Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Эта работа была поддержана Фонд национального естественных наук Китая (Грант номера 81573573, 81473338 и 81503344) и классического рецепта основной исследовательской группы в Пекинском университете китайской медицины.

Все животные процедуры выполняется в этом исследовании были одобрены этическим Комитетом по рассмотрению на Пекинский университет китайской медицины (утверждение номер 2016BZYYL00109).
Примечание: Женский BALB/c мышей (8 недель) были иммунизированы с конъюгатов белков Гаптены пе...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Здесь мы представляем собой протокол для успешного производства mAbs против натуральных продуктов, полученных малых молекул. Основные шаги в процедуре были изложены, и мы продемонстрировали полезность этого протокола, с помощью NAR как пример маленькой молекулы. Пример спектры, реактивн?...

Моноклональные антитела (mAbs), также известный как моно специфические антитела, производятся из одного клонов лимфоцитов и состоят из моновалентной антител, что все привязки к же эпитоп1. В последние годы множество лекарственных растений, полученных натуральные продукты используются в лечении различных заболеваний2. Действительно многие малые высокомолекулярных соединений, первоначально полученных от натуральных продуктов теперь применяются в качестве первой линии препаратов, таких как артемизинина для малярии и paciltaxel (Таксол) для рака2,3. Изучение природных продуктов достигнут быстрый прогресс, во многом благодаря огромным развития и оптимизации обычных анализа методов, включая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и масс-спектрометрия (МС). Однако есть еще некоторые ограничения, связанные с этими методами, например их сложные протоколы предварительной и связанные с этим расходы в отношении времени, труда/опыт и необходимые инструменты4.
Недавно МАБ основе иммуноферментного анализа (ELISAs) были применены и количественно и качественно проанализировать питание и натуральные продукты. В самом деле этот метод был применен для анализа биологических образцов и клинических испытаний и было показано, чтобы быть точным, чувствительной и высокоэффективных также избегая утомительной предварительной шаги, связанные с другими анализы5, 6.
При использовании на основе МАБ ELISAs изучить комплекс натуральных продуктов, подготовка моноклональных антител является одним из основных шагов. К сожалению mAbs, характерных для малых биологически активных компонентов, присутствующих в этих видов веществ6,,78,9,10,11,12 ,13,,1415 часто ограничены по сравнению с белков антигенов. Чтобы обойти эту проблему, мы разработали протокол к специально генерировать mAbs против малых соединений. Протокол, представленные здесь включает в себя синтез искусственных антигена, мыши иммунизации, слияние клеток, косвенные конкурентные ELISA и моноклональных гибридомной подготовки.
В частности Наша исследовательская группа изучения формирования mAbs против мелких биоактивных соединений из традиционных китайских лекарственных средств и лет разработкой их приложений. В наших исследованиях продолжается мы разработали mAbs против baicalin16, puerarin17, глицирризиновой кислоты18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121и многих других малых молекул. Наши ELISA протоколы, основанные на этих mAbs были использованы в ряде исследований для оценки фармакокинетики этих маленьких молекул, а также их взаимодействия с другими биологически активных соединений. Кроме того использование этих mAbs, мы также разработали иммуноаффинной хроматографии методов для разделения структурных аналогов, в том числе спектральными. Недавно мы подготовили иммуноанализа бокового потока, используя наши МАБ анти puerarin, который впоследствии используется для быстрого, на месте обнаружения этого соединения. Наши результаты показывают, что наш МАБ основе анализов являются незаменимым и удобные инструменты для изучения биологии и качества природных продуктов, полученных соединений, особенно те, которые используются в традиционной китайской медицины.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

