Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
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この作品は、中国の国家自然科学基金 (許可番号 81573573、81473338、および 81503344) および古典的な処方基本的な研究チームが北京大学で中国医学のサポートだった。

本研究で動物の手続きのすべては、中国医学 (承認番号 2016BZYYL00109) の北京大学の倫理審査委員会によって承認されています。
注: 女性 BALB/c マウス (8 週齢) はハプテン キャリア蛋白抱合体で免疫しました。単独で、使用する小分子 (< 1,000 Da) 免疫反応を引き出すことはできません。しかし、抗原の合成高分子キャリアに小さな分子を活用します。この文脈では、小さな分...

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	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. 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G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

ここでは、自然製品由来の低分子抗体の巧妙な生産のためのプロトコルを提案する.重要な手順が記載されているし、我々 は例小分子として NAR を使用してこのプロトコルの有用性を示しています。例スペクトル、反応性の解析と icELISA の結果は、代表実験と、このプロトコルを使用して取得コントロール データを表示します。ハイブリドーマの例の画像は、どのような研究者を探していな?...

モノクローナル抗体 (Mab)、として知られているモノラル特異的抗体、単一 b リンパ球クローンから生成され、すべてが同じエピトープ1にバインドすると 1 価の抗体で構成されています。近年、多く薬用植物由来の天然物は、様々 な病気の2の治療に使用されています。確かに、もともと天然物から派生した多くの小さな分子の化合物が癌2,3paciltaxel (タキソール) ・ マラリアのアルテミシニンなどの最初の行薬として適用されます。天然物の研究は主に途方もない開発と高速液体クロマトグラフィー (HPLC) や質量分析法 (MS) など、従来の解析手法の最適化のための急速な進歩をしました。ただし、まだ複雑な前処理プロトコルや時間、労働/専門知識、および必要な楽器4に関して関連するコストなど、これらの方法に関連付けられているいくつかの制限があります。
最近では、モノクローナル抗体を用いた酵素抗体法 (Elisa) は、定性的・定量的分析食品や天然物に適用されています。実際には、このメソッドの生体試料分析と臨床検査の両方に適用されているし、も関連付けられているその他の解析5、面倒な前処理手順を回避しながら、正確、敏感、かつ高効率に示されています。 6。
モノクローナル抗体を用いた Elisa を使用して、複雑な天然物を研究する、モノクローナル抗体の調製は、主な手順の 1 つです。残念ながら、Mab は小さな生物活性成分物質6,7,8,9,10、11,12 のこれらのタイプの存在に固有 ,13,14,15蛋白質の抗原と比較して限られています。この問題を回避するためには、具体的には小さな化合物に対して抗体を生成するプロトコルを開発しました。ここで提示されたプロトコルには、人工抗原の合成には、マウス免疫には、細胞融合には、間接競合 ELISA にはモノクローナルハイブリドーマ準備が含まれます。
特に、我々 の研究グループは中国の伝統薬から小さな生理活性物質に対するモノクローナル抗体の形成を勉強と長年彼らのアプリケーションを開発されています。当社の継続的研究では、baicalin16、puerarin17グリチルリチン酸18、ペオニフロリン19、ジンセノ サイド Re20、ジンセノ サイド Rh121、および他の多くの小さい分子に対して抗体を開発しました。これらの Mab に基づいて私達の ELISA のプロトコルは、その他の生理活性物質との相互作用と同様に、これらの小さな分子の薬物動態を評価する多くの研究で使用されています。さらに、これらのモノクローナル抗体を使用して、構築した immunoaffinity クロマトグラフィー法黒淵を含む構造の類似物の分離。最近では、この化合物、敷地内に急速な検出のために使用されました私たちの抗 puerarin モノクローナル抗体を用いた側方流動免疫測定法をご用意しました。モノクローナル抗体アッセイが生物学と伝統的な中国薬で使用される特にそれら天然由来製品化合物の質を研究するための不可欠なツールであることが示唆されました。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
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generation of monoclonal antibodies against natural products

