Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (números de concesión 81573573, 81473338 y 81503344) y la clásica receta básica equipo de investigación en la Universidad de Beijing de Medicina China.

Todos los procedimientos animales realizados en este estudio han sido aprobados por el Comité de revisión ética de la Universidad de Beijing de Medicina China (2016BZYYL00109 número de aprobación).
Nota: Ratones hembra BALB/c (8 semanas) fueron inmunizados con hapteno-portador proteína conjugados. Cuando se utiliza solo, una pequeña molécula (< 1.000 Da) puede provocar una respuesta inmune. Sin embargo, conjugando la molécula pequeña a un portador de la macromolécula los resultados ...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Aquí, presentamos un protocolo para la producción exitosa de mAbs contra moléculas pequeñas derivadas de productos naturales. Los pasos esenciales en el procedimiento han sido descritos, y hemos demostrado la utilidad de este protocolo utilizando NAR como una molécula pequeña de ejemplo. Los espectros de ejemplo, análisis de reactividad y icELISA resultados muestran representante experimental y datos de control que se obtuvieron mediante este protocolo. Imágenes de ejemplo de los hibridomas proporcionan una repre...

Anticuerpos monoclonales (mAbs), también conocido como mono específicos anticuerpos, producidos a partir de un solo clon de linfocitos b y se componen de anticuerpos monovalentes que se unen al mismo epitopo1. En los últimos años, muchos productos naturales derivados de plantas medicinales se han utilizado en el tratamiento de diversas enfermedades2. De hecho, muchos compuestos moleculares pequeños originalmente derivados de productos naturales se aplican ahora como medicamentos de primera línea, como la artemisinina contra la malaria y paciltaxel (taxol) para cáncer2,3. El estudio de productos naturales ha hecho progreso rápido, en gran parte debido al enorme desarrollo y optimización de técnicas convencionales de análisis, como cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y espectrometría de masas (MS). Sin embargo, todavía existen algunas limitaciones asociadas con estos métodos, como sus protocolos de tratamiento complejos y costes asociados en tiempo, mano de obra/experiencia y requiere instrumentos4.
Recientemente, se han aplicado análisis de mAb-basado enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) cualitativa y cuantitativamente analizar alimentos y productos naturales. De hecho, este método se ha aplicado para el análisis de muestras biológicas y pruebas clínicas y se ha demostrado para ser precisos, sensibles y altamente eficiente, también evitando los tediosos pasos pretratamiento asociados con otros análisis5, 6.
Cuando se utiliza a Elisa mAb-basado para el estudio de productos naturales complejos, preparación de los anticuerpos monoclonales es uno de los pasos fundamentales. Por desgracia, los mAbs específicos de los pequeños componentes bioactivos presentes en estos tipos de sustancias6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 a menudo son limitados en comparación con los antígenos de la proteína. Para evitar este problema, hemos desarrollado un protocolo para generar específicamente mAbs contra pequeños compuestos. El protocolo que presentamos incluye síntesis antígeno artificial, inmunización del ratón, fusión celular, ELISA competitiva indirecto y preparación de hibridomas monoclonal.
En particular, nuestro grupo de investigación ha sido estudiar la formación de mAbs contra pequeños compuestos bioactivos de la medicina tradicional China y sus aplicaciones durante años. En nuestros estudios en curso, hemos desarrollado mAbs contra Baicalina16, puerarin17, ácido glicirrícico18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121y muchas otras moléculas pequeñas. Nuestros protocolos de ELISA basadas en estos mAbs se han utilizado en varios estudios para evaluar la farmacocinética de estas pequeñas moléculas, así como sus interacciones con otros compuestos bioactivos. Por otra parte, utilizando estos mAbs, también hemos desarrollado métodos de cromatografía de inmunoafinidad para la separación de análogos estructurales, incluidos los epímeros. Recientemente, hemos preparado un inmunoensayo de flujo lateral utilizando nuestro mAb anti-puerarin que posteriormente fue utilizado para la detección rápida, en el sitio de este compuesto. Nuestros resultados indican que nuestros ensayos de mAb son herramientas indispensables y convenientes para el estudio de la biología y la calidad de los compuestos derivados de productos naturales, particularmente los utilizados en la medicina tradicional China.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

