Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Questo lavoro è stato supportato da National Natural Science Foundation of China (sovvenzione numeri 81573573, 81473338 e 81503344) e il classico Team di ricerca base prescrizione presso l'Università di Pechino di medicina cinese.

Tutte le procedure animale effettuate in questo studio sono state approvate dal comitato di revisione etica presso l'Università di Pechino di medicina cinese (approvazione numero 2016BZYYL00109).
Nota: Topi BALB/c femmina (8 settimane) sono stati immunizzati con aptene-carrier proteico coniugati. Quando usato da solo, una piccola molecola (< Da 1.000) non può suscitare una risposta immunitaria. Tuttavia, coniugando la piccola molecola un risultati di macromolecola di vettore in sintesi di an...

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	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. 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G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Qui, presentiamo un protocollo per il successo della produzione di anticorpi monoclonali contro naturale prodotto derivato di piccole molecole. I passi essenziali nella procedura sono stati delineati, e abbiamo dimostrato l'utilità di questo protocollo utilizzando NAR come una piccola molecola di esempio. Gli spettri di esempio, analisi di reattività e icELISA risultati tutti mostrano rappresentante sperimentale e dati di controllo che viene ottenuti utilizzando questo protocollo. Immagini di esempio degli ibridomi for...

Gli anticorpi monoclonali (mAbs), noto anche come anticorpi mono-specifici, sono prodotte da un singolo clone di linfocita b e sono composti da monovalenti anticorpi che si legano al stesso epitopo1. Negli ultimi anni, molti prodotti medicinali vegetali naturali sono stati utilizzati nel trattamento di varie malattie2. Infatti, molti piccoli composti molecolari originariamente derivati da prodotti naturali vengono ora applicate come farmaci di prima linea, come ad esempio artemisinina per malaria e paciltaxel (taxolo) per cancro2,3. Lo studio di prodotti naturali ha fatto rapidi progressi, in gran parte dovuto l'enorme sviluppo e l'ottimizzazione delle tecniche di analisi convenzionali, tra cui la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC) e spettrometria di massa (MS). Tuttavia, ci sono ancora alcune limitazioni connesse con questi metodi, quali i loro complessi protocolli pretrattamento e costi associati per quanto riguarda il tempo, manodopera/competenze e strumenti necessari4.
Recentemente, sono stati applicati i saggi basati su mAb enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) analizzare qualitativamente e quantitativamente il cibo e prodotti naturali. In realtà, questo metodo è stato applicato per analisi di campioni biologici e per la sperimentazione clinica e ha dimostrato di essere accurati, sensibili e altamente efficiente, evitando anche le fasi di pretrattamento noiose connesse con altre analisi5, 6.
Quando si utilizza basato su mAb ELISAs per studiare prodotti naturali complessi, preparazione degli anticorpi monoclonali è uno dei passi fondamentali. Purtroppo, i mAbs specifici per i piccoli componenti bioattivi presenti in questi tipi di sostanze6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 sono spesso limitati rispetto agli antigeni della proteina. Per ovviare a questo problema, abbiamo sviluppato un protocollo per generare specificamente mAbs contro piccoli composti. Il protocollo presentato qui include sintesi artificiale dell'antigene, mouse immunizzazione, fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto e preparazione di ibridoma monoclonale.
In particolare, il nostro gruppo di ricerca ha studiato la formazione di anticorpi monoclonali contro piccoli composti bioattivi da medicine cinesi tradizionali e sviluppare le proprie applicazioni per anni. Nei nostri studi in corso, abbiamo sviluppato anticorpi monoclonali contro baicalin16, puerarin17, acido glicirrizico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e molte altre piccole molecole. I nostri protocolli di ELISA basati su questi anticorpi monoclonali sono stati utilizzati in una serie di studi per valutare la farmacocinetica di queste piccole molecole, come pure le loro interazioni con altri composti bioattivi. Inoltre, usando questi mAbs, abbiamo anche sviluppato metodi di cromatografia di immunoaffinità per la separazione di analoghi strutturali, inclusi epimers. Recentemente, abbiamo preparato un immunoassay di flusso laterale utilizzando il nostro mAb anti-puerarin che è stato successivamente utilizzato per il rilevamento rapido, in loco di questo composto. I nostri risultati indicano che la nostra analisi di mAb-based sono strumenti indispensabili e conveniente per studiare la biologia e la qualità dei composti naturali-prodotto-derivati, in particolare quelli utilizzati nelle medicine cinesi tradizionali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

