Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי את נבחרת מדעי הטבע קרן סין (גרנט מספרים 81573573, 81473338 ו- 81503344), קלאסית מרשם בסיסי צוות המחקר באוניברסיטת בייג'ינג ברפואה הסינית.

כל ההליכים בבעלי חיים שבוצעה במחקר זה אושרו על ידי ועדת ביקורת אתית באוניברסיטת בייג'ינג לרפואה סינית (אישור מספר 2016BZYYL00109).
הערה: עכברים BALB הנשי/c (בן 8 שבועות) היו חיסון עם מנשא הפטן חלבון conjugates. כאשר נעשה שימוש לבד, מולקולה קטנה (< 1,000 Da) לא יכול להפיק תגובה חיסונית. עם זאת, conjugatin...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מוצלחת של mAbs נגד מולקולות קטנות נגזר מוצר טבעי. השלבים החיוניים במסגרת ההליך יש כבר המתוארים, הראו את התועלת של פרוטוקול זה באמצעות נאר כמו מולקולה קטנה דוגמה. דוגמה ספקטרה, תגובתיות ניתוחים ותוצאות icELISA שלהציג את כל נציג ניסיוני ונתונים שליטה שהושגו באמצעו?...

נוגדנים חד-שבטיים (mAbs), הידוע גם בשם נוגדנים ספציפיים מונו, מיוצרים שיבוט B-lymphocyte יחיד, המורכבת של נוגדנים monovalent כל לאגד epitope אותה1. בשנים האחרונות, מרפא הצמחי הטבעי מוצרים רבים שימשו לטיפול במחלות שונות2. ואכן, רבים תרכובות מולקולריות קטנות נגזר במקור מוצרים טבעיים המוחלות כעת כמו תרופות שורה ראשונה, כגון ארטמיסינין עבור מלריה ו- paciltaxel (טקסול) עבור סרטן2,3. המחקר של מוצרים טבעיים עשה התקדמות מהירה, בעיקר בשל פיתוח אדירה, אופטימיזציה של טכניקות ניתוח קונבנציונלי, כולל ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) וספקטרומטר מסה (MS). עם זאת, יש עדיין כמה מגבלות הקשורות בשיטות אלה, כגון פרוטוקולים pretreatment מורכבים שלהם ואת עלויות לגבי זמן העבודה/מומחיות, כלים נדרשים4.
לאחרונה, מבחני מבוססי mAb מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) הוחלו לנתח איכותית, באופן כמותי מזון ומוצרים טבעיים. למעשה, שיטה זו הוחל עבור ניתוח דגימות ביולוגיות והן ניסויים קליניים, הוכח להיות מדויק, רגיש ויעיל מאוד תוך הימנעות גם את השלבים pretreatment מייגע המשויך ניתוחים אחרים5, 6.
בעת שימוש ELISAs מבוססי mAb ללמוד מורכבים מוצרים טבעיים, הכנת נוגדנים חד-שבטיים הוא אחד הצעדים הליבה. למרבה הצער, mAbs מסוימים ברכיבים ביו קטן נוכח סוגים אלה של חומרים6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 מוגבלים לעיתים קרובות לעומת חלבון אנטיגנים. כדי לעקוף בעיה זו, פיתחנו פרוטוקול ליצירת mAbs נגד תרכובות קטן במיוחד. פרוטוקול המוצג כאן כולל סינתזה מלאכותית אנטיגן, חיסון עכבר, פיוז'ן תא, עקיף ELISA תחרותי ליפידים monoclonal הכנה.
ראוי לציין, קבוצת המחקר שלנו יש כבר לומד היווצרות של mAbs נגד תרכובות ביו קטנה של תרופות סיניות מסורתיות, פיתוח היישומים שלהם במשך שנים. במחקרים שלנו מתמשך, פיתחנו mAbs נגד baicalin16, puerarin17,18, חומצה glycyrrhizic, paeoniflorin19, Re ginsenoside20, ginsenoside Rh121, הרבה מולקולות קטנות אחרות. פרוטוקולים אליסה שלנו המבוססת על mAbs אלה שימשו מספר מחקרים כדי להעריך את פרמקוקינטיקה של מולקולות קטנות אלה, כמו גם הגומלין שלהם עם אחרים תרכובות ביו. יתר על כן, באמצעות mAbs האלה, גם פותחו שיטות כרומטוגרפיה immunoaffinity ההפרדה של מבנים מקבילים, כולל epimers. לאחרונה, הכנו של ראגנטים לרוחב זרימה באמצעות שלנו mAb anti-puerarin ששימש לאחר מכן לצורך זיהוי מהיר, באתר של מתחם זה. התוצאות שלנו מציינים כי מבחני מבוססי mAb שלנו הם כלי חיוני, נוח ללמוד את הביולוגיה ואיכות טבעי-מוצר-derived תרכובות, במיוחד אלה בשימוש תרופות סיניות מסורתיות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

