Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de ciências naturais da China (concessão números 81573573, 81473338 e 81503344) e a clássica receita básica equipe de pesquisa da Universidade de Beijing de medicina chinesa.

Todos os animais procedimentos realizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de revisão ética da Universidade de Beijing de medicina chinesa (aprovação número 2016BZYYL00109).
Nota: Camundongos BALB/c feminino (8 semanas de idade) foram imunizados com transportadora hapteno proteína conjugados. Quando usado sozinho, uma pequena molécula (< 1.000 Da) não pode eliciar uma resposta imune. No entanto, conjugando a molécula pequena para um resultados de macromolécula transportadora...

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	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Aqui, apresentamos um protocolo para a produção bem sucedida de mAbs contra naturais produto derivado pequenas moléculas. As etapas essenciais no procedimento foram delineadas, e temos demonstrado a utilidade do presente protocolo usando NAR como uma pequena molécula de exemplo. Os espectros de exemplo, análises de reatividade e icELISA resultados que todos mostram representante experimental e dados de controle que são obtidos usando este protocolo. Imagens de exemplo das hibridomas fornecem uma representação vis...

Anticorpos monoclonais (mAbs), também conhecido como anticorpos mono-específicos, são produzidos a partir de um único clone de linfócitos e são compostos de anticorpos monovalentes, que só ligam para o mesmo epítopo1. Nos últimos anos, utilizaram-se muitos produtos naturais de origem vegetal medicinais no tratamento de várias doenças2. De fato, muitos compostos moleculares pequenos originalmente derivados de produtos naturais são agora aplicados como drogas de primeira linha, tais como artemisinina para malária e paciltaxel (taxol) para câncer2,3. O estudo de produtos naturais tem feito progressos rápidos, em grande parte devido a enorme desenvolvimento e otimização de técnicas de análise convencionais, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) e espectrometria de massa (MS). No entanto, ainda existem algumas limitações associadas com esses métodos, tais como seus protocolos complexos de pré-tratamento e custos associados com relação ao tempo, mão de obra/expertise e instrumentos necessários4.
Recentemente, aplicaram-se ensaios baseados em mAb imunoenzimático (ELISA) para qualitativa e quantitativamente análise de alimentos e produtos naturais. Na verdade, esse método tem sido aplicado para análise de amostras biológicas e testes clínicos e foi mostrado para ser exato, sensível e altamente eficiente, evitando também as etapas de pré-tratamento tediosas associadas com outras análises5, 6.
Quando usando Elisa mAb-baseado para estudar produtos naturais complexos, preparação dos anticorpos monoclonais é uma das principais etapas. Infelizmente, os mAbs específicos aos pequenos componentes bioativos presentes nestes tipos de substâncias6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 muitas vezes são limitados em comparação com os antígenos da proteína. Para contornar esse problema, temos desenvolvido um protocolo para gerar especificamente mAbs contra pequenos compostos. O protocolo aqui apresentado inclui a síntese artificial de antígeno, imunização de rato, fusão celular, ELISA competitiva indireta e preparação de hibridoma monoclonal.
Notadamente, nosso grupo de pesquisa foi estudar a formação de mAbs contra pequenos compostos bioativos de medicinas chinesas tradicionais e desenvolver suas aplicações há anos. Em nossos estudos em curso, desenvolvemos mAbs contra baicalin16, puerarina17, de ácido glicirrízico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121e muitas outras pequenas moléculas. Nossos protocolos de ELISA baseados nesses mAbs têm sido utilizados em uma série de estudos para avaliar a farmacocinética destas pequenas moléculas, bem como suas interações com outros compostos bioativos. Além disso, usando esses mAbs, também desenvolvemos immunoaffinity métodos de cromatografia para separação de análogos estruturais, incluindo epimers. Recentemente, preparamos um imunoensaio de fluxo lateral usando nosso mAb antipuerarina que foi posteriormente usado para detecção rápida no local deste composto. Nossos resultados indicam que nossos ensaios mAb-based são ferramentas indispensáveis e convenientes para estudar a biologia e a qualidade de compostos naturais-produto-derivado, particularmente aqueles usados em medicinas chinesas tradicionais.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
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		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
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generation of monoclonal antibodies against natural products

