Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Detta arbete stöds av den nationella naturvetenskap Foundation i Kina (grant nummer 81573573, 81473338 och 81503344) och klassiskt recept grundläggande forskargruppen vid Beijing University i kinesisk medicin.

Alla djur procedurer utförs i denna studie har godkänts av den etiska Review Committee vid Beijing University of kinesisk medicin (godkännande nummer 2016BZYYL00109).
Obs: Kvinnliga BALB/c-möss (8 veckor gamla) vaccinerades med hapten-carrier protein konjugat. När den används ensam, en liten molekyl (< 1 000 Da) kan inte framkalla ett immunsvar. Dock konjugera de liten molekylen till en transportör makromolekyl resulterar i antigen syntes. I detta sammanhang är den liten molekylen mär...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Här presenterar vi ett protokoll för den framgångsrika tillverkningen av mAbs mot naturliga produkt-derived små molekyler. De grundläggande stegen i förfarandet har beskrivits, och vi har visat nyttan av detta protokoll som använder NAR som ett exempel liten molekyl. Till exempel spectra, reaktivitet analyser och icELISA resultat visar alla representant experimentella och kontrolldata som erhålls med hjälp av detta protokoll. Exempel bilder av hybridomceller ger en visuell representation av vad forskaren ska let...

Monoklonala antikroppar (mAbs), även känd som mono-specifika antikroppar, produceras från en enda B-lymphocyte-klon och består av monovalenta antikroppar som alla binder till samma epitop1. Under de senaste åren har många vegetabiliska naturliga läkemedel använts vid behandling av olika sjukdomar2. Faktiskt, många små molekylära föreningar som ursprungligen härrör från naturliga produkter nu tillämpas som första linjens läkemedel, såsom artemisinin mot malaria och paciltaxel (taxol) för cancer2,3. Studier av naturliga produkter har gjort snabba framsteg, till stor del på grund av enorm utveckling och optimering av konventionella analystekniker, inklusive högpresterande vätskekromatografi (HPLC) och masspektrometri (MS). Det finns dock fortfarande vissa begränsningar som är associerade med dessa metoder, såsom deras komplexa förbehandling protokoll och tillhörande kostnader avseende tid, labor/expertis och nödvändiga instrument4.
MAb-baserade enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) har nyligen tillämpats för att kvalitativt och kvantitativt analysera mat och naturliga produkter. I själva verket, denna metod har tillämpats för både biologiska prover analys och kliniska tester och har visat sig vara korrekt, känslig och högeffektiva samtidigt också undvika de tråkiga förbehandling stegen i samband med andra analyser5, 6.
När du använder mAb-baserade Elisa för att studera komplexa naturliga produkter, är förberedelse av monoklonala antikroppar ett av de grundläggande stegen. Tyvärr, mAbs specifika för de små bioaktiva komponenterna i dessa typer av ämnen6,7,8,9,10,11,12 ,13,14,15 är ofta begränsade jämfört med proteinantigener. För att kringgå problemet, har vi utvecklat ett protokoll för att specifikt generera mAbs mot små föreningar. Det protokoll som presenteras här innehåller konstgjorda antigen syntes, mus immunisering, Cellfusion, indirekta kompetitivt ELISA och monoklonala Hybridomteknik förberedelse.
Bland annat har vår forskargrupp studera bildandet av mAbs mot små bioaktiva föreningar från traditionell kinesisk medicin och utveckla sina program i år. I vår pågående studier, har vi utvecklat mAbs mot baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic syra18, paeoniflorin19, ginsenosid Re20, ginsenosid Rh121och många andra små molekyler. Våra ELISA-protokoll baserat på dessa mAbs har använts i ett antal studier för att utvärdera farmakokinetiken av dessa små molekyler samt deras interaktioner med andra bioaktiva föreningar. Dessutom har använder dessa mAbs, vi också utvecklat immunoaffinity kromatografi metoder för separation av strukturella analoger, inklusive epimers. Nyligen har förberett vi en lateral flow immunoassay med användande av vår anti-puerarin mAb som användes därefter för snabb, hotellets detektion av denna förening. Våra resultat visar att våra mAb-baserade analyser är oumbärlig och bekvämt verktyg för att studera biologi och kvalitet av naturlig-produkt-härledda föreningar, särskilt de som används i traditionell kinesisk medicin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