הניתוח של הרכיבים ביואקטיביות נוכח מזונות ומוצרים טבעיים הפך אזור פופולרי של המחקר בתחומים רבים, לרבות מסורתית סינית רפואה ומזון בטיחות/רעלים. רבים של טכניקות ניתוח קלאסי דורשים ציוד יקר ו/או התמחות. ראוי לציין, מבחני מקושרים-אנזים immunosorbent (ELISAs) הפכו שיטה המתעוררים לניתוח של מזונות ומוצרים טבעיים. שיטה זו מבוססת על זיהוי בתיווך נוגדנים של רכיבי היעד. עם זאת, רבים רכיבים ביו-אקטיביים במוצרים טבעיים הם קטנים (< 1,000 Da), אל תגרום / תגובה חיסונית, יצירת נוגדנים חד-שבטיים (mAbs) נגדם הוא לעתים קרובות קשה. ב פרוטוקול זה, אנו מספקים הסבר מפורט של כל השלבים הדרושים להפקת mAbs נגד היעד מולקולות, כמו גם אלה צריך ליצור את המשויך עקיף תחרותי (ic) אליסה לניתוח מהיר של המתחם בדגימות מרובות. ההליך מתאר את סינתזה של אנטיגן מלאכותיים (קרי, המספר המשלים הפטן-המוביל), חיסונים, פיוז'ן תא, ליפידים monoclonal הכנה, אפיון mAb ולאחר יישום מבוסס-אליסה של mAb. המספר המשלים הפטן-המוביל היה מסונתז על ידי הנתרן periodate שיטת ומוערכת על ידי MALDI-תוף-MS. לאחר חיסון, splenocytes הם בודדו אותנו מהמתרחש העכבר immunized עם כייל נוגדנים הגבוהה, התמזגו עם Ag14 (כובע) - העכבר רגיש מיאלומה תא קו Sp2/0 - hypoxanthine-aminopterin-תימידין באמצעות של פוליאתילן גליקול (PEG)-המבוסס על שיטה. Hybridomas הפרשת mAbs תגובתי ל אנטיגן מטרה הוקרנו על-ידי icELISA ירידה לפרטים, אשיג. יתר על כן, שיטת הדילול המגביל הונחה להכין monoclonal hybridomas. MAbs הסופית היו עוד יותר מאופיין icELISA, ואז מנוצל יישום המבוסס על אליסה איתור מהיר ונוח הפטן דוגמה (naringin (NAR)) במוצרים טבעיים.

דור של monoclonal hybridomas
המשקל המולקולרי של המספר המשלים הפטן-המוביל אושר ע י ניתוח MALDI-תוף-MS. כמו המשקל המולקולרי של BSA והן את קריין ידועים, יכול לחשב את מספר מולקולות קטנות מצומדת עם BSA. איור 1 מציג תוצאות ספקט?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

מאמר זה מספק נוהל מפורט על ההכנה ועל הערכה של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים לשימוש immunoassays שונים. הליך זה כולל חיסונים, תא היתוך, עקיף ELISA תחרותי שיבוט חיובי ההקרנה, ליפידים monoclonal הכנה. המפרט עבור אפיון נוגדנים באמצעות MALDI-תוף-MS וניתוחים אליסה הינם גם מסופקים.