L'analisi dei componenti bioattivi presenti negli alimenti e prodotti naturali è diventata una popolare area di studio in molti campi, compreso il tradizionale cinese medicina e cibo sicurezza/tossicologia. Molte delle tecniche di analisi classica richiedono attrezzature costose e/o competenze. In particolare, le analisi enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) sono diventati un metodo emergente per l'analisi di alimenti e prodotti naturali. Questo metodo si basa sulla rilevazione dell'anticorpo-mediata dei componenti di destinazione. Tuttavia, come molti dei componenti bioattivi in prodotti naturali sono piccole (< Da 1.000) e non indurre una risposta immunitaria, creazione di anticorpi monoclonali (mAbs) contro di loro è spesso difficile. In questo protocollo, forniamo una spiegazione dettagliata dei passaggi necessari per generare anticorpi monoclonali contro molecole bersaglio, nonché quelli necessari per creare l'associato indiretta competitivo (ic) ELISA per l'analisi rapida del composto nei campioni multipli. La procedura descrive la sintesi dell'antigene artificiale (cioè, il coniugato aptene-carrier), immunizzazione, fusione cellulare, preparazione di ibridoma monoclonale, caratterizzazione del mAb e l'applicazione basata su ELISA del mAb. Il coniugato aptene-carrier è stato sintetizzato dal Sodio Metaperiodato metodo e valutati mediante MALDI-TOF-MS. Dopo immunizzazione, splenocytes sono stati isolati dal mouse immunizzato con il più alto titolo dell'anticorpo e fuso con il deficit di ipoxantina-aminopterina-timidina (cappello) - linea cellulare di mieloma mouse sensibile Sp2/0 - Ag14 utilizzando un polietilene glicole (spina)-metodo basato. Gli ibridomi secernenti anticorpi monoclonali reattivi all'antigene bersaglio sono stati selezionati dall'icELISA per la specificità e la reattività crociata. Inoltre, è stato applicato il metodo di diluizione limitante per preparare ibridomi monoclonale. MAbs finale sono stati ulteriormente caratterizzata da icELISA e poi utilizzate in un'applicazione basata su ELISA per la rilevazione rapida e conveniente dell'aptene esempio (naringina (NAR)) nei prodotti naturali.

Generazione di ibridomi monoclonale
Il peso molecolare del coniugato aptene-carrier è stato confermato da analisi MALDI-TOF-MS. Come il peso molecolare di BSA e la NAR sono noti, potrebbe essere calcolato il numero di piccole molecole coniugate con BSA. La figura 1 Mostra i risultati rappresentativi spettrali per NAR-BSA22, che consente di...

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Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione e la valutazione degli anticorpi monoclonali contro prodotti naturali per l'utilizzo in vari test immunologici. Questa procedura comprende l'immunizzazione, la fusione cellulare, ELISA competitiva indiretto per clone positivo di screening e preparazione di ibridoma monoclonale. A vostra disposizione anche le specifiche per la caratterizzazione dell'anticorpo usando MALDI-TOF-MS e le analisi di ELISA.

