Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av den nasjonale Natural Science Foundation i Kina (grant tall 81573573, 81473338 og 81503344) og klassisk resept grunnleggende forskningsteam ved Beijing University kinesisk medisin.

Alle dyr prosedyrer utført i denne studien har blitt godkjent av etiske gjennomgangen komiteen ved Beijing universitet, kinesisk medisin (godkjenning nummer 2016BZYYL00109).
Merk: Kvinnelige BALB/c mus (8 uker gamle) ble vaksinert med hapten-carrier protein conjugates. Når den brukes alene, et lite molekyl (< 1000 Da) kan ikke lokke fram en immunrespons. Imidlertid bøye de små molekylet til en transportør Makromolekyl resultater i antigen syntese. I denne sammenheng kalt de små molekylet...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Her presenterer vi en protokoll for vellykket produksjon av mAbs mot naturlig produkt-avledet små molekyler. De grunnleggende trinnene i prosedyren har vært skissert, og vi har vist nytten av denne protokollen bruker NAR som et eksempel små molekyl. Til eksempel spectra, reaktivitet analyser og icELISA resultater viser representant eksperimentelle og kontrolldata som er hentet ved hjelp av denne protokollen. Eksempel bilder av hybridomas gir en visuell representasjon av hva hun bør se etter når skille mellom de mono...

Monoklonale antistoffer (mAbs), også kjent som mono-spesifikke antistoffer, er produsert av en enkelt B-lymphocyte klone og består av monovalent antistoffer at alle binde til samme epitope1. De siste årene, har mange medisinsk plante-avledet naturlige produkter blitt brukt i behandling av ulike sykdommer2. Faktisk, mange små molekylære forbindelser opprinnelig stammer fra naturlige produkter nå brukes som første linje narkotika, for eksempel artemisinin for malaria og paciltaxel (taxol) for kreft2,3. Studiet av naturlige produkter har gjort raske fremskritt, hovedsakelig på grunn av enorm utvikling og optimalisering av konvensjonelle analyseteknikker, inkludert Væskekromatografi (HPLC) og massespektrometri (MS). Men det er fortsatt noen begrensninger knyttet til disse metodene, for eksempel komplekse forbehandling protokoller og tilhørende kostnader med hensyn til tid, arbeidskraft/kompetanse og nødvendige instrumenter4.
MAb-baserte enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) har nylig brukt kvalitativt og kvantitativt analysere mat og naturlige produkter. Faktisk, denne metoden er brukt både biologiske prøver analyse og klinisk testing og har vist seg å være nøyaktig, følsom og svært effektiv og også unngå kjedelig forbehandling trinnene forbundet med andre analyser5, 6.
Når du bruker mAb-baserte ELISAs for å studere komplekse naturlige produkter, er utarbeidelse av monoklonale antistoffer en av kjernen trinnene. Dessverre, mAbs gjelder for små bioaktive komponenter i slike stoffer6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 er ofte begrenset sammenlignet med protein antigener. For å omgå dette problemet, har vi utviklet en protokoll for å generere spesielt mAbs mot små forbindelser. Protokollen presenteres her inkluderer kunstig antigen syntese, musen immunisering, cellen smelting, indirekte konkurransedyktig ELISA og monoklonalt hybridoma forberedelse.
Vår forskningsgruppe er spesielt studere dannelsen av mAbs mot små bioaktive forbindelser fra tradisjonell kinesisk medisin og utvikle programmene sine for år. I vår pågående studier, har vi utviklet mAbs mot baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic syre18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121og mange andre små molekyler. Våre ELISA protokoller basert på disse mAbs har blitt brukt i en rekke studier vurdere farmakokinetikken av disse små molekyler som deres samhandling med andre bioaktive forbindelser. Videre har bruker disse mAbs, vi også utviklet immunoaffinity kromatografi metoder for separasjon av strukturelle analoger, inkludert epimers. Nylig har forberedt vi en lateral flyt immunanalyse med våre anti-puerarin mAb som ble brukt for rask, stedets påvisning av dette sammensatte. Våre resultater viser at våre mAb-baserte analyser er uunnværlig og praktisk verktøy for å studere biologi og kvalitet av naturlig-produkt-avledet forbindelser, særlig de som brukes i tradisjonell kinesisk medisin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