Analysen av de bioaktiva komponenterna som förekommer i livsmedel och naturliga produkter har blivit ett populärt område i studien på många områden, inklusive traditionell kinesisk medicin och mat säkerhet/toxikologi. Många av de klassiska analysmetoder kräver dyr utrustning eller kompetens. Särskilt, blivit enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) en framväxande metod för analys av livsmedel och naturliga produkter. Denna metod är baserad på antikroppsmedierad upptäckt av målkomponenter. Dock så många bioaktiva komponenter i naturliga produkter är små (< 1 000 Da) och framkalla inte ett immunsvar, skapa monoklonala antikroppar (mAbs) mot dem är ofta svårt. I detta protokoll ger vi en utförlig förklaring av de steg som krävs för att generera mAbs mot målmolekyler som behövs för att skapa associerade indirekta konkurrenskraftiga (ic) ELISA för snabb analys av sammansatt i flera prover. Förfarandet beskriver syntes av konstgjorda antigenet (dvs hapten-carrier konjugatet), immunisering, Cellfusion, monoklonala Hybridomteknik förberedelse, karakterisering av mAb och ELISA-baserade tillämpningen av mAb. Hapten-carrier konjugatet var syntetiseras av natrium natriumperjodat metod och utvärderas av MALDI-TOF-MS. Efter immunisering, splenocytes isolerades från immuniserade musen med den högsta antikropp-titern och smält med den hypoxantin-aminopterin-tymidin (HAT) - känslig mus myelom cellinje Sp2/0 - Ag14 använda en polyetylenglykol (PEG)-baserad metod. De hybridomceller utsöndrar mAbs reaktiv till målet antigen screenades av icELISA för specificitet och korsreaktivitet. Dessutom tillämpades den begränsande utspädning metoden för att förbereda monoklonala hybridomceller. De slutliga mAbs var ytterligare kännetecknas av icELISA och sedan utnyttjas i en ELISA-baserat program för snabb och bekväm detektion av till exempel hapten (naringin (NAR)) i naturliga produkter.

Generation av monoklonala hybridomceller
Molekylvikten för hapten-carrier konjugatet bekräftades av MALDI-TOF-MS analys. Eftersom molekylvikten för både BSA och NAR är kända, kunde antalet små molekyler konjugerat med BSA beräknas. Figur 1 visar representativa spektrala resultat för NAR-BSA22, som visar en bred topp på m/z</em...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Den här artikeln innehåller ett detaljerat protokoll för utarbetande och utvärdering av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter för användning i olika immunanalyser. Denna procedur innefattar immunisering, Cellfusion, indirekta kompetitiva ELISA-test för positiva klon screening och monoklonala Hybridomteknik förberedelse. Specifikationerna för antikropp karakterisering med MALDI-TOF-MS och ELISA analyser finns också.