Анализ биологически активных компонентов, присутствующих в продукты и натуральные продукты стал популярным области исследования во многих областях, включая традиционной китайской медицины и пищевой безопасности/токсикология. Многие из методов классического анализа требуют дорогостоящего оборудования или опыта. В частности энзим соединенный иммуноферментного анализа (ELISAs) стали возникающих метод для анализа продуктов и натуральных продуктов. Этот метод основан на обнаружении антител опосредованной целевых компонентов. Однако, как многие из биологически активных компонентов в природных продуктах малы (< 1000 да) и не вызывают иммунный ответ, создание моноклональных антител (mAbs) против них часто бывает трудно. В этом протоколе мы предоставляем подробное описание шагов, необходимых для создания mAbs против молекулы-мишени, а также те, которые необходимы для создания связанного косвенные конкурентные (ic) ELISA для быстрого анализа соединения в нескольких образцах. Процедура описывает синтез искусственных антигена (т.е., сопряженное Гаптены перевозчик), иммунизации, слияние клеток, моноклональных гибридомной подготовки, квалификация МАБ и на базе ИФА применение МАБ. Сопряженное Гаптены перевозчик был синтезирован натрия Периодат метод и оценены MALDI-TOF-МС. После иммунизации, splenocytes были изолированы от иммунизированная мышь с высокий титр антител и сливается с гипоксантин аминоптерин тимидина (HAT) - линия клетки миеломы чувствительных мыши Sp2/0 - Ag14 с помощью полиэтиленгликоля (PEG)-на основе метода. Hybridomas секреции mAbs реактивной целевой антигена были экранированы, icELISA специфику и перекрестной реактивности. Кроме того ограничение разведения был применен подготовить моноклональных hybridomas. Окончательный mAbs были также характеризуется icELISA и затем использовать в приложении на основе ELISA для быстрого и удобного обнаружения пример Гаптены (нарингин (нар)) в натуральных продуктов.

Поколение hybridomas моноклональных
Молекулярная масса конъюгата Гаптены перевозчик был подтвержден MALDI-TOF-MS анализа. Как молекулярный вес BSA и нар, как известно, может быть рассчитано количество маленьких молекул, конъюгированных...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Эта статья содержит подробный протокол для подготовки и оценки моноклональных антител против натуральных продуктов для использования в различных иммуноанализа. Эта процедура включает в себя иммунизации, слияние клеток, косвенные конкурентные ELISA для положительных клон скрининг и моноклональных гибридомной подготовки. Спецификации для характеризации антитела используя MALDI-TOF-MS и анализа ELISA также предоставляются.