El análisis de los componentes bioactivos presentes en los alimentos y productos naturales se ha convertido en una popular zona de estudio en muchos campos, incluyendo tradicional China medicina y alimentos seguridad/Toxicología. Muchas de las técnicas de análisis clásicas requieren equipo costoso o conocimientos. En particular, análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) se han convertido en un método emergente para el análisis de alimentos y productos naturales. Este método se basa en la detección de anticuerpo-mediada de los componentes de destino. Sin embargo, como muchos de los componentes bioactivos en productos naturales son pequeños (< 1.000 Da) y no se debe inducir una respuesta inmune, creación de anticuerpos monoclonales (mAbs) contra ellos es a menudo difícil. En este protocolo, brindamos una explicación detallada de los pasos necesarios para generar mAbs contra moléculas Diana así como los necesarios para crear los asociados indirectos competitiva (ic) ELISA para el análisis rápido del compuesto en muestras múltiples. El procedimiento describe la síntesis del antígeno artificial (es decir, el conjugado hapteno-carrier), inmunización, fusión celular, preparación de hibridomas monoclonal, caracterización de la mAb y la aplicación basada en ELISA del mAb. El conjugado hapteno-carrier fue sintetizado por el sodio periodato método y evaluado por MALDI-TOF-MS. Después de la inmunización, esplenocitos fueron aislados de ratón inmunizado con el más alto título del anticuerpo y se fundió con la hipoxantina-aminopterina-timidina (sombrero) - línea de celular de mieloma de ratón sensible Sp2/0 - Ag14 con un polietilenglicol (PEG)-método basado en. Los hibridomas secretoras de mAbs reactivo para el antígeno de la blanco fueron defendidos por icELISA de especificidad y reactividad cruzada. Además, se aplicó el método de dilución limitante para preparar monoclonales hibridomas. Los mAbs finales se caracteriza por icELISA y entonces utilizados en una aplicación de ELISA para la detección rápida y conveniente de hapteno ejemplo (naringina (NAR)) en productos naturales.

Generación de hibridomas monoclonales
El peso molecular de la conjugación hapteno-carrier fue confirmado por el análisis por MALDI-TOF-MS. Como se conoce el peso molecular de BSA y el NAR, podría calcularse el número de pequeñas moléculas conjugadas con BSA. La figura 1 muestra resultados representativos espectrales para NAR-BSA22, q...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Este artículo proporciona un protocolo detallado para la preparación y evaluación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales para su uso en inmunoensayos diferentes. Este procedimiento incluye vacunación, fusión celular, indirecta ELISA competitivo para clon positiva proyección y preparación de hibridomas monoclonal. También se proporcionan las especificaciones para la caracterización de anticuerpos mediante MALDI-TOF-MS y los análisis de ELISA.