食品や天然物の生理活性成分の分析は、伝統的な中国医学や食品安全/毒物学を含む多くの分野で研究の人気のエリアになっています。古典的な分析の技術の多くは高価な機器や専門知識を必要とします。特に、酵素抗体法 (Elisa) 食品や天然物の分析のための新たな方法となっています。このメソッドは、ターゲット コンポーネントの抗体検出に基づいています。しかし、天然の生理活性成分の多くが小さい (< 1,000 Da) と免疫反応を誘発しない、それらに対するモノクローナル抗体 (Mab) を作成するは困難です。このプロトコルでは、複数のサンプルの化合物の迅速分析に関連する間接競争 (ic) ELISA を作成に必要なものだけでなく、標的分子に対する抗体を生成するために必要な手順の詳細な説明を提供します。手順では、(すなわち、ハプテン キャリア共役) 人工抗原の合成、免疫、細胞融合、モノクローナルハイブリドーマ準備、モノクローナル抗体のキャラクタリゼーションと mAb の elisa 法を用いたアプリケーションについて説明します。ハプテン キャリア共役はナトリウムによって合成されたメソッドを過ヨウ素酸し、MALDI TOF MS によって評価されます。予防接種後脾細胞が最も高い抗体価と免疫マウスから分離したし、ヒポキサンチン アミノプテリン チミジン (帽子) - 敏感なマウス骨髄腫細胞ライン Sp2/0 - Ag14 と融合、ポリエチレング リコール (PEG) を使用しての手法します。ターゲット抗原に対する反応性抗体産生ハイブリドーマの特異性と交差反応性の icELISA で上映されました。さらに、限界希釈法は、モノクローナル ハイブリドーマの準備に適用されました。最終的な Mab icELISA によってさらに特徴づけられる、天然の例ハプテン (ナリンギン (NAR)) の迅速で簡便な検出のための elisa 法を用いたアプリケーションのために用いられる。

モノクローナル ハイブリドーマの生成
Hapten-キャリアの複合体分子の重量は、MALDI TOF 質量分析によって確認されました。BSA と NAR の分子量は知られている、BSA を用いた共役分子の数を計算する可能性があります。図 1には、代表的なスペクトル NAR BSA22 m...

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Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

準備および様々 なイムノアッセイ用天然物に対するモノクローナル抗体の評価のための詳しいプロトコルを説明します。この手順には、予防接種、細胞融合、スクリーニング、肯定的なクローンとモノクローナルハイブリドーマ準備のため間接競合 elisa 法が含まれています。MALDI TOF MS と ELISA 解析を使用して抗体の特性の仕様もあります。

