué mélangé avec adjuvant incomplet. Pour la vaccination primaire, l’adjuvant et l’immunogène complets de Freund ont été utilisés par injection subdermique. Pour la vaccination de rappel, l’adjuvant incomplet de Freund et l’immunogène ont été utilisés par injection subdermique.Pour la vaccination à impact sans adjuvant, seul l’immunogène a été utilisé par injection subdermique ou injection intraperineal. Les cellules de couche d’alimentation provenaient principalement de cellules épithéliales abdominales ou de macrophages. RPMI 1640 FBS et HAT ont été utilisés pour préparer le support d’écran HAT.Supplément HAT a été dissous en 10 millilitres RPMI moyen, puis ajouté en 500 millilitres RPMI 1640 contenant 20%FBS. Et la souris ICR a été stérilisée par 75% d’alcool éthylique pendant cinq minutes. Après avoir enlevé la fourrure de l’abdomen avec des forceps hémostatiques, désinfecter la zone avec 75% d’éthanol.Couper la peau extérieure pour exposer la cavité abdominale. Injecter trois millilitres de RPMI stérile 1640 milieu dans l’abdomen. Puis masser l’abdomen pour détacher des cellules supplémentaires dans la solution.Aspirer la suspension des cellules fœtales dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Après avoir centrifugé la suspension cellulaire pendant 10 minutes à 1000g, jetez le supernatant et suspendez les cellules fœtales pour obtenir une suspension cellulaire unique. Après cette procédure, dissoudre les cellules en utilisant le milieu HAT.Comptez les cellules pour en faire 100 000 par millilitre de membres de la cellule. Transférer les cellules dans 96 plaques de culture cellulaire bien. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés, 5% de dioxyde de carbone.La souris vaccinée choisie a été stérilisée par 75% d’alcool éthylique pendant cinq minutes. Aspirer RPMI 1640 moyen comme tampon de lavage. Retirez la peau et le tissu musculaire à l’aide de ciseaux pour exposer la rate.Isoler soigneusement la rate par les pinces. Puis laver la rate dans le RPMI 1640. Isoler la rate et la couper en morceaux.Pilonner lentement la rate. Ensuite, il a été traité avec un milieu RMPI 1640 pour dissoudre les cellules pour préparer une suspension cellulaire de la rate. Après cela, les cellules ont été filtrées par 800 passoire à cellules mailles.Clouer la rate soigneusement pour enlever les gros tissus. Éviter les gros tissus influence la fusion des cellules. Était la suspension cellulaire de la rate avec RPMI 1640 moyen.Puis la suspension cellulaire a été ajoutée dans le tube de centrifugeuse. Récolter les cellules de la rate par centrifugation à 1000g pendant 10 minutes. Et puis jeter le supernatant.Les cellules de la rate étaient censées être d’un milliard à 10 milliards. Retirez les cellules myélomateuses cultivées et amplifiées de l’incubateur et secouez doucement le flacon pour obtenir une suspension cellulaire. A été la suspension avec RPMI deux fois.Mélanger la suspension cellulaire de la rate et les cellules du myélome. Comptez les cellules et ajustez la concentration. La ration finale des cellules de la rate vers les cellules myélomateuses devrait être de un à cinq à un à 10.Centrifuger le mélange cellulaire, puis enlever le supernatant. Ajouter un millilitre de solution de glycol de polyéthylène à 50% aux cellules et remuer doucement à 37 degrés pendant une minute. Debout pendant 30 secondes, ajouter deux millilitres de RPMI 1640 moyen et incuber à 37 degrés pendant deux minutes pour mettre fin à la réaction.Ajouter dans deux millilitres RPMI pendant une autre minute. Ensuite, ajouter en 10 millilitres RPMI 1640. Centrifugeuse à 800g pendant 10 minutes.Jeter le supernatant, ajouter la solution HAT et continuer à cultiver les cellules pendant sept jours à 37 degrés 5% de dioxyde de carbone. Après sept jours, les supernatants cellulaires dans 96 plaques de puits ont été aspirés après fusion cellulaire et ajoutés dans des plaques ELISA pré-enduites d’antigène de revêtement. Cultivé à 37 degrés pendant une heure, l’anticorps secondaire a été ajouté et cultivé pendant une demi-heure.Après avoir ajouté 100 microlitres de solution de