Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant-Nummern 81573573, 81473338 und 81503344) und dem klassischen Rezept grundlegende Forschungsteam an der Beijing Universität der chinesischen Medizin unterstützt.

Alle tierischen Verfahren durchgeführt, die in dieser Studie wurden von der ethischen Prüfungsausschuss an der Beijing University of Chinese Medicine (Genehmigung Nr. 2016BZYYL00109) genehmigt.
Hinweis: Die weiblichen BALB/c Mäuse (8 Wochen alt) wurden mit Hapten-Carrier-Protein Konjugate immunisiert. Wenn Sie allein, ein kleines Molekül (< 1.000 Da) kann keine Immunantwort hervorrufen. Jedoch Konjugation das kleine Molekül in ein Träger Makromolekül führt in Antigen-Synthese. In diese...

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	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" 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href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die erfolgreiche Produktion von mAbs gegen natürliche Produkt abgeleitet kleine Moleküle. Die wesentlichen Schritte des Verfahrens umrissen worden, und wir haben bewiesen, dass die Nützlichkeit dieses Protokoll mit NAR als ein Beispiel kleines Molekül. Die Beispiel-Spektren, Reaktivität Analysen und IcELISA Ergebnisse zeigen Vertreter experimenteller und Steuerdaten, die mit diesem Protokoll abgerufen wird. Beispielbilder von der Hybridome bieten eine visuelle Darstell...

Monoklonale Antikörper (MAK), auch bekannt als Mono-spezifische Antikörper werden aus einem einzigen zahlreiche Klon hergestellt und bestehen aus monovalenten Antikörper, dass alle an der gleichen Epitop1binden. In den letzten Jahren haben viele pflanzliche natürliche Arzneimittel bei der Behandlung von verschiedenen Krankheiten2verwendet worden. In der Tat sind viele kleine Molekülverbindungen ursprünglich abgeleitet aus Naturprodukten nun als Erstlinien Drogen wie Artemisinin für Malaria und Paciltaxel (Taxol) für Krebs2,3angewendet. Die Studie von Naturprodukten machte rasche Fortschritte, vor allem auf die enorme Entwicklung und Optimierung der herkömmlichen Analyse-Techniken, einschließlich Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) und Massenspektrometrie (MS). Allerdings gibt es noch einige Einschränkungen, die diese Methoden, wie z. B. ihre komplexen Vorbehandlung Protokolle und die damit verbundenen Kosten in Bezug auf Zeit, Arbeit/Expertisen und erforderlichen Instrumente4zugeordnet.
Vor kurzem wurden Enzym-linked Immunosorbentprobe mAb basierende Assays (Elisa) angewendet, um Lebensmittel und natürliche Produkte qualitativ und quantitativ zu analysieren. In der Tat, diese Methode beantragt worden Analyse von biologischen Proben und klinische Tests und hat gezeigt, dass genau, empfindlich und höchst effizient zu sein, während auch die Vermeidung der mühsame Vorbehandlung Schritte verknüpft mit anderen Analysen5, 6.
Wenn mAb-basierte ELISAs verwenden, um komplexe natürliche Produkte zu studieren, ist Vorbereitung von monoklonalen Antikörpern eines der Kern-Schritte. Leider der mAbs speziell für kleinen bioaktiven Komponenten in diesen Arten von Substanzen6,7,8,9,10,11,12 vorhanden ,13,14,15 sind oft begrenzt, im Vergleich zu den Protein-Antigene. Um dieses Problem zu umgehen, haben wir ein Protokoll, um speziell generieren mAbs gegen kleine Verbindungen entwickelt. Die hier vorgestellten Protokoll umfasst künstliche Antigen-Synthese, Maus Immunisierung Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung.
Vor allem unsere Forschungsgruppe die Bildung von mAbs gegen kleine bioaktiven Verbindungen, die aus der traditionellen chinesischen Medizin studiert und entwickeln ihre Anwendungen seit Jahren. In unseren laufenden Studien haben wir mAbs gegen Baicalin16, Puerarin17Glycyrrhizic Säure18, Paeoniflorin19, Ginsenoside Re20, Ginsenoside Rh121und viele andere kleine Moleküle entwickelt. Unsere ELISA-Protokolle basierend auf diese mAbs wurden in einer Reihe von Studien zur Pharmakokinetik von diesen kleinen Molekülen sowie ihre Interaktionen mit anderen bioaktiven Substanzen zu bewerten. Darüber hinaus entwickelten verwenden diese mAbs, auch Immunoaffinitäts Chromatographie Methoden zur Trennung von strukturelle Analoga, einschließlich Epimers wir. Vor kurzem haben wir eine lateral Flow Immunoassay mit unserer Anti-Puerarin mAb, die anschließend für schnelle, vor-Ort-Nachweis von dieser Verbindung verwendet wurde. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass unsere mAb basierende Assays unverzichtbar und praktische Werkzeuge sind für das Studium der Biologie und der Qualität der natürlichen Produkt abgeleitete Verbindungen, insbesondere in der traditionellen chinesischen Medizin verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
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		<tr height="19">
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generation of monoclonal antibodies against natural products