天然物に対するモノクローナル抗体の作製

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

モノクローナル抗体は、単一のBリンパ球クローンと同じエピトープに結合する一価抗体から産生される単一特異的抗体として知られている。近年、モノクローナル抗体ベースのELISAは、食品や天然物の定性的または定量的な分析のための新たなプラットフォームとなっています。この方法は、面倒な前処理のステップを伴わない正確で、敏感で効果的な方法です。それが生物学的サンプルと将来の臨床応用に不可欠です。TCMのmABの調製は、TCM式の複雑なシステム特性に関する研究において重要なステップである。我々は、人工抗原合成、マウス免疫、細胞融合を含む小分子化合物に対してmABを生成するプロトコルを開発した。ハプテンをキャリアタンパク質と連結して人工抗原を合成する。人工抗原と完全なアジュバントが混合され、乳化される。マウスを皮下注射で免疫した。免疫マウスの脾臓を取り出し、単細胞懸濁液を作ります。骨髄腫細胞を混合します。脾細胞は、PEG法によりHAT感受性マウス骨髄腫細胞株と分離および融合される。ELISAにより抗体を調製することができる細胞株を選択する。抗原に反応性のモノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマはクローン化される。ハイブリドーマ細胞株が凍結保存されていることを確立する。ナリジンBSAコンジュゲートの合成に歯分化酸化手順を用いた。まず、ナリジンを、5ミリリットルのナリジン溶液に調製した新たに調製したパラオデート溶液の100マイクロリットルで1ミリリットル当たり1ミリグラムの最終濃度で溶解した。室温で1時間かき混ぜます。第二に、ナリチンナトリウムのイラリン酸反応混合物に2ミリリットルのキャリアタンパク質を加える。pH 9溶液に混合物を調整し、6〜8時間反応し続けます。第三に、人工抗原をPDSで3日間透析法で精製し、CBSを疎遠にした。フロイントの完全なアジュバントと不完全なアジュバントは、マウスの免疫のために使用されました。ワクチン接種のために、50マイクログラムのコンジュゲートとフロイントの完全なアジュバントの同じ量を混ぜ、完全に乳化する。この混合物の100マイクログラムを各BALB/cマウスに対して、下皮下注射を介して管理する。不完全なアジュバントと混合コンジュゲートの同じ量で2週間後に皮下注射を介してブースターワクチン接種を提供します。一次免疫のために、フロイントの完全なアジュバントおよび免疫原を皮下注射を介して使用した。ブースター免疫のために、フロイントの不完全なアジュバントと免疫原は皮下注射を介して使用された。アジュバントを伴わない影響免疫化のために、皮下注射または膜内注射を介して免疫原のみを使用した。フィード層細胞は、主に腹部上皮細胞またはマクロファージに由来する。RPMI 1640 FBSおよびHATは、HATスクリーン媒体を調製するために使用された。HATサプリメントを10ミリリットルRPMI培地に溶解し、その後、20%FBSを含む500ミリリットルRPMI 1640に添加した。そしてICRマウスを、75%エチルアルコールで5分間殺菌した。止血鉗子で腹部から毛皮を取り除いた後、75%エタノールで領域を消毒する。腹腔を露出させるために外皮を切る。3ミリリットルの無菌RPMI 1640培地を腹部に注入する。その後、腹部をマッサージして、追加の細胞を溶液に取り外します。胎児細胞懸濁液を15ミリリットル遠心分離チューブに吸引する。1,000gで細胞懸濁液を10分間遠心した後、上清を捨て、胎児細胞を再懸濁させて単一細胞懸濁液を得る。この手順の後、HAT培地を使用して細胞を溶解します。細胞を数え、細胞メンバーから1ミリリットルあたり100,000にします。細胞を96ウェル細胞培養プレートに移す。プレートを一晩37度、5%の二酸化炭素でインキュベートします。選択した免疫マウスを、75%エチルアルコールで5分間殺菌した。洗浄緩衝液としてRPMI 1640培地を吸引する。はさみを使用して皮膚と筋肉組織を取り除き、脾臓を露出させます。ピンセットで脾臓を慎重に分離します。次いで、脾臓をRPMI 1640で洗浄する。脾臓を分離し、粉々に切ります。ゆっくりと脾臓を叩く。次に、細胞を溶解させて脾臓細胞懸濁液を調製するRMPI 1640培地で処理した。その後、800メッシュ細胞ストレーナーにより細胞を濾過した。大きな組織を取り除くために慎重に脾臓を釘付け。大きな組織を避けることは、細胞の融合に影響を与えます。脾細胞懸濁液をRPMI 1640培地と共にした。次いで、細胞懸濁液を遠心分離管に加えた。1,000gで10分間遠心分離して脾細胞を収穫する。そして上清を捨てる。脾臓細胞は10億から100億の量であると考えられていました。培養し増幅したミエローマ細胞を培養器から取り出し、フラスコを軽く振って細胞懸濁液を得る。サスペンションはRPMIを2回行った。脾臓細胞懸濁液と骨髄腫細胞を混合します。細胞を数え、濃度を調整します。