דור של נוגדנים חד-שבטיים כנגד מוצרים טבעיים

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

נוגדנים חד שבטיים ידועים כנוגדנים חד-ספציפיים המופקים משבט B-לימפוציטים יחיד ומהנוגדנים המונו-וואלנטיים שנקשרים לאותה אפיטופ. לאחרונה, ELISA מבוסס נוגדנים חד שבטי הפך לפלטפורמה המתעוררת שלנו לניתוח איכותי או כמותי של מזונות או מוצרים טבעיים. שיטה זו היא שיטה מדויקת, רגישה ויעילה ללא שלבי טיפול מקדים מייגעים.אז זה חיוני עבור דגימות ביולוגיות ואת היישומים הקליניים בעתיד. הכנת mABs של TCM הוא צעד חיוני במחקרים על מאפייני מערכת מורכבים של נוסחת TCM. פיתחנו פרוטוקול ליצירת MABs נגד תרכובות מולקולריות קטנות, כולל סינתזת אנטיגן מלאכותית, חיסון עכברים והיתוך תאים.ההאפטן מחובר לחלבון המוביל לסנתז את האנטיגן המלאכותי. אנטיגן מלאכותי ודג'ובנטים שלמים מעורבבים ומונעים. העכבר היה מחוסן על ידי זריקה תת עורית.מוציאים את הטחול של עכבר מחוסן ולעשות השעיה חד-תאית. מערבבים את תאי המיאלומה. Splenocytes מבודדים ומותכים עם קו התא מיאלומה עכבר רגיש כובע על ידי שיטת PEG.בחר קו תא מסוגל להכין נוגדנים על ידי ELISA. כלאיים מפרישים נוגדנים חד שבטיים שמגיבים לאנטיגן משובפלים. להקים את קו התא היברידית הוא cryopreserved.הליך חמצון תקופתי שימש לסינתזה של קיסם BSA נריגין. ראשית, נריגין היה מומס בריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר ב 100 microliters של פתרון פרוידאט נתרן מוכן טרי לחמישה מיליליטר של פתרון נריגין. מערבבים את התערובת בטמפרטורת החדר במשך שעה.שנית, מוסיפים שני מיליליטר של חלבון נושא לתערובת התגובה הנריגין נתרן תקופתי. התאימו את התערובת לתסרון pH 9 והמשיכו להגיב במשך שש עד שמונה שעות. שלישית, האנטיגן המלאכותי טוהר בשיטת הדיאליזה ב-PDS במשך שלושה ימים כדי לטהר את הלמ"ס.התותב המלא של פרוינד והתודעה המלאה של פרוינד שימשו לחיסון עכברים. לחיסון, מערבבים 50 מיקרוגרם של תמיר עם נפח שווה של התת-תותבת המלאה של פרוינד ומערבבים לחלוטין. ניהול 100 מיקרוגרם של תערובת זו לכל עכבר BALB / c באמצעות הזרקה תת עורית הגבית.לספק חיסון המאיץ באמצעות הזרקה תת עורית שבועיים לאחר מכן עם אותה כמות של קוסם מעורבב עם תריס שלם. עבור חיסון ראשוני, התותב המלא של פרוינד ואימונוגן שימשו באמצעות הזרקה תת עורית. עבור חיסון המאיץ, התת-עורי של פרוינד והאימונוגן שימשו באמצעות הזרקה תת-עורית.עבור חיסון השפעה ללא אנדרג'ובנט, רק אימונוגן שימשו באמצעות הזרקה תת עורית או הזרקה תוך-אנדראינאלית. תאי שכבת הזנה מקורם בעיקר בתאי אפיתל בטן או מקרופאג'. RPMI 1640 FBS ו- HAT שימשו להכנת מדיום מסך HAT.תוסף HAT הומס ב 10 מיליליטר RPMI בינוני, ולאחר מכן הוסיף לתוך 500 מיליליטר RPMI 1640 המכיל 20%FBS. ועכבר ICR היה מעוקר על ידי 75% אלכוהול אתיל במשך חמש דקות. לאחר הסרת הפרווה מהבטן עם מדפים המוסטטיים, לחטא את האזור עם 75% אתנול.חותכים את העור החיצוני כדי לחשוף את חלל הבטן. להזריק שלושה מיליליטר של RPMI סטרילי 1640 בינוני לתוך הבטן. לאחר מכן לעסות את הבטן כדי לנתק תאים נוספים לתוך הפתרון.