Die Analyse der bioaktiven Komponenten in Lebensmittel und Naturprodukte ist ein beliebtes Gebiet der Studie in vielen Bereichen, einschließlich der traditionellen chinesischen Medizin und Lebensmittel Sicherheit/Toxikologie geworden. Viele der klassischen Analysetechniken erfordern teure Ausrüstung und/oder Know-how. Enzym-linked Immunosorbentprobe Assays (Elisa) sind vor allem eine neue Methode für die Analyse von Lebensmitteln und natürlichen Produkten geworden. Diese Methode basiert auf Antikörper-vermittelten Erkennung von Zielkomponenten. Wie viele bioaktiven Komponenten bei Naturprodukten sind jedoch klein (< 1.000 Da) und keine Immunantwort auslösen, Erstellen von monoklonalen Antikörpern (mAbs) gegen sie ist oft schwierig. In diesem Protokoll bieten wir eine ausführliche Erläuterung der Schritte erforderlich, um mAbs gegen Zielmoleküle als auch benötigt, um die damit verbundenen indirekten wettbewerbsfähig (ic) ELISA für die schnelle Analyse der Verbindung mehrerer Proben erstellen generieren. Das Verfahren beschreibt die Synthese des künstlichen Antigens (d. h. das Hapten-Carrier-Konjugat), Immunisierung, Zellfusion, monoklonalen Hybridom-Vorbereitung, Charakterisierung der MAB und die ELISA-basierten Anwendung der MAB. Das Hapten-Carrier-Konjugat wurde durch das Natrium synthetisiert periodate Methode und von MALDI-TOF-MS ausgewertet. Nach der Immunisierung, Splenocyten wurden isoliert von der immunisierten Maus mit der höchsten Antikörpertiter und verschmolzen mit der Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (Hut) - sensible Maus Myelom Zelllinie Sp2/0 - Ag14 mit einem Polyethylenglykol (PEG)-basierte Methode. Die Hybridome sezernierenden mAbs reagiert auf das Ziel-Antigen wurden durch IcELISA für Spezifität und Kreuzreaktivität gezeigt. Darüber hinaus wurde die begrenzende Verdünnungsmethode angewandt, um monoklonale Hybridome vorzubereiten. Die endgültige mAbs waren weitere zeichnet sich durch IcELISA und dann in einem ELISA-basierten Anwendung zur schnellen und bequemen Detektion von Beispiel-Hapten (Naringin (NAR)) in natürlichen Produkten genutzt.

Generierung von monoklonalen Hybridomen
Das Molekulargewicht des Konjugats Hapten-Carrier wurde durch MALDI-TOF-MS-Analyse bestätigt. Da das Molekulargewicht des BSA und NAR bekannt sind, konnte die Anzahl von kleinen Molekülen mit BSA konjugierten berechnet werden. Abbildung 1 zeigt repräsentative spektrale Ergebnisse für NAR-BSA22, di...