Analyse av bioaktive komponenter i mat og naturlige produkter har blitt et populært område av studien på mange felt, inkludert tradisjonell kinesisk medisin og mat sikkerhet/toksikologi. Mange av de klassiske analyseteknikker krever dyrt utstyr og/eller kompetanse. Spesielt har enzym knyttet immunosorbent analyser (ELISAs) blitt en ny metode for analyse av mat og naturlige produkter. Denne metoden er basert på antistoff-mediert deteksjon av målkomponenter. Men som mange av bioaktive komponenter i naturlige produkter er liten (< 1000 Da) og ikke indusere en immunrespons, opprette monoklonale antistoffer (mAbs) mot dem er ofte vanskelig. I denne protokollen gir vi en detaljert forklaring av trinn kreves for å generere mAbs mot målmolekyler samt de måtte opprette forbundet indirekte konkurransedyktig (ic) ELISA for rask analyse av sammensatt i flere eksempler. Prosedyren beskriver syntese av kunstige antigen (dvs. hapten-carrier konjugert), immunisering, cellen smelting, monoklonalt hybridoma forberedelse, karakterisering av mAb og ELISA-baserte programmet av mAb. Hapten-carrier konjugert ble syntetisert av natrium periodate metoden og vurdert av MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis. Etter immunisering, splenocytes ble isolert fra vaksineres musen med den høyeste antistoff titer og smeltet sammen med hypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) - sensitive musen myelom celle linje Sp2/0 - Ag14 bruker en polyetylenglykol (PEG)-basert metode. Hybridomas sekresjon mAbs reaktiv til målet antigen ble vist av icELISA for spesifisitet og kryssreaktivitet. Videre ble begrensende fortynning metoden brukt til å forberede monoklonalt hybridomas. De siste mAbs ble ytterligere preget av icELISA og deretter benyttet i en ELISA-basert applikasjon for rask og praktisk påvisning av eksempel hapten (naringin (NAR)) i naturlige produkter.

Generasjon av monoklonale hybridomas
Molekylvekt av hapten-carrier konjugert ble bekreftet av MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis analyse. Som molekylvekt BSA og NAR er kjent, kan du beregne antall små molekyler konjugert med BSA. Figur 1 viser representant spectral resultater for NAR-BSA22, som viser en bred topp på m/z 77,058. Som den...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Denne artikkelen inneholder en detaljert protokoll og evaluering av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter for bruk i ulike immunanalyser. Denne fremgangsmåten inneholder immunisering, celle fusion, indirekte konkurransedyktig ELISA for positiv klone screening og monoklonalt hybridoma forberedelse. Spesifikasjonene for antistoff karakterisering ved hjelp MALDI-TOF-MULTIPLE Sclerosis og ELISA Analyser tilbys også.