שאף את ההשעיה של התא העוברי לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה ההשעיה התא במשך 10 דקות ב 1, 000g, להשליך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים העובריים כדי לקבל השעיה תא יחיד. לאחר הליך זה, ממיסים את התאים באמצעות HAT medium.לספור את התאים כדי להפוך אותו 100, 000 למיליליטר מחברי התא. העבר את התאים לתוך 96 צלחות תרבות התא היטב. דגירה הצלחות לילה ב 37 מעלות, 5% פחמן דו חמצני.העכבר החיסון שנבחר היה מעוקר על ידי 75% אלכוהול אתיל במשך חמש דקות. אספירט RPMI 1640 בינוני כמו מאגר הכביסה. הסר את רקמת העור והשרירים באמצעות מספריים כדי לחשוף את הטחול.לבודד את הטחול על ידי פינצטה בזהירות. לאחר מכן לשטוף את הטחול ב RPMI 1640. לבודד את הטחול לחתוך לחתיכות.לאט לאט הלם בטח הטחול. לאחר מכן הוא טופל עם מדיום RMPI 1640 כדי להמיס את התאים כדי להכין השעיית תא טחול. לאחר מכן, התאים היו מסוננים על ידי 800 מסננת תא רשת.מסמר את הטחול בזהירות כדי להסיר את הרקמות הגדולות. הימנעות רקמות גדולות להשפיע על היתוך של תאים. היה ההשעיה תא הטחול עם RPMI 1640 בינוני.ואז ההשעיה התאית נוספה לצינור הצנטריפוגה. לקצור את תאי הטחול על ידי צנטריפוגה ב 1, 000g במשך 10 דקות. ואז להשליך את העל-טבעי.תאי הטחול היו אמורים להיות בסכום של מיליארד עד 10 מיליארד. מוציאים את תאי המיאלומה המעובדים והמגברים מהאינקובטור ומנערים בעדינות את הבקבוק כדי להשיג השעיית תא. היה ההשעיה עם RPMI פעמיים.מערבבים את ההשעיה של תאי הטחול ואת תאי המיאלומה. לספור את התאים ולהתאים את הריכוז. ההקצבה הסופית של תאי טחול לתאי מיאלומה צריכה להיות אחת עד חמש עד אחת עד 10.צנטריפוגה תערובת התא ולאחר מכן להסיר את על טבעי. מוסיפים מיליליטר אחד של תוסף פוליאתילן גליקול של 50% לתאים ומערבבים בעדינות ב-37 מעלות למשך דקה אחת. עומד במשך 30 שניות, להוסיף שני מיליליטר של RPMI 1640 בינוני דגירה ב 37 מעלות במשך שתי דקות כדי לסיים את התגובה.מוסיפים לשני מיליליטר RPMI לעוד דקה אחת. לאחר מכן, להוסיף לתוך 10 מיליליטר RPMI 1640. צנטריפוגה ב 800g במשך 10 דקות.משליכים את העל-טבעי, מוסיפים תטבת HAT וממשיכים לטפח את התאים במשך שבעה ימים ב-37 מעלות 5%פחמן דו-חמצני. לאחר שבעה ימים, על-טבעיים של התאים ב-96 צלחות בארות שאפו לאחר היתוך התאים והתווספו לצלחות ELISA מצופות מראש באנטיגן ציפוי. מעובד ב 37 מעלות במשך שעה אחת, נוגדן משני נוסף ומעובד במשך חצי שעה.לאחר הוספת 100 מיקרוליטרים של פתרון מצע. תפסיק את התגובה. כדי לוחות ELISA לתוך קורא מיקרופלסטיק, שיטת נקודת הקצה שימש לקרוא את הנתונים ב 450 ננומטר.ספיגה נמדדת ב 450 ננומטר ולסנן את היברידיות חיוביות. השתמש בשיטת הדילול המגבילה כדי להכין את ההיברידיות המונוקלונאליות. לאחר הסרת מדיום HD מההיברידיות שנבחרו, השהה מחדש את התאים ב- RPMI 1640 וספיר אותם.