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Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung und Auswertung von monoklonalen Antikörpern gegen natürliche Produkte für den Einsatz in verschiedenen Immunoassays. Dieses Verfahren beinhaltet Immunisierung, Zellfusion, indirekte wettbewerbsfähige ELISA positiven Klon screening und monoklonalen Hybridom-Vorbereitung. Die Spezifikationen für Antikörper Charakterisierung mittels MALDI-TOF-MS und ELISA Analysen sind ebenfalls vorhanden.

Generierung von monoklonalen Antikörpern gegen Naturprodukte

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonale Antikörper werden als monospezifische Antikörper bezeichnet, die aus einem einzigen B-Lymphozytenklon und den monovalenten Antikörpern hergestellt werden, die an dasselbe Epiton binden. In jüngster Zeit hat sich der monoklonale Antikörper-basierte ELISA zu unserer neuen Plattform für die qualitative oder quantitative Analyse von Lebensmitteln oder Naturprodukten entwickelt. Diese Methode ist eine genaue, empfindliche und effektive Methode ohne mühsame Vorbehandlungsschritte.Das ist also das Wesentliche für biologische Proben und die zukünftigen klinischen Anwendungen. Die Vorbereitung der mABs von TCM ist ein wichtiger Schritt in Studien über komplexe Systemeigenschaften der TCM-Formel. Wir haben ein Protokoll entwickelt, um mABs gegen die kleinen molekularen Verbindungen zu erzeugen, einschließlich künstlicher Antigensynthese, Mausimmunisierung und Zellfusion.Das Hapten ist mit dem Trägerprotein verbunden, um das künstliche Antigen zu synthetisieren. Künstliches Antigen und vollständige Hilfsstoffe werden gemischt und emulgiert. Die Maus wurde durch subkutane Injektion immunisiert.Nehmen Sie die Milz der immunisierten Maus heraus und machen Sie einzellige Suspension. Mischen Sie die Myelomzellen. Splenozyten werden isoliert und mit HAT-empfindlichen Mausmyelom-Zelllinien nach PEG-Methode verschmolzen.Wählen Sie eine Zelllinie aus, die Antikörper per ELISA vorbereiten kann. Hybridome, die monoklonale Antikörper absondern, die gegen Antigen reaktiv sind, werden geklont. Stellen Sie fest, dass die Hybridom-Zelllinie kryokonserviert ist.Periodatoxidationsverfahren wurde für die Synthese eines Narigin-BSA-Konjugats verwendet. Zunächst wurde Narigin in einer Endkonzentration von einem Milligramm pro Milliliter bei 100 Mikroliter frisch zubereiteter Natriumpariodate-Lösung auf fünf Milliliter der Nariginlösung aufgelöst. Rühren Sie die Mischung bei Raumtemperatur für eine Stunde.Zweitens, fügen Sie zwei Milliliter Trägerprotein in das Narigin Natriumperiodat-Reaktionsgemisch. Passen Sie die Mischung auf pH-Neun-Lösung an und reagieren Sie sechs bis acht Stunden lang. Drittens wurde das künstliche Antigen mit Dialysemethode in PDS für drei Tage gereinigt, um den CBS zu entfremden.Freunds vollständiges adjuvantes und unvollständiges Adjuvans wurden zur Mausimpfung verwendet. Für die Impfung 50 Mikrogramm Konjugat mit einem gleichen Volumen von Freunds komplettem Adjuvans mischen und vollständig emulgieren. Verwalten Sie 100 Mikrogramm dieser Mischung zu jeder BALB/c Maus über eine dorsale subkutane Injektion.Liefern Sie eine Booster-Impfung durch subkutane Injektion zwei Wochen später mit der gleichen Menge an Konjugat mit unvollständigem Adjuvans gemischt. Zur primären Immunisierung wurden Freunds komplettes Adjuvans und Immunogen mittels subdermaler Injektion eingesetzt. Zur Booster-Impfung wurden Freunds unvollständiges Adjuvans und das Immunogen mittels subdermaler Injektion eingesetzt.Zur Wirkungsimpfung ohne Adjuvans wurden nur Immungen mittels subdermaler Injektion oder intraperinealer Injektion