骨髄腫細胞に対する脾臓細胞の最終的な配給は、1〜5〜1〜10である必要があります。細胞混合物を遠心分離し、上清を除去する。50%ポリエチレングリコール溶液を1ミリリットル加え、37度で1分間軽くかき混ぜます。30秒間放置し、RPMI 1640培地を2ミリリットル加え、37度で2分間インキュベートして反応を終了します。さらに1分間、RPMIを2ミリリットルに加えます。その後、10ミリリットルRPMI 1640に加えます。800gで10分間遠心分離機。上清を捨て、HAT溶液を添加し、37度5%の二酸化炭素で7日間細胞を培養し続ける。7日後、96ウェルプレートの細胞上清を細胞融合後に吸引し、コーティング抗原でコーティングしたELISAプレートに添加した。37度で1時間栽培し、二次抗体を30分間加え、栽培した。100マイクロリットルの基質溶液を加えた後。反応を停止します。マイクロプレートリーダーにELISAプレートに、エンドポイント法を用い、450ナノメートルでデータを読み取った。450ナノメートルで吸光度を測定し、陽性ハイブリドーマをスクリーニングする。限定希釈法を用い、モノクローナルハイブリドーマを調製する。選択したハイブリドーマからHD培地を取り出した後、RPMI 1640の細胞を再中断し、それらをカウントする。96ウェルプレートと培養で、1つの細胞、2つの細胞、および4つの細胞をRPMI 1640で希釈します。陽性のハイブリドーマから24ウェルプレート、25と75平方センチメートルのフラスコに細胞を移して栽培する。24時間マイナス80度の勾配冷却ボックスにミオドマを保管してください。その後、長期保存のために液体窒素に移します。抗血清の抗体は間接ELISAによって決定した。マウス1〜4をナリチンBSAコンジュゲートで免疫し、免疫を行わないコントロールマウスよりも有意に高かった。1〜5,000の滴下は十分な拡散である。ハプテンコンジュゲートの分子量は、MALDI-TOF分析により確認された。図2に示すように、BSA標準とナリジンの分子量が知られているように、ナリジンの分子がBSAと共役したことを計算し、決定することができる。ハイブリドーマだけが生き残り、HAT選択メディアで成長することができます。7日間の増殖後、細胞培養はELISAにより試験することができる。陽性のハイブリドーマを再クローン化し、拡大した。これらの画像は、安定したモノクローナルおよびポリクローナルハイブリドーマ細胞株の従来の結果を示す。この実験の重要なポイントは、ハプテンに特異的なmAbsをスクリーニングすることですが、キャリアタンパク質ではありません。mAbの特異性を、その他の構造的に関連する化合物の存在下で調べた。クロス反応性を算出し、抗原に対するmAb特異性を評価した。ナリンジンの較正曲線とライナーの範囲を求めた。抗原特異的モノクローナルハイブリドーマを、長期保存のために液体窒素中に拡張および凍結保存した。このビデオを見て、小分子化合物に対してモノクローナル抗体を生成する方法についてよく理解して下さい。だから、それだけです。あなたの見て、あなたの実験のために幸運をありがとう。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

に対するモノクローナル抗体の受動的な管理 H. capsulatumとその他の真菌病原体

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

細胞内の抗リーシュマニアに対するスクリーニングのための寄生虫のRescue and形質転換試験<em&gt;ドノバンリーシュマニア</emTHP1ヒト急性単球性白血病細胞株における&gt;無鞭毛

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

不死化ソートB細胞からの組換えヒトIgGモノクローナル抗体の作製

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

酵素結合レクチンアッセイによってインフルエンザノイラミニダーゼ阻害抗体価を測定します

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

ハイブリドーマ技術によってマウスモノクローナル抗体の作製

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

エスケープ中和抗体でインフルエンザ ウイルスの亜種の世代

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

まれな抗原特異的 B 細胞血液の循環から弁別に対するモノクローナル抗体の生成

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

疾患特異的抗体の生成のための抗原性リポソーム

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...