Generación de anticuerpos monoclonales contra productos naturales

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Los anticuerpos monoclonales se conocen como anticuerpos monoespecíficos que se producen a partir de un único clon de linfocitos B y los anticuerpos monovalentes que se unen al mismo epítopo. Recientemente, el ELISA basado en anticuerpos monoclonales se ha convertido en nuestra plataforma emergente para el análisis cualitativo o cuantitativo de alimentos o productos naturales. Este método es un método preciso, sensible y eficaz sin pasos de pretratamiento tediosos.Así que eso es lo esencial para las muestras biológicas y las futuras aplicaciones clínicas. La preparación de los mAR de la MTC es un paso vital en los estudios sobre las características complejas del sistema de la fórmula de la MTC. Hemos desarrollado un protocolo para generar mABs contra los pequeños compuestos moleculares, incluyendo la síntesis de antígenos artificiales, la inmunización con ratones y la fusión celular.El hapten está conectado con la proteína portadora para sintetizar el antígeno artificial. El antígeno artificial y los adyuvantes completos se mezclan y emulsionan. El ratón fue inmunizado por inyección subcutánea.Saque el bazo del ratón inmunizado y haga la suspensión de una sola célula. Mezclar las células del mieloma. Los splenocitos se aíslan y se fusionan con la línea celular de mieloma de ratón sensible al HAT por método PEG.Seleccione una línea celular capaz de preparar anticuerpos mediante ELISA. Los hibridos que segregan anticuerpos monoclonales que son reactivos al antígeno se clonan. Establecer la línea celular de hibridoma es crioconservada.Se utilizó un procedimiento de oxidación periodato para la síntesis de un conjugado de narigin BSA. En primer lugar, la narigina se disolvió a una concentración final de un miligramo por mililitro a 100 microlitros de solución de pariodato sódico recién preparada a cinco mililitros de la solución de narigin. Revuelva la mezcla a temperatura ambiente durante una hora.En segundo lugar, añadir dos mililitros de proteína portadora a la mezcla de reacción periodoto de narigin sódico. Ajuste la mezcla a pH nueve solución y continúe reaccionando durante seis a ocho horas. En tercer lugar, el antígeno artificial fue purificado con el método de diálisis en PDS durante tres días para distanciar la CBS.El adyuvante completo de Freund y el adyuvante incompleto se utilizaron para la inmunización del ratón. Para la vacunación, mezclar 50 microgramos de conjugado con un volumen igual del adyuvante completo de Freund y emulsionar completamente. Administrar 100 microgramos de esta mezcla a cada ratón BALB/c mediante inyección subcutánea dorsal.Proporcione una vacuna de refuerzo mediante inyección subcutánea dos semanas más tarde con la misma cantidad de conjugado mezclado con adyuvante incompleto. Para la inmunización primaria, el adyuvante completo y el inmunogen completos de Freund se utilizaron mediante inyección subdérmica. Para la inmunización de refuerzo, el adyuvante incompleto de Freund y el inmunogen se utilizaron mediante inyección subdérmica.Para la inmunización de impacto sin adyuvante, sólo se utilizó inmunogen mediante inyección subdérmica o inyección intraperineal. Las células de la capa de alimentación se originaron principalmente a partir de células epiteliales abdominales o macrófagos. RPMI 1640 FBS y HAT se utilizaron para preparar el medio de pantalla HAT.Suplemento de HAT se disolvió en 10 mililitros RPMI medio, luego añadido en 500 mililitros RPMI 1640 que contiene 20%FBS. Y el ratón ICR fue esterilizado por 75% alcohol etílico durante cinco minutos. Después de retirar el pelaje del abdomen con fórceps hemostáticos, desinfecte el área con 75% de etanol.Corte la piel externa para exponer la cavidad abdominal. Inyecte tres mililitros de RPMI estéril 1640 medio en el abdomen. Luego masajee el abdomen para separar células adicionales en la solución.Aspirar la suspensión de la célula fetal en un tubo centrífugo de 15 mililitros. Después de centrifugar la suspensión celular durante 10 minutos a 1.000 g, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender las células fetales para obtener la suspensión de una sola célula. Después de este procedimiento, disuelva las células utilizando el medio HAT.Cuente las células para que sean 100.000 por mililitro de los miembros de la célula. Transfiera las células a 96 placas de cultivo celular de pozo. Incubar las placas durante la noche a 37 grados, 5% dióxido de carbono.El ratón inmunizado elegido fue esterilizado por 75% de alcohol etílico durante cinco minutos. Aspirar el medio RPMI 1640 como tampón de lavado. Retire la piel y el tejido muscular usando tijeras para exponer el bazo.Aísle el bazo con cuidado de las pinzas. A continuación, lave el bazo en la RPMI 1640. Aísle el bazo y corte en pedazos.Lentamente golpea el bazo. Luego se trató con un medio RMPI 1640 para disolver las células para preparar una suspensión de la célula del bazo. Después de eso, las celdas fueron filtradas por 800 cepas de celdas de malla.Clava el bazo cuidadosamente para extirpar los tejidos grandes. Evitar grandes tejidos influye en la fusión de las células. Fue la suspensión de la célula del bazo con RPMI 1640 medio.Luego se añadió la suspensión celular en el tubo de centrífuga. Cosecha las células del bazo por centrifugación a 1.000 g durante 10 minutos. Y luego desecha el sobrenadante.Se suponía