A análise dos componentes bioativos presentes em alimentos e produtos naturais tornou-se uma popular área de estudo em muitos campos, incluindo o tradicional chinesa medicina e comida segurança/toxicologia. Muitas das técnicas de análise clássica exigem equipamentos caros e/ou experiência. Notavelmente, ensaios imunoenzimático (ELISA) tornaram-se um método emergente de análise de alimentos e produtos naturais. Este método baseia-se na mediada por anticorpo de detecção de componentes o alvo. No entanto, como muitos dos componentes bioativos em produtos naturais são pequenos (< 1.000 Da) e não provocar uma resposta imune, criar anticorpos monoclonais (mAbs) contra eles, muitas vezes é difícil. Neste protocolo, nós fornecemos uma explicação detalhada das etapas necessárias para gerar mAbs contra moléculas-alvo, bem como aqueles necessários para criar o associado indireta competitiva (ic) ELISA para a análise rápida do composto em várias amostras. O procedimento descreve a síntese do antígeno artificial (ou seja, o conjugado de hapteno-portador), imunização, fusão celular, preparação de hibridoma monoclonal, caracterização do mAb e o aplicativo baseado em ELISA do mAb. O conjugado de hapteno-transportadora foi sintetizado por sódio periodato método e avaliada por MALDI-TOF-MS. Após a imunização, splenocytes foram isoladas a partir do rato imunizado com o mais alto título de anticorpos e fundido com a hipoxantina-aminopterin-timidina (HAT) - linha celular do mouse sensível mieloma Sp2/0 - Ag14 usando um polietileno glicol (PEG)-com base em método. As hibridomas secretando mAbs reativo ao antígeno alvo foram projectadas pelo icELISA de especificidade e de reactividade cruzada. Além disso, o método de diluição limitante foi aplicado para preparar os hybridomas monoclonais. Os finais mAbs foram ainda mais caracterizadas por icELISA e então utilizados em um aplicativo baseado em ELISA para a detecção rápida e conveniente de hapteno o exemplo (naringinases (NAR)) em produtos naturais.

Geração de hibridomas monoclonais
O peso molecular do conjugado hapteno-transportadora foi confirmado pela análise de MALDI-TOF-MS. Como o peso molecular de BSA e o NAR são conhecidos, o número de pequenas moléculas conjugadas com BSA poderia ser calculado. A Figura 1 mostra resultados representativos de espectrais para NAR-BSA22, que...

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Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Este artigo fornece um protocolo detalhado para a preparação e avaliação de anticorpos monoclonais contra produtos naturais para uso em diversos imunoensaios. Esse procedimento inclui imunização, fusão celular, indirecto ELISA competitivo para clone positivo triagem e preparação de hibridoma monoclonal. As especificações para a caracterização de anticorpo usando análises de ELISA e MALDI-TOF-MS também são fornecidas.