verwendet. Futterschichtzellen stammen hauptsächlich aus abdominalen Epithelzellen oder Makrophagen. RPMI 1640 FBS und HAT wurden zur Vorbereitung von HAT-Bildschirmmedium verwendet.HAT Ergänzung wurde in 10 Milliliter RPMI Medium aufgelöst, dann in 500 Milliliter RPMI 1640 mit 20%FBS hinzugefügt. Und die ICR-Maus wurde fünf Minuten lang mit 75% Ethylalkohol sterilisiert. Nach dem Entfernen des Fells aus dem Bauch mit hämostatischen Zangen, desinfizieren Sie den Bereich mit 75%Ethanol.Schneiden Sie die äußere Haut, um die Bauchhöhle freizulegen. Injizieren Sie drei Milliliter steriles RPMI 1640 Medium in den Bauch. Dann massieren Sie den Bauch, um zusätzliche Zellen in die Lösung zu lösen.Aspirieren Sie die fetale Zellsuspension in ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr. Nach zentrifugieren Sie die Zellsuspension für 10 Minuten bei 1.000g, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die fetalen Zellen, um eine einzellige Suspension zu erhalten. Nach diesem Verfahren lösen Sie die Zellen mit HAT-Medium auf.Zählen Sie die Zellen, um sie 100.000 Pro Milliliter aus Zellmitgliedern zu machen. Übertragen Sie die Zellen in 96 Brunnenzellkulturplatten. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad, 5% Kohlendioxid.Die gewählte immunisierte Maus wurde fünf Minuten lang mit 75% Ethylalkohol sterilisiert. Aspirieren RPMI 1640 medium als Waschpuffer. Entfernen Sie die Haut und das Muskelgewebe mit einer Schere, um die Milz freizulegen.Isolieren Sie die Milz durch die Pinzette sorgfältig. Dann waschen Sie die Milz im RPMI 1640. Die Milz isolieren und in Stücke schneiden.Langsam hämmern die Milz. Dann wurde es mit einem RMPI 1640 Medium behandelt, um die Zellen aufzulösen, um eine Milzzellsuspension vorzubereiten. Danach wurden die Zellen mit 800 Netzzellensieb gefiltert.Nageln Sie die Milz sorgfältig, um die großen Gewebe zu entfernen. Die Vermeidung großer Gewebe beeinflusst die Zellfusion. War die Milzzellensuspension mit RPMI 1640 medium.Anschließend wurde die Zellsuspension in das Zentrifugenrohr eingebracht. Ernten Sie die Milzzellen durch Zentrifugation bei 1 000g für 10 Minuten. Und dann den Überstand entsorgen.Die Milzzellen sollten eine Milliarde bis 10 Milliarden betragen. Entfernen Sie die kultivierten und verstärkten Myelomzellen aus dem Inkubator und schütteln Sie den Kolben vorsichtig, um eine Zellsuspension zu erhalten. War die Federung mit RPMI zweimal.Mischen Sie die Milzzellsuspension und die Myelomzellen. Zählen Sie die Zellen und passen Sie die Konzentration an. Die endgültige Ration der Milzzellen zu Myelomzellen sollte ein bis fünf bis eins bis zehn sein.Zentrifugieren Sie die Zellmischung und entfernen Sie dann den Überstand. Fügen Sie den Zellen einen Milliliter 50% Polyethylenglykollösung hinzu und rühren Sie sie vorsichtig bei 37 Grad für eine Minute. Stehen für 30 Sekunden, fügen Sie zwei Milliliter RPMI 1640 Medium und inkubieren bei 37 Grad für zwei Minuten, um die Reaktion zu beenden.Fügen Sie in zwei Milliliter RPMI für eine weitere Minute. Fügen Sie dann in 10 Milliliter RPMI 1640. Zentrifuge bei 800g für 10 Minuten.Entsorgen Sie den Überstand, fügen Sie HAT-Lösung hinzu und kultivieren Sie die Zellen sieben Tage lang bei 37 Grad 5%Kohlendioxid. Nach sieben Tagen wurden Zellüberstandstoffe in 96 Brunnenplatten nach der Zellfusion angesaugt und in ELISA-Platten vorbeschichtet mit Beschichtungsantigen gegeben. Eine Stunde lang bei 37 Grad kultiviert, wurde ein sekundärer Antikörper zugesetzt und eine halbe Stunde lang kultiviert.Nach 100 Mikroliter Substratlösung hinzufügen. Stoppen Sie die Reaktion. Um die ELISA-Platten in den Mikroplattenleser zu bringen, wurde die Endpunktmethode