Generazione di anticorpi monoclonali contro prodotti naturali

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Gli anticorpi monoclonali sono noti come anticorpi monospecifici prodotti da un singolo clone di linfociti B e dagli anticorpi monovalenti che si legano allo stesso epitopo. Recentemente, l'ELISA a base di anticorpi monoclonali è diventata la nostra piattaforma emergente per l'analisi qualitativa o quantitativa di alimenti o prodotti naturali. Questo metodo è un metodo accurato, sensibile ed efficace senza noiosi passaggi di pretrattamento.Questo è l'essenziale per i campioni biologici e le future applicazioni cliniche. La preparazione degli mAB di TCM è un passo vitale negli studi sulle caratteristiche complesse del sistema della formula TCM. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare mAB contro i piccoli composti molecolari, tra cui la sintesi artificiale dell'antigene, l'immunizzazione del topo e la fusione cellulare.L'hapten è collegato con la proteina portante per sintetizzare l'antigene artificiale. L'antigene artificiale e i coadiuvanti completi sono misti ed emulsionati. Il topo è stato immunizzato per iniezione sottocutanea.Eseni la milza del topo immunizzato e fai una sospensione a cella singola. Mescolare le cellule del mieloma. Gli splenociti sono isolati e fusi con la linea cellulare del mieloma del mouse sensibile a HAT con il metodo PEG.Selezionare una linea cellulare in grado di preparare gli anticorpi da ELISA. Gli ibridomi che secernono anticorpi monoclonali reattivi all'antigene vengono clonati. Stabilire che la linea cellulare dell'ibridoma è crioconservata.La procedura di ossidazione del periodato è stata utilizzata per la sintesi di un coniugato BSA di narigin. In primo luogo, la narigin è stata sciolta ad una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro a 100 microlitri di soluzione di pariodato di sodio appena preparata a cinque millilitri della soluzione di narigin. Mescolare la miscela a temperatura ambiente per un'ora.In secondo luogo, aggiungere due millilitri di proteine portanti alla miscela di reazione del periodato di sodio narigin. Regolare la miscela in soluzione di pH nove e continuare a reagire per sei-otto ore. In terzo luogo, l'antigene artificiale è stato purificato con metodo di dialisi nel PDS per tre giorni per allontanare il CBS.Il coadiuvante completo e incompleto di Freund è stato utilizzato per l'immunizzazione del topo. Per la vaccinazione, mescolare 50 microgrammi di coniugato con un volume uguale del coadiuvante completo di Freund ed emulsionare completamente. Amministrare 100 microgrammi di questa miscela a ciascun topo BALB/c tramite iniezione subcutanea dorsale.Fornire una vaccinazione booster tramite iniezione sottocutanea due settimane dopo con la stessa quantità di coniugato mescolato con coadiuvante incompleto. Per l'immunizzazione primaria, l'adiuvante completo e immunogeno di Freund è stato utilizzato tramite iniezione subdermica. Per l'immunizzazione booster, l'adiuvante incompleto di Freund e l'immunogeno sono stati utilizzati tramite iniezione subdermica.Per l'immunizzazione d'impatto senza coadiuvante, solo l'immunogeno è stato utilizzato tramite iniezione subdermica o iniezione intraperineale. Le cellule dello strato di alimentazione provenivano principalmente da cellule epiteliali addominali o macrofagi. RPMI 1640 FBS e HAT sono stati utilizzati per preparare il supporto dello schermo HAT.Il supplemento HAT è stato sciolto in mezzo RPMI da 10 millilitri, quindi aggiunto in 500 millilitri RPMI 1640 contenente il 20%FBS. E il topo ICR è stato sterilizzato dal 75% di alcol etilico per cinque minuti. Dopo aver rimosso la pelliccia dall'addome con forcep emostatiche, disinfettare l'area con il 75% di etanolo.Tagliare la pelle esterna per esporre la cavità addominale. Iniettare tre millilitri di mezzo sterile RPMI 1640 nell'addome. Quindi massaggiare l'addome per staccare altre cellule nella soluzione.Aspirare la sospensione cellulare fetale in un tubo di centrifuga da 15 millilitri. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare per 10 minuti a 1.000 g, scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule fetali per ottenere la sospensione a cella singola. Dopo questa procedura, sciogliere le celle utilizzando il supporto HAT.Contare le celle per renderle 100.000 per millilitro dai membri della cella. Trasferire le cellule in 96 piastre di coltura cellulare del pozzo. Incubare le piastre durante la notte a 37 gradi, 5% di anidride carbonica.Il topo immunizzato scelto è stato sterilizzato dal 75% di alcol etilico per cinque minuti. Aspirare RPMI 1640 medio come tampone di lavaggio. Rimuovere la pelle e il tessuto muscolare usando le forbici per esporre la milza.Isolare accuratamente la milza dalle pinzette. Quindi lavare la milza nell'RPMI 1640. Isolare la milza