Поколение моноклональных антител против натуральных продуктов

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Моноклональные антитела известны как моноспецифические антитела, которые вырабатываются из одного клона B-лимфоцитов и моновалентных антител, которые связываются с тем же эпитопом. В последнее время моноклональные антитела на основе ELISA стала нашей новой платформой для качественного или количественного анализа пищевых продуктов или натуральных продуктов. Этот метод является точным, чувствительным и эффективным методом без утомительных шагов предварительной обработки.Так что это необходимо для биологических образцов и будущих клинических применений. Подготовка МАБ ТКМ является жизненно важным шагом в изучении сложных системных характеристик формулы ТКМ. Мы разработали протокол для генерации mABs против небольших молекулярных соединений, включая синтез искусственного антигена, иммунизацию мышей и слияние клеток.Хаптен связан с белками носителя для синтеза искусственного антигена. Искусственный антиген и полные адъюванты смешиваются и эмульгируется. Мышь была иммунизирована подкожной инъекцией.Вынюхив селезенку иммунизированной мыши и сделайте одноклеточную подвеску. Смешайте клетки миеломы. Спеноциты изолированы и сливаются с чувствительной к HAT линией клеток миеломы мыши методом PEG.Выберите клеточную линию, способную подготовить антитела ELISA. Гибридомы, сеющие моноклональные антитела, которые реагируют на антиген, клонируются. Установить линию клеток гибридомы криоконсервировано.Процедура окисления периодата была использована для синтеза narigin BSA конъюгации. Во-первых, наригин растворялся при конечной концентрации одного миллиграмма на миллилитр при 100 микролитров свежеприготовленного раствора натрия до пяти миллилитров наригинового раствора. Перемешать смесь при комнатной температуре в течение одного часа.Во-вторых, добавьте два миллилитров белка носителя в смесь реакции наригина натрия. Отрегулируйте смесь до рН девять раствора и продолжать реагировать в течение шести-восьми часов. В-третьих, искусственный антиген был очищен методом диализа в PDS в течение трех дней, чтобы отлягтить CBS.Полный адъювант и неполный адъювант Фрейнд были использованы для иммунизации мышей. Для вакцинации смешайте 50 микрограммов конъюгации с равным объемом полного адъюванта Фрейнд и полностью омитете. Администрирование 100 микрограммов этой смеси для каждого BALB / C мыши через спинной подкожной инъекции.Доставка бустерной вакцинации с помощью подкожной инъекции две недели спустя с тем же количеством конъюгата, смешанного с неполным адъювантом. Для первичной иммунизации, Фрейнд полный адъювант и иммуноген были использованы с помощью поддермальной инъекции. Для бустерной иммунизации, неполный адъювант Фрейнд и иммуноген были использованы с помощью поддермальной инъекции.Для ударной иммунизации без адъюванта использовались только иммуногены с помощью поддермальной инъекции или внутриперинальной инъекции. Клетки кормового слоя в основном возникли из брюшных эпителиальных клеток или макрофага. RPMI 1640 FBS и HAT были использованы для подготовки СРЕДы экрана HAT.ДОПОЛНЕНИЕ HAT растворяется в 10 миллилитров RPMI среды, а затем добавил в 500 миллилитров RPMI 1640, содержащий 20%FBS. А мышь МЦР была стерилизована 75%-ным этиловый спирт в течение пяти минут. После удаления меха из брюшной полости с гемостатических типсов, дезинфицировать область с 75%этанола.Вырежьте внешнюю кожу, чтобы разоблачить брюшную полость. Введать три миллилитров стерильных RPMI 1640 среды в живот. Затем массируйте живот, чтобы отделить дополнительные клетки в раствор.Аспирировать подвеску клетки плода в 15 миллилитровую центрифугу. После центрифугирования клеточной суспензии в течение 10 минут при 1000г, отбросьте супернатант и повторно приостановьте клетки плода, чтобы получить одноклеточную суспензию. После этой процедуры растворите клетки с помощью среды HAT.Подсчитайте клетки, чтобы сделать их 100 000 на миллилитр от членов ячейки. Передача клеток в 96 хорошо пластины культуры клеток. Инкубировать пластины на ночь при 37 градусах, 5%углекислого газа.Выбранная иммунизированная мышь была стерилизована на 75% этилового спирта в течение пяти минут. Аспират RPMI 1640 среды в качестве стирального буфера. Удалите кожу и мышечную ткань с помощью ножниц, чтобы разоблачить селезенку.Изолировать селезенку пинцетом тщательно. Затем мыть селезенку в RPMI 1640. Изолировать селезенку и разрезать на кусочки.Медленно фунт селезенки. Затем он был обработан RMPI 1640 среды для растворения клеток для подготовки селезенки клеточной подвески. После этого клетки были отфильтрованы 800 сетчатым клеточным ситечком.Ногти селезенки тщательно удалить большие ткани. Избежание больших тканей влияет на слияние клеток. Была подвеска клетки селезенки с RPMI 1640 среды.Затем подвесной клетки был добавлен в центрифугу трубки. Урожай клеток селезенки путем центрифугации на 1000г в течение 10 минут. А потом отбросить супернатант.Клетки селезенки должны были быть на сумму от одного миллиарда до 10 миллиардов. Удалите культивируемые и усиленные клетки миеломы из инкубатора и аккуратно встряхните колбу, чтобы получить подвес клетки. Была подвеска с RPMI дважды.