Geração de anticorpos monoclonais contra produtos naturais

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Anticorpos monoclonais são conhecidos como anticorpos monoespecículos que são produzidos a partir de um único clone de linfócito B e os anticorpos monovalentes que se ligam ao mesmo epítope. Recentemente, a ELISA baseada em anticorpos monoclonais tornou-se nossa plataforma emergente para a análise qualitativa ou quantitativa de alimentos ou produtos naturais. Este método é um método preciso, sensível e eficaz sem passos tediosos de pré-tratamento.Então esse é o essencial para amostras biológicas e futuras aplicações clínicas. A preparação dos mABs de TCM é um passo vital nos estudos sobre características complexas do sistema da fórmula TCM. Desenvolvemos um protocolo para gerar mABs contra os pequenos compostos moleculares, incluindo síntese de antígenos artificiais, imunização de camundongos e fusão celular.O hapten está conectado com a proteína portadora para sintetizar o antígeno artificial. Antígeno artificial e adjuvantes completos são misturados e emulsionados. O rato foi imunizado por injeção subcutânea.Tire o baço do rato imunizado e faça suspensão unicelular. Misture as células do mieloma. Esplenócitos são isolados e fundidos com linha celular de mieloma de camundongo sensível ao CHAPÉU pelo método PEG.Selecione uma linha celular capaz de preparar anticorpos pela ELISA. Hybridomas secretando anticorpos monoclonais que são reativos ao antígeno são clonados. Estabeleça que a linha celular hybridoma é criopreservada.O procedimento de oxidação periodato foi utilizado para a síntese de um conjugado BSA de narigina. Em primeiro lugar, a narigina foi dissolvida em uma concentração final de um miligrama por mililitro a 100 microliters de solução de pariodato de sódio recém-preparada para cinco mililitros da solução de narigina. Mexa a mistura em temperatura ambiente por uma hora.Em segundo lugar, adicione dois mililitros de proteína portadora à mistura de reação periodato de sódio narigina. Ajuste a mistura para a solução pH nove e continue reagindo por seis a oito horas. Em terceiro lugar, o antígeno artificial foi purificado com o método de diálise em PDS por três dias para afastar o CBS.O adjuvante completo de Freund e o adjuvante incompleto foram utilizados para a imunização do camundongo. Para a vacinação, misture 50 microgramas de conjugado com um volume igual do adjuvante completo de Freund e emulsione completamente. Administrar 100 microgramas desta mistura a cada rato BALB/c através de injeção subcutânea dorsal.Entregue uma vacina de reforço através de injeção subcutânea duas semanas depois com a mesma quantidade de conjugado misturado com adjuvante incompleto. Para a imunização primária, o adjuvante completo de Freund e o imunogênio foram usados por injeção subdérmica. Para a imunização do reforço, o adjuvante incompleto de Freund e o imunogênio foram usados por injeção subdérmica.Para a imunização de impacto sem adjuvante, apenas o imunogênio foi utilizado por injeção subdérmica ou injeção intraperineal. As células da camada alimentar originaram-se principalmente de células epiteliais abdominais ou macrófagos. RPMI 1640 FBS e HAT foram usados para preparar o meio de tela HAT.O suplemento HAT foi dissolvido em 10 mililitros RPMI, depois adicionado em 500 mililitros RPMI 1640 contendo 20% de FBS. E o rato ICR foi esterilizado por 75% de álcool etílico por cinco minutos. Depois de remover a pele do abdômen com fórceps hemostáticos, desinfete a área com 75% de etanol.Corte a pele externa para expor a cavidade abdominal. Injete três mililitros de meio RPMI 1640 estéreis no abdômen. Em seguida, massageie o abdômen para desprender células adicionais na solução.Aspire a suspensão da célula fetal em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Depois de centrifugar a suspensão celular por 10 minutos a 1.000g, descarte o supernasce e suspenda as células fetais para obter suspensão de célula única. Após este procedimento, dissolva as células usando o meio HAT.Conte as células para fazer 100.000 por mililitro de membros da célula. Transfira as células para 96 placas de cultura celular. Incubar as placas durante a noite a 37 graus, 5% de dióxido de carbono.O camundongo imunizado escolhido foi esterilizado por 75% de álcool etílico por cinco minutos. Aspirar RPMI 1640 médio como o tampão de lavagem. Remova a pele e o tecido muscular usando uma tesoura para expor o baço.Isole o baço pelas pinças com cuidado. Em seguida, lave o baço no RPMI 1640. Isole o baço e corte em pedaços.Bata lentamente o baço. Em seguida, foi tratado com um meio RMPI 1640 para dissolver as células para preparar uma suspensão de células de baço. Depois disso, as células foram filtradas por 800 coador de células de malha.Pregue o baço cuidadosamente para remover os tecidos grandes. Evitar grandes tecidos influenciam a fusão das células. Foi a suspensão da célula do baço com meio RPMI 1640.Em seguida, a suspensão celular foi adicionada no tubo centrífuga. Colher as células do baço por centrífugação a 1.000g por 10 minutos. E depois descarte o supernatante.As células do baço deveriam estar no valor de um bilhão a 10 bilhões. Remova