substrat. Arrêtez la réaction. Pour les plaques ELISA dans le lecteur de microplaque, méthode de point de terminaison a été utilisé lire les données à 450 nanomètres.Absorption mesurée à 450 nanomètres et dépistage des hybridomas positifs. Utilisez la méthode de dilution limitante pour préparer les hybridomas monocolysaux. Après avoir retiré le milieu HD des hybridomas sélectionnés, suspendez les cellules de RPMI 1640 et comptez-les.Diluer les cellules d’une concentration d’une cellule, deux cellules, et quatre cellules par puits par RPMI 1640 dans une plaque de puits 96 et la culture. Transférer les cellules des hybridomas qui sont positives à 24 plaques de puits, flacons de 25 et 75 centimètres carrés pour la culture. Conserver les myodomes dans une boîte de refroidissement dégradée à moins 80 degrés pendant 24 heures.Ensuite, transférer à l’azote liquide pour le stockage à long terme. Le titer des antiserums ont été déterminés par ELISA indirect. La souris un à quatre a été vaccinée avec le conjugué narigin BSA était sensiblement plus élevé que la souris de contrôle sans immunisé.Le litre de un à 5000 est une diffusion suffisante. Le poids moléculaire du conjugué hapten a été confirmé par l’analyse MALDI-TOF. Comme indiqué dans la figure deux, comme un poids moléculaire de la norme BSA et narigin ont été connus, nous pouvons calculer et déterminer que les molécules de narigin ont été conjuguées avec BSA.Seul l’hybridoma peut survivre et se développer dans les médias de sélection HAT. Après sept jours de croissance, la culture cellulaire peut être testée par ELISA. Les hybridomas positifs ont été re-clonés et élargis.Ces images montrent les résultats conventionnels pour les lignées cellulaires monoclonales et polyclonales stables d’hybridoma. Le point critique de cette expérience est le criblage des mAbs spécifiques pour l’hapten, mais pas la protéine porteuse. La spécificité du mAb a ensuite été examinée en présence d’autres composés structurellement apparentés.La réactivité croisée a été calculée pour évaluer la spécificité de mAb à l’antigène. La courbe d’étalonnage de la naringine et la plage de revêtement ont été obtenues. Les hybridomes monoctones spécifiques à l’antigène ont été élargis et cryopréservés dans de l’azote liquide pour le stockage à long terme.Après avoir regardé cette vidéo, j’espère que vous avez une bonne compréhension de la façon de générer des anticorps monoclonaux contre un petit composé moléculaire. C’est tout. Merci pour votre observation et bonne chance pour vos expériences.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

L&#39;administration passive d&#39;anticorps monoclonaux contre H. capsulatum Et autres pathogènes fongiques

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Analyses quantitatives de tous influenza de type A hémagglutinines virales et les neuraminidases utilisant des anticorps Universal en simples essais slot blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Un test Parasite sauvetage et à la transformation pour le dépistage anti-leishmaniose contre intracellulaire<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes dans THP1 humaines ligne leucémie aiguë monocytaire cellulaire

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Génération de Recombinant Human IgG anticorps monoclonaux à partir de cellules immortalisées Classé B

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mesure de la grippe neuraminidase Inhibition Titres d&#39;anticorps par-enzymatique lectine Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

La génération d&#39;anticorps monoclonaux murins par Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Génération des variantes d’évasion de neutraliser les anticorps monoclonaux Influenza Virus

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Génération de discriminatif anticorps monoclonaux humains de cellules rares spécifiques de l’antigène B circulant dans le sang

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Liposomes antigéniques pour la production d’anticorps spécifiques à certaines maladies

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...