Generation av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonala antikroppar kallas monospecifika antikroppar som framställs av en enda B-lymfocytklone och de monovalenta antikroppar som binder till samma epitop. Nyligen har den monoklonala antikroppsbaserade ELISA blivit vår framväxande plattform för kvalitativ eller kvantitativ analys av livsmedel eller naturliga produkter. Denna metod är en korrekt, känslig och effektiv metod utan tråkiga förbehandlingssteg.Så det är det väsentliga för biologiska prover och framtida kliniska tillämpningar. Beredning av mABs av TCM är ett viktigt steg i studier om komplexa systemegenskaper TCM formel. Vi har utvecklat ett protokoll för att generera mABs mot de små molekylära föreningar, inklusive artificiell antigen syntes, mus immunisering, och cell fusion.Haptenen förbinds med bäraren proteinet att syntetisera den konstgjorda antigenen. Konstgjord antigen och kompletta adjuvans blandas och emulgeras. Musen var immuniserade genom subkutan injektion.Ta ut mjälten av immuniserad mus och gör encellsfjädring. Blanda myelomcellerna. Splenocytes är isolerade och smält med HAT-känsliga mus myelom cellinje med PEG metod.Välj en cellinje som kan förbereda antikroppar av ELISA. Hybridomas som utsöndrar monoklonala antikroppar som är reaktiva mot antigen klonas. Upprätta hybridoma cellinjen är cryopreserved.Periodate oxidation förfarande användes för syntes av en narigin BSA konjugat. För det första löstes narigin vid en slutlig koncentration av ett milligram per milliliter vid 100 mikroliter av nyberedda natriumpariodatlösning till fem milliliter av nariginlösningen. Rör om blandningen i rumstemperatur i en timme.För det andra, tillsätt två milliliter av bärarprotein till narigin natrium periodate reaktionsblandningen. Justera blandningen till pH nio lösning och fortsätta att reagera i sex till åtta timmar. För det tredje var den konstgjorda antigen renas med dialysmetod i PDS i tre dagar för att främmande CBS.Freunds kompletta adjuvans och ofullständiga adjuvans användes för musimmunisering. För vaccinationen, blanda 50 mikrogram konjugat med en lika stor volym av Freunds kompletta adjuvans och emulgera helt. Administrate 100 mikrogram av denna blandning till varje BALB / c mus via dorsal subkutan injektion.Leverera en boostervaccination via subkutan injektion två veckor senare med samma mängd konjugat blandat med ofullständig adjuvans. För primär immunisering användes Freunds kompletta adjuvant och immunogen via subdermal injektion. För booster immunisering, Freunds ofullständiga adjuvans och immunogen användes via subdermal injektion.För påverkansvaccinering utan adjuvans användes endast immunogen via subdermal injektion eller intraperineal injektion. Foderskiktsceller härrör främst från bukepitelceller eller makrofag. RPMI 1640 FBS och HAT användes för att förbereda HAT-skärmmedium.HAT tillägg löstes i 10 milliliter RPMI medium, sedan läggas i 500 milliliter RPMI 1640 som innehåller 20%FBS. Och ICR mus steriliserades av 75%etylalkohol i fem minuter. Efter att ha tagit bort pälsen från buken med hemostatiska tlyktor, desinficera område med 75%etanol.Skär den yttre huden för att exponera bukhålan. Injicera tre milliliter sterila RPMI 1640 medium i buken. Massera sedan in buken för att lossa ytterligare celler i lösningen.Aspirera fetala cellen suspensionen i en 15 milliliter centrifug röret. Efter centrifuging cellen suspension i 10 minuter vid 1, 000g, kasta supernatant och åter upphäva fosterceller för att få encell suspension. Efter denna procedur, lös cellerna genom att använda HAT medium.Räkna cellerna för att göra det 100, 000 per milliliter från cellmedlemmar. Överför cellerna i 96 brunnscellkulturplattor. Inkubera plattorna över natten på 37 grad, 5%koldioxid.Den valda immuniserade musen steriliserades med 75%etylalkohol i fem minuter. Aspirate RPMI 1640 medium som tvättbufferten. Ta bort huden och muskelvävnaden med hjälp av sax för att exponera mjälten.Isolera mjälten av pincetten noggrant. Tvätta sedan mjälten i RPMI 1640. Isolera mjälten och skär i bitar.Sakta pund mjälten. Sedan behandlades med en RMPI 1640 medium för att lösa upp cellerna för att förbereda en mjälte cell suspension. Därefter filtrerades cellerna av 800 maskcellsil.Spika mjälten försiktigt för att ta bort de stora vävnaderna. Undvika stora vävnader påverkar fusion av celler. Var mjälten cellen suspension