Смешайте подвеску клеток селезенки и клетки миеломы. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию. Окончательный рацион клеток селезенки к клеткам миеломы должен быть от одного до пяти к одному до 10.Центрифуга клеточной смеси, а затем удалить супернатант. Добавьте в клетки один миллилитр 50%полиэтиленгликольного раствора и аккуратно перемешайте при 37 градусах в течение одной минуты. Стоя в течение 30 секунд, добавить два миллилитров RPMI 1640 среды и инкубировать при 37 градусов в течение двух минут, чтобы прекратить реакцию.Добавить в два миллилитров RPMI еще на одну минуту. Затем добавьте в 10 миллилитров RPMI 1640. Центрифуга при 800г в течение 10 минут.Отбрасывая супернатант, добавьте раствор HAT и продолжайте культивировать клетки в течение семи дней при 37 градусах 5%углекислого газа. После семи дней, клеточные супернатанты в 96 пластин хорошо были аспирированы после слияния клеток и добавлены в пластины ELISA предварительно покрыты покрытием антигена. Культивируемые при 37 градусах в течение одного часа, вторичные антитела были добавлены и культивированы в течение получаса.После добавления 100 микролитров субстратного раствора. Остановите реакцию. Для пластин ELISA в считыватель микропластичек использовался метод конечной точки для чтения данных на 450 нанометров.Измеренное поглощение на 450 нанометров и экран положительных гибридом. Используйте ограничивающий метод разбавления для подготовки моноклональных гибридом. После удаления HD среды из выбранных гибридом, повторно приостановить клетки в RPMI 1640 и считать их.Разбавить клетки концентрации одной клетки, двух клеток и четырех клеток на колодец RPMI 1640 в 96 хорошо пластины и культуры. Передача клеток из гибридом, которые являются положительными для 24 пластин хорошо, 25 и 75 квадратных сантиметров колбы для выращивания. Храните миодомы в градиентной коробке охлаждения при температуре минус 80 градусов в течение 24 часов.Затем перенесите на жидкий азот для длительного хранения. Titer антисерумов были определены косвенным ELISA. Мышь от одного до четырех была иммунизирована с narigin BSA конъюгат был значительно выше, чем мышь управления без иммунизации.Рейтер от одного до 5000 является достаточным диффузии. Молекулярный вес конъюгата гаппена был подтвержден анализом MALDI-TOF. Как показано на рисунке два, как молекулярный вес стандарта BSA и наригин были известны, мы можем вычислить и определить, что молекулы наригина были спряжены с BSA.Только гибридома может выжить и расти в HAT выбора средств массовой информации. После семи дней роста, культура клеток может быть проверена ELISA. Положительные гибридомы были повторно клонированы и расширены.Эти изображения показывают обычный результат для стабильных моноклональных и поликлональных линий клеток гибридомы. Критическим моментом этого эксперимента является скрининг mAbs, специфичных для hapten, но не несущего белка. Специфика mAb затем были изучены в присутствии других структурно связанных соединений.Перекрестная реактивность была рассчитана для оценки специфичности mAb для антигена. Получена кривая калибровки нарингин и диапазон лайнера. Антигенные моноклональные гибридомы были расширены и криоконсервированы в жидком азоте для длительного хранения.После просмотра этого видео, я надеюсь, у вас есть хорошее понимание того, как генерировать моноклональные антитела против небольших молекулярных соединений. Вот и все. Спасибо за просмотр и удачу в ваших экспериментах.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Пассивный Администрации моноклональных антител против H. capsulatum И другие грибным патогенам

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Количественный анализ всех гриппа типа Вирусный Hemagglutinins и нейраминидазы использованием универсального антител в простом Анализы Blot Слот

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Анализ паразитов спасению и преобразованию Antileishmanial для скрининга против внутриклеточных<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes в THP1 человека Острые линии моноцитов клеточной лейкемии

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Лечение тромбоцитов Продукты с рибофлавин и УФ света: эффективность против высокий титр бактериального загрязнения

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Генерация рекомбинантного человеческого IgG моноклональных антител из иммортализованных клеток Сортировка В

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Измерение гриппа нейраминидазы ингибирования Титры антител методом ферментативного лектина Пробирной

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Генерация мышиных моноклональных антител с помощью гибридом технологии

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Поколение побег вариантов нейтрализующих антител моноклональных вирус гриппа

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Поколение дискриминационных человеческих моноклональных антител от редких антиген специфические клетки, циркулирующие в крови

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Антигенные липосом для поколения болезни специфические антитела

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...