que las células del bazo estaban en la cantidad de mil millones a 10 mil millones. Retire las células de mieloma cultivadas y amplificadas de la incubadora y agite suavemente el matraz para obtener una suspensión celular. Fue la suspensión con RPMI dos veces.Mezclar la suspensión de la célula del bazo y las células del mieloma. Cuente las células y ajuste la concentración. La ración final de las células del bazo a las células del mieloma debe ser de uno a cinco a uno a 10.Centrifugar la mezcla celular y luego retirar el sobrenadante. Añadir un mililitro de 50% de solución de polietilenglicol a las células y agitar suavemente a 37 grados durante un minuto. De pie durante 30 segundos, añadir dos mililitros de RPMI 1640 medio e incubar a 37 grados durante dos minutos para terminar la reacción.Añadir en dos mililitros RPMI por otro minuto. A continuación, agregue en 10 mililitros RPMI 1640. Centrifugar a 800 g durante 10 minutos.Descartando el sobrenadante, añadir la solución HAT y continuar cultivando las células durante siete días a 37 grados 5%dióxido de carbono. Después de siete días, los sobrenadantes celulares en 96 placas de pozo fueron aspirados después de la fusión celular y añadidos en placas ELISA pre-revestidas con antígeno de recubrimiento. Cultivado a 37 grados durante una hora, se añadió y cultivó anticuerpo secundario durante media hora.Después de añadir 100 microlitros de solución de sustrato. Detengan la reacción. Para las placas ELISA en el lector de microplacas, se utilizó el método de punto final leer los datos a 450 nanómetros.Medición de la absorbancia a 450 nanómetros y criba los hibridomas positivos. Utilice el método de dilución limitante para preparar los hibridomas monoclonales. Después de retirar el medio HD de los hibridos seleccionados, vuelva a suspender las células en RPMI 1640 y contarlas.Diluir las células de una concentración de una célula, dos células y cuatro células por pozo por RPMI 1640 en una placa de 96 pozos y cultivo. Transfiera células de los hibridomas positivos a 24 placas de pozo, matraces de 25 y 75 centímetros cuadrados para el cultivo. Almacene los miodomas en una caja de enfriamiento de gradiente a menos 80 grados durante 24 horas.A continuación, transfiera a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. El título de los antisueros fue determinado por ELISA indirecto. El ratón uno a cuatro fue inmunizado con el conjugado de narigin BSA fue significativamente más alto que el ratón de control sin vacunarse.El título de uno a 5.000 es suficiente difusión. El peso molecular del conjugado hapten fue confirmado por el análisis MALDI-TOF. Como se muestra en la figura dos, como se conoce un peso molecular del estándar BSA y de narigin, podemos calcular y determinar que las moléculas de narigin se conjugaron con BSA.Sólo el hibrido puede sobrevivir y crecer en los medios de selección HAT. Después de siete días de crecimiento, el cultivo celular puede ser probado por ELISA. Los hibridomas positivos fueron re-clonados y expandidos.Estas imágenes muestran el resultado convencional para líneas celulares estables de hibridomo monoclonal y policlonal. El punto crítico de este experimento es el cribado de los mAbs específicos para el hapten, pero no la proteína portadora. La especificidad del mAb se examinó entonces en presencia de otros compuestos estructuralmente relacionados.La reactividad cruzada se calculó para evaluar la especificidad de mAb para el antígeno. Se obtuvieron la curva de calibración de la naringina y el rango de revestimiento. Los hibridomas monoclonales específicos del antígeno se expandieron y crioconservaron en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.Después de ver este video, espero que tengas una buena comprensión de cómo generar anticuerpos monoclonales contra un pequeño compuesto molecular. Así que eso es todo. Gracias por su observación y buena suerte para sus experimentos.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Administración pasiva de anticuerpos monoclonales contra H. capsulatum Y otros hongos patógenos

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Investigación

Inmunología e Infección

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

El análisis cuantitativo de todos Influenza Tipo A Hemaglutininas viral y neuraminidasas el uso de anticuerpos Universal en simples ensayos Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescate y Transformación de ensayo para la detección antileishmanial contra intracelular<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes en THP1 Humanos aguda línea celular de leucemia monocítica

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

El tratamiento de los productos de plaquetas con riboflavina y luz UV: Eficacia contra el alto título contaminación bacteriana

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Generación de recombinante humano IgG anticuerpos monoclonales a partir de células inmortalizadas B Ordenada

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generación de anticuerpos monoclonales murino por el hibridoma Tecnología

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generación de anticuerpos monoclonales humanos discriminativo de células B antígeno específicas raras circulan en sangre

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Liposomas antigénicos para la generación de anticuerpos específicos de la enfermedad

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...