Generasjon av monoklonale antistoffer mot naturlige produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonale antistoffer er kjent som monospesifikke antistoffer som er produsert fra en enkelt B-lymfocyttklone og monovalente antistoffer som binder seg til samme epitop. Nylig har den monoklonale antistoffbaserte ELISA blitt vår nye plattform for kvalitativ eller kvantitativ analyse av matvarer eller naturlige produkter. Denne metoden er en nøyaktig, følsom og effektiv metode uten kjedelige forbehandlingstrinn.Så det er det avgjørende for biologiske prøver og fremtidige kliniske anvendelser. Utarbeidelse av mAB-ene til TCM er et viktig skritt i studier på komplekse systemegenskaper av TCM-formel. Vi har utviklet en protokoll for å generere mAB mot de små molekylære forbindelsene, inkludert kunstig antigensyntese, museimmunisering og cellefusjon.Hapten er forbundet med bærerproteinet for å syntetisere det kunstige antigenet. Kunstig antigen og fullstendige adjuvanser blandes og emulgeres. Musen ble immunisert ved subkutan injeksjon.Ta ut milten av immunisert mus og gjør encellede suspensjon. Bland myelomcellene. Miltytter er isolert og smeltet sammen med HAT-sensitiv mus myelom celle linje ved PEG metode.Velg en cellelinje som kan forberede antistoffer med ELISA. Hybridomer som utskiller monoklonale antistoffer som er reaktive mot antigen, klones. Etablere hybridoma cellelinjen er kryopreservert.Periodat oksidasjonsprosedyre ble brukt til syntese av en narigin BSA konjugat. For det første ble narigin oppløst ved en endelig konsentrasjon på ett milligram per milliliter ved 100 mikroliter nylaget natriumpariodateløsning til fem milliliter nariginoppløsning. Rør blandingen ved romtemperatur i en time.For det andre, tilsett to milliliter bærerprotein til nariginnatrium periodat reaksjonsblandingen. Juster blandingen til pH ni oppløsning og fortsett å reagere i seks til åtte timer. For det tredje ble det kunstige antigenet renset med dialysemetode i PDS i tre dager for å fremmedgjøre CBS.Freunds fullstendige adjuvans og ufullstendige adjuvans ble brukt til museimmunisering. For vaksinasjonen, bland 50 mikrogram konjugat med et likt volum av Freunds fullstendige adjuvans og emulger helt. Administrer 100 mikrogram av denne blandingen til hver BALB/c-mus via dorsal subkutan injeksjon.Lever en boostervaksinasjon via subkutan injeksjon to uker senere med samme mengde konjugat blandet med ufullstendig adjuvans. For primærimmunisering ble Freunds fullstendige adjuvans og immunogen brukt via subdermal injeksjon. For boosterimmunisering ble Freunds ufullstendige adjuvans og immunogen brukt via subdermal injeksjon.For slagimmunisering uten adjuvans ble kun immunogen brukt via subdermal injeksjon eller intraperineal injeksjon. Feed lagceller hovedsakelig stammer fra abdominal epitelceller eller makrofag. RPMI 1640 FBS og HAT ble brukt til å forberede HAT-skjermmedium.HAT supplement ble oppløst i 10 milliliter RPMI medium, deretter lagt til 500 milliliter RPMI 1640 inneholder 20% FBS. Og ICR-musen ble sterilisert av 75% etylalkohol i fem minutter. Etter å ha fjernet pelsen fra magen med hemostatiske tang, desinfiserer området med 75% etanol.Klipp den ytre huden for å eksponere bukhulen. Injiser tre milliliter sterile RPMI 1640 medium i magen. Masser deretter magen for å løsne flere celler i løsningen.Aspirer fostercellefjæringen i et 15 milliliter sentrifugerør. Etter sentrifugering celle suspensjon i 10 minutter på 1, 000g, kaste supernatant og re-suspendere fostercellene for å få encelledepensjon. Etter denne prosedyren oppløs cellene ved hjelp av HAT medium.Telle cellene for å gjøre det 100,000 per milliliter fra cellemedlemmer. Overfør cellene til 96 brønncellekulturplater. Inkuber platene over natten ved 37 grader, 5%karbondioksid.Den valgte immuniserte musen ble sterilisert med 75% etylalkohol i fem minutter. Aspirer RPMI 1640 medium som vaskebuffer. Fjern hud og muskelvev ved hjelp av saks for å eksponere milten.Isoler milten ved pinsettene forsiktig. Vask deretter milten i RPMI 1640. Isoler milten og kutt i stykker.Sakte pund milten. Deretter ble det behandlet med et RMPI 1640 medium for å oppløse cellene for å forberede en milt celle suspensjon. Etter det ble cellene filtrert av 800 mesh celle sil.Spikre milten forsiktig for å fjerne det store vevet. Unngå store vev påvirke fusjon av celler. Var milten celle suspensjon med RPMI 1640 medium.Deretter ble cellesuspensjonen lagt inn i sentrifugerøret. Høst miltencellene ved sentrifugering ved 1000g i 10 minutter. Og kast deretter det overnaturlige.Miltcellene skulle være