as células de mieloma cultivadas e amplificadas da incubadora e agite suavemente o frasco para obter uma suspensão celular. Foi a suspensão com RPMI duas vezes.Misture a suspensão da célula do baço e as células de mieloma. Conte as células e ajuste a concentração. A ração final das células do baço para as células de mieloma deve ser de 1 a 5 a 10.Centrifugar a mistura celular e, em seguida, remover o supernante. Adicione um mililitro de solução glicol de polietileno de 50% às células e mexa suavemente a 37 graus por um minuto. Em pé por 30 segundos, adicione dois mililitros de RPMI 1640 médio e incubar a 37 graus por dois minutos para terminar a reação.Adicione em dois mililitros RPMI por mais um minuto. Em seguida, adicione em 10 mililitros RPMI 1640. Centrífuga a 800g por 10 minutos.Descartando o supernasce, adicione a solução HAT e continue a cultivar as células por sete dias a 37 graus 5% de dióxido de carbono. Após sete dias, os supernacantes celulares em 96 placas de poço foram aspirados após a fusão celular e adicionados em placas ELISA pré-revestidas com antígeno de revestimento. Cultivado a 37 graus por uma hora, o anticorpo secundário foi adicionado e cultivado por meia hora.Depois de adicionar 100 microliters de solução de substrato. Pare com a reação. Para as placas ELISA no leitor de microplacas, utilizou-se o método de ponto final lido os dados em 450 nanômetros.Absorvente medido a 450 nanômetros e tela os híbridos positivos. Use o método de diluição limitante para preparar os híbridos monoclonais. Depois de remover o meio HD dos híbridos selecionados, suspenda as células em RPMI 1640 e conte-as.Diluir as células de uma concentração de uma célula, duas células e quatro células por poço por RPMI 1640 em uma placa e cultura de 96 poços. Transfira células dos híbridos que são positivas para 24 placas de poço, frascos de 25 e 75 centímetros quadrados para cultivo. Armazene as miodomias em uma caixa de resfriamento de gradiente a menos 80 graus por 24 horas.Em seguida, transfira para nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo. Titer de antiserums foi determinado por ELISA indireta. O rato de um a quatro foi imunizado com conjugado narigin BSA foi significativamente maior do que o rato de controle sem imunização.O título de 1 a 5.000 é difusão suficiente. O peso molecular do conjugado hapten foi confirmado pela análise MALDI-TOF. Como mostrado na figura dois, como um peso molecular do padrão BSA e narigina têm sido conhecidos, podemos calcular e determinar que as moléculas de narigina foram conjugadas com BSA.Apenas o hibridoma pode sobreviver e crescer na mídia de seleção hat. Após sete dias de crescimento, a cultura celular pode ser testada pela ELISA. Os híbridos positivos foram reinspetados e expandidos.Estas imagens mostram o resultado convencional para linhas celulares monoclonais e policlonais de hybridoma. O ponto crítico deste experimento é a triagem dos mAbs específicos para o hapten, mas não a proteína portadora. A especificidade do MAB foi então examinada na presença de outros compostos estruturalmente relacionados.A reatividade cruzada foi calculada para avaliar a especificidade do MAB para o antígeno. A curva de calibração da naringina e da faixa do forro foram obtidas. Os híbridos monoclonais específicos de antígeno foram expandidos e criopreservados em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.Depois de assistir a este vídeo, espero que você tenha um bom entendimento de como gerar anticorpos monoclonais contra um pequeno composto molecular. Então isso é tudo. Obrigado por sua observação e boa sorte para suas experiências.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Administração passiva de anticorpos monoclonais contra H. capsulatum E outros patógenos fúngicos

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Análise quantitativa de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas Virais e neuraminidases usando anticorpos Universal em Ensaios Blot simples slot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Um parasita Ensaio de Resgate e Transformação de Triagem leishmanicida contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotas em THP1 linha celular humana aguda Monocytic Leucemia

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Tratamento de produtos de plaquetas com riboflavina e luz UV: Eficácia Contra alta Titer contaminação bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Geração de IgG Humana Recombinante de Anticorpos Monoclonais As células seleccionadas a partir de B imortalizadas

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Medição de Inibição da Neuraminidase Influenza títulos de anticorpos por Enzyme-linked Lectina Ensaio

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Geração de variantes de fuga de neutralizar os anticorpos monoclonais de vírus da gripe

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Geração dos anticorpos monoclonais humanos discriminativa de rara B antígeno-específicas células circulantes no sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigênicos lipossomas para a geração de anticorpos específicos de doença

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...