e tagliarla a pezzi.Picchia lentamente la milza. Quindi è stato trattato con un mezzo RMPI 1640 per sciogliere le cellule per preparare una sospensione cellulare di milza. Successivamente, le cellule sono state filtrate da 800 filtri cellulari mesh.Inchiodare accuratamente la milza per rimuovere i grandi tessuti. Evitare grandi tessuti influenza la fusione delle cellule. Era la sospensione cellulare di milza con mezzo RPMI 1640.Quindi la sospensione cellulare è stata aggiunta nel tubo di centrifuga. Raccogliere le cellule di milza per centrifugazione a 1.000g per 10 minuti. E poi scartare il supernatante.Le cellule di milza avrebbero dovuto ammontare da un miliardo a 10 miliardi. Rimuovere le cellule di mieloma coltivate e amplificate dall'incubatrice e scuotere delicatamente il pallone per ottenere una sospensione cellulare. Era la sospensione con RPMI due volte.Mescolare la sospensione cellulare della milza e le cellule del mieloma. Contare le cellule e regolare la concentrazione. La razione finale delle cellule di milza alle cellule del mieloma dovrebbe essere da uno a cinque a uno a 10.Centrifugare la miscela cellulare e quindi rimuovere il supernatante. Aggiungere un millilitro di soluzione di glicole polietilene al 50% alle cellule e mescolare delicatamente a 37 gradi per un minuto. In piedi per 30 secondi, aggiungere due millilitri di mezzo RPMI 1640 e incubare a 37 gradi per due minuti per terminare la reazione.Aggiungere in due millilitri RPMI per un altro minuto. Quindi, aggiungere in 10 millilitri RPMI 1640. Centrifuga a 800g per 10 minuti.Scartando il supernatante, aggiungere la soluzione di HAT e continuare a coltivare le cellule per sette giorni a 37 gradi 5% di anidride carbonica. Dopo sette giorni, i supernatanti cellulari in 96 piastre di pozzo sono stati aspirati dopo la fusione cellulare e aggiunti in piastre ELISA pre-rivestite con antigene di rivestimento. Coltivato a 37 gradi per un'ora, l'anticorpo secondario è stato aggiunto e coltivato per mezz'ora.Dopo aver aggiunto 100 microlitri di soluzione di substrato. Ferma la reazione. Per le piastre ELISA nel lettore di micropiastrine, è stato utilizzato il metodo endpoint per leggere i dati a 450 nanometri.Assorbanza misurata a 450 nanometri e scherma gli ibridomi positivi. Utilizzare il metodo di diluizione limitante per preparare gli ibridomi monoclonali. Dopo aver rimosso il supporto HD dagli ibridomi selezionati, sospendere di nuovo le celle in RPMI 1640 e contarle.Diluire le cellule di una concentrazione di una cellula, due cellule e quattro cellule per pozzo di RPMI 1640 in una piastra e coltura di 96 pozzi. Trasferire le cellule dagli ibridomi positivi a 24 piastre di pozzo, matavole da 25 e 75 centimetri quadrati per la coltivazione. Conservare i miodomi in una scatola di raffreddamento sfumato a meno 80 gradi per 24 ore.Quindi trasferimento all'azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine. Il giacimento di antisiero è stato determinato dall'ELISA indiretta. Il topo da uno a quattro è stato immunizzato con coniugato BSA di narigin era significativamente più alto del topo di controllo senza immunizzarsi.Il titer da uno a 5.000 è una diffusione sufficiente. Il peso molecolare del coniugato hapten è stato confermato dall'analisi MALDI-TOF. Come mostrato nella figura due, come è noto un peso molecolare dello standard BSA e della narigin, possiamo calcolare e determinare che le molecole di narigin sono state coniugate con BSA.Solo l'ibridoma può sopravvivere e crescere nei supporti di selezione HAT. Dopo sette giorni di crescita, la coltura cellulare può essere testata da ELISA. Gli ibridomi positivi sono stati ri-clonati ed espansi.Queste immagini mostrano il risultato convenzionale per linee cellulari stabili di ibridoma monoclonale e policlonale. Il punto critico di questo esperimento è lo screening degli mAb specifici per gli hapten, ma non per le proteine portanti. La specificità del mAb è stata quindi esaminata in presenza di altri composti strutturalmente correlati.La reattività incrociata è stata calcolata per valutare la specificità mAb dell'antigene. Sono state ottenute la curva di taratura della naringina e della gamma di rivestimenti. Gli ibridomi monoclonali specifici dell'antigene sono stati ampliati e crioconservati in azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine.Dopo aver visto questo video, spero che abbiate una buona comprensione di come generare anticorpi monoclonali contro un piccolo composti molecolari. Quindi questo è tutto. Grazie per la vostra visione e buona fortuna per i vostri esperimenti.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Amministrazione passivo di anticorpi monoclonali contro H. capsulatum E altri patogeni fungini

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Ricerca

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