på en milliard til 10 milliarder. Fjern de kultiverte og forsterkede myelomceller fra inkubatoren og rist forsiktig kolben for å oppnå en cellefjæring. Var suspensjonen med RPMI to ganger.Bland miltcellesuspensjonen og myelomcellene. Tell cellene og juster konsentrasjonen. Den endelige rasjonen av miltceller til myelomceller bør være en til fem til en til 10.Sentrifuger celleblandingen og fjern deretter det overnaturlige. Tilsett en milliliter 50% polyetylenglykolløsning til cellene og rør forsiktig ved 37 grader i ett minutt. Stående i 30 sekunder, legg til to milliliter RPMI 1640 medium og inkuber ved 37 grader i to minutter for å avslutte reaksjonen.Legg til to milliliter RPMI i ytterligere ett minutt. Deretter legger du til 10 milliliter RPMI 1640. Sentrifuge på 800g i 10 minutter.Kast det overnaturlige, tilsett HAT-løsningen og fortsett å dyrke cellene i syv dager ved 37 graders 5% karbondioksid. Etter syv dager ble cellesupernatanter i 96 brønnplater aspirert etter cellefusjon og lagt til ELISA-plater pre-belagt med beleggantigen. Dyrket på 37 grader i en time, ble sekundært antistoff lagt til og dyrket i en halv time.Etter å ha lagt til 100 mikroliter substratoppløsning. Stopp reaksjonen. Til ELISA-platene inn i mikroplateleseren ble endepunktmetoden brukt til å lese dataene ved 450 nanometer.Målt absorbans ved 450 nanometer og skjerm de positive hybridomene. Bruk begrensende fortynningsmetode for å forberede monoklonale hybridomer. Når du har fjernet HD-mediet fra de valgte hybridomene, må cellene suspenderes på nytt i RPMI 1640 og telle dem.Fortynn cellene i en konsentrasjon av en celle, to celler og fire celler per brønn ved RPMI 1640 i en 96 brønnplate og kultur. Overfør celler fra hybridomene som er positive til 24 brønnplater, 25 og 75 kvadratcentimeter flasker for dyrking. Oppbevar myodomene i en gradert kjøleboks på minus 80 grader i 24 timer.Deretter overføres til flytende nitrogen for langsiktig lagring. Titer av antiserum ble bestemt av indirekte ELISA. Mus en til fire ble immunisert med narigin BSA konjugat var betydelig høyere enn kontrollmusen uten immunisert.Titeren av en til 5 000 er tilstrekkelig diffusjon. Den molekylære vekten av hapten konjugatet ble bekreftet av MALDI-TOF analyse. Som vist i figur to, som en molekylær vekt av BSA-standard og narigin har vært kjent, kan vi beregne og bestemme at molekylene av narigin ble konjugert med BSA.Bare hybridoma kan overleve og vokse i HAT utvalg media. Etter syv dager med vekst kan cellekulturen testes av ELISA. De positive hybridomene ble re-klonet og utvidet.Disse bildene viser det konvensjonelle resultatet for stabile monoklonale og polyklonale hybridomacellelinjer. Det kritiske punktet i dette eksperimentet er screening mAbs spesifikke for hapten, men ikke bærer protein. Spesifisiteten til mAb ble deretter undersøkt i nærvær av andre strukturelt relaterte forbindelser.Kryssreaktiviteten ble beregnet for å evaluere mAb-spesifisiteten til antigenet. Kalibreringskurven til naringin og liner-serien ble oppnådd. De antigenspesifikke monoklonale hybridomene ble utvidet og kryoservert i flytende nitrogen for langvarig lagring.Etter å ha sett denne videoen, håper jeg du har en god forståelse for hvordan du genererer monoklonale antistoffer mot en liten molekylær forbindelser. Så det er alt. Takk for at du ser på og lykke til for eksperimentene dine.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening mot intracellulære<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Menneskelig Akutt monocyttisk leukemi cellelinje

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandling av blodplater Produkter med Riboflavin og UV Light: Effektivitet mot høye Titer bakteriell forurensning

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generasjon av rekombinant humant IgG monoklonale antistoffer fra udødelig Ordnet B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Måling av Influensa neuraminidase Inhibering antistofftitere ved enzym-bundet lektin Assay

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generering av monoklonale antistoffer fra mus ved Hybridoma Technology

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generasjon av Escape varianter av nøytralisere influensa Virus monoklonale antistoffer

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generasjon av Discriminative menneskelige monoklonale antistoffer fra sjeldne Antigen-spesifikke B celler i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigen liposomer for generering av sykdom-spesifikke antistoffer

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...