verwendet, um die Daten mit 450 Nanometern zu lesen.Gemessene Absorption bei 450 Nanometer und Schirmen der positiven Hybridome. Verwenden Sie die Begrenzende Verdünnungsmethode, um die monoklonalen Hybridome vorzubereiten. Nachdem Sie das Huntington-Medium aus den ausgewählten Hybridomen entfernt haben, setzen Sie die Zellen in RPMI 1640 erneut aus und zählen Sie sie.Verdünnen Sie die Zellen einer Konzentration von einer Zelle, zwei Zellen und vier Zellen pro Brunnen mit RPMI 1640 in einer 96-Well-Platte und -Kultur. Übertragen Sie Zellen aus den Hybridomen, die positiv sind, auf 24 Brunnenplatten, 25 und 75 Quadratzentimeter Kolben für den Anbau. Bewahren Sie die Myodomas 24 Stunden lang in einer Gradientenkühlbox bei minus 80 Grad auf.Dann in flüssigen Stickstoff zur Langzeitlagerung übertragen. Titer von Antiseren wurden durch indirekte ELISA bestimmt. Maus eins bis vier wurde mit Narigin BSA-Konjugat immunisiert war deutlich höher als die Steuermaus ohne geimpft.Der Titer von eins bis 5 000 ist ausreichend Diffusion. Das Molekulargewicht des Haptenkonjugats wurde durch die MALDI-TOF-Analyse bestätigt. Wie in Abbildung 2 dargestellt, können wir als Molekulargewicht von BSA-Standard und Narigin berechnen und bestimmen, dass die Moleküle von Narigin mit BSA konjugiert wurden.Nur das Hybridom kann in HAT-Auswahlmedien überleben und wachsen. Nach sieben Tagen Wachstum kann die Zellkultur per ELISA getestet werden. Die positiven Hybridome wurden neu geklont und erweitert.Diese Bilder zeigen das herkömmliche Ergebnis für stabile monoklonale und polyklonale Hybridom-Zelllinien. Der kritische Punkt dieses Experiments ist das Screening der mAbs spezifisch für das Hapten-, aber nicht trägerprotein. Die Spezifität des mAb wurde dann in Gegenwart anderer strukturell verwandter Verbindungen untersucht.Die Kreuzreaktivität wurde berechnet, um die mAb-Spezifität des Antigens zu bewerten. Die Kalibrierkurve von Naringin und der Liner-Bereich wurden ermittelt. Die antigenspezifischen monoklonalen Hybridome wurden erweitert und in flüssigem Stickstoff für die Langzeitlagerung kryokonserviert.Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, hoffe ich, dass Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man monoklonale Antikörper gegen kleine molekulare Verbindungen erzeugt. Das ist also alles. Vielen Dank für Ihre Beobachtung und viel Glück für Ihre Experimente.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Verwaltung von monoklonalen Antikörpern gegen H. capsulatum Ua Pilzpathogene

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Quantitative Analysen aller Influenza Typ A Viral Hämagglutininen und Neuraminidasen mit Universal Antikörper in Einfache Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay auf leishmanientötende Screening gegen intrazelluläre<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigoten in THP1 Menschliche Akute Monozytenleukämie Cell Line

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandlung von Thrombozyten Produkte mit Riboflavin und UV-Licht: Wirksamkeit gegen bakterielle Kontamination mit hohem Titer

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Messung von Influenza-Neuraminidase Inhibition Antikörpertiter durch Enzyme-Linked-Lectin-Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridomtechnologie

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation von diskriminierendem menschlichen monoklonalen Antikörpern aus seltenen Antigen-spezifische B-Zellen im Blut zirkulierenden

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigenen Liposomen für Generation krankheitsspezifische Antikörper

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...