med RPMI 1640 medium.Sedan lades cellupphängningen in i centrifugröret. Skörda mjältcellerna genom centrifugering vid 1, 000g i 10 minuter. Och sedan kasta supernatanten.Mjältcellerna skulle uppgå till en miljard till tio miljarder. Avlägsna de odlade och förstärkta myelomcellerna från inkubatorn och skaka kolven försiktigt för att få en cellupphängning. Var suspensionen med RPMI två gånger.Blanda mjältcellsupphängningen och myelomcellerna. Räkna cellerna och justera koncentrationen. Den slutliga ransonen av mjälte celler till myelom celler bör vara en till fem till en till 10.Centrifugera cellblandningen och ta sedan bort supernatanten. Tillsätt en milliliter av 50%polyetylenglykol lösning till cellerna och försiktigt rör om i 37 grad i en minut. Stående i 30 sekunder, tillsätt två milliliter RPMI 1640 medium och inkubera i 37 grad i två minuter för att avsluta reaktionen.Lägg i två milliliter RPMI i ytterligare en minut. Lägg sedan till 10 milliliter RPMI 1640. Centrifugera vid 800g i 10 minuter.Kassera supernatanten, tillsätt HAT-lösning och fortsätt att odla cellerna i sju dagar vid 37 graders 5 %koldioxid. Efter sju dagar, cell supernatants i 96 väl plattor var sugs efter cell fusion och läggas till ELISA plattor pre-coated med beläggning antigen. Odlas på 37 grad i en timme, sekundär antikropp tillsattes och odlas i en halvtimme.Efter tillsätt 100 mikroliter av substratlösning. Stoppa reaktionen. Till ELISA-plattorna in i mikroplattläsaren användes endpointmetoden läs data vid 450 nanometer.Uppmätt absorbans vid 450 nanometer och skärm de positiva hybridomas. Använd den begränsande utspädningsmetoden för att förbereda de monoklonala hybridomerna. Efter att ha tagit bort HD-mediet från de valda hybridomerna, åter upphäva cellerna i RPMI 1640 och räkna dem.Späd cellerna i en koncentration av en cell, två celler och fyra celler per brunn genom RPMI 1640 i en 96 väl platta och kultur. Överför celler från hybridomas som är positiva till 24 brunnsplattor, 25 och 75 kvadratcentimeterkolvar för odling. Förvara myodomerna i en gradientkylbox i minus 80 grader i 24 timmar.Överför sedan till flytande kväve för långtidsförvaring. Titer av antiserums fastställdes genom indirekt ELISA. Mus ett genom fyra var immuniserade med narigin BSA konjugat var betydligt högre än kontroll musen utan immunized.Titern av en till 5, 000 är tillräcklig diffusion. Molekylvikten av haptenkonjugatet bekräftades av MALDI-TOF-analys. Som framgår i figur två, som en molekylvikt av BSA standard och narigin har varit kända, kan vi beräkna och bestämma att molekylerna av narigin var konjugerade med BSA.Endast hybridom kan överleva och växa i HAT urval media. Efter sju dagars tillväxt kan cellkulturen testas av ELISA. De positiva hybridomas var re-klonade och expanderade.Dessa bilder visar det konventionella resultatet för stabila monoklonala och polyklonala hybridoma cellinjer. Den kritiska punkten i detta experiment är screening mAbs specifika för hapten, men inte bäraren protein. Specificiteten hos mAb undersöktes sedan i närvaro av andra strukturellt relaterade föreningar.Den korsreaktivitet beräknades för att utvärdera mAb specificiteten till antigenet. Kalibreringskurvan för naringin och linern spänner erhölls. Antigenen specifika monoklonala hybridomas utvidgades och cryopreserved i flytande kväve för långsiktig lagring.Efter att ha sett den här videon, jag hoppas du har en god förståelse för hur man genererar monoklonala antikroppar mot en liten moleculare föreningar. Så det är allt. Tack för din tittande och lycka till för dina experiment.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passiv Administrering av monoklonala antikroppar mot H. capsulatum M.fl. svamppatogener

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Kvantitativa analyser av alla influensa typ A Viral Hemagglutinins och neuroaminidaser använda Universal antikroppar i enkla mätmetoder Slot Blot

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En parasit Rescue och Transformation analys för Antileishmanial screening mot intracellulära<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Human akut monocytisk leukemicellinjen

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Behandling av trombocyter Produkter med Riboflavin och UV-ljus: Effektivitet mot hög titer Bakteriell förorening

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Framställning