לדלל את התאים של ריכוז של תא אחד, שני תאים, וארבעה תאים ל הבאר על ידי RPMI 1640 ב 96 גם צלחת ותרבות. העבר תאים מן hybridomas כי הם חיוביים 24 צלחות גם, 25 ו 75 flasks סנטימטר מרובע לטיפוח. לאחסן את myodomas בתיבת קירור הדרגתית במינוס 80 מעלות במשך 24 שעות.לאחר מכן מעבירים לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. טיטר של אנטישמיות נקבעו על ידי ELISA עקיף. עכבר אחד עד ארבעה היה מחוסן עם נריגין BSA משותף היה גבוה באופן משמעותי מאשר עכבר הבקרה ללא חיסון.הטיטר של 1 עד 5, 000 הוא דיפוזיה. המשקל המולקולרי של ההאפטן תותב אושר על ידי ניתוח MALDI-TOF. כפי שמוצג איור 2, כמשקל מולקולרי של תקן BSA ונריגין ידועים, אנו יכולים לחשב ולקבוע כי המולקולות של נריגין היו משותף עם BSA.רק ההיברידית יכולה לשרוד ולצמוח במדיה לבחירת HAT. לאחר שבעה ימים של צמיחה, תרבות התאים יכולה להיבדק על ידי ELISA. ההיברידיות החיוביות שכפלו והתרחבו מחדש.תמונות אלה מראות את התוצאה הקונבנציונלית עבור קווי תאים היברידיים חד-תאיים ופוליקלונליים יציבים. הנקודה הקריטית של ניסוי זה היא סינון mAbs ספציפי עבור hapten, אבל לא חלבון נושא. הספציפיות של mAb נבדקו אז בנוכחות תרכובות אחרות הקשורות מבנית.תגובתיות הצלב חושבה כדי להעריך את הספציפיות mAb לאנטיגן. עקומת הכיול של קרינגין וטווח אניה הושגו. ההיברידיות המונוקלונאליות הספציפיות לאנטיגן הורחבו והוקפאו בחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך.לאחר צפייה בסרטון זה, אני מקווה שיש לך הבנה טובה כיצד ליצור נוגדנים חד שבטיים נגד תרכובות מולקולריות קטנות. אז זה הכל. תודה על הצפייה שלך ובהצלחה על הניסויים שלך.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

מינהל פסיבי של נוגדנים חד שבטיים נגד ח capsulatum ואחרים פתוגנים פטרייתיים

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Assay הצלה וטרנספורמציה טפילה להקרנת Antileishmanial נגד תאי<em&gt; ישמניה donovani</em&gt; Amastigotes בקו THP1 אדם חריף Monocytic וקמיה של תאים

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

טיפול במוצרי טסיות דם עם ריבופלבין ואור UV: יעילות גבוהה נגד כייל קטריאלי זיהום

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

דור של רקומביננטי אדם IgG נוגדנים חד שבטיים מתאים הממוינים B הונצחו

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

מדידת טיטר נוגדנים עיכוב Neuraminidase שפעת ידי enzyme-linked Assay לקטינים

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

הדור של Murine חד-שבטיים נוגדנים על ידי Hybridoma טכנולוגיה

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

דור של בריחה וריאציות של נטרול נוגדנים חד-שבטיים של וירוס שפעת

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

דור שמסווגת נוגדנים חד-שבטיים אנושי מתאי B אנטיגן ספציפי נדיר במחזור הדם

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

ליפוזומים antigenic לדור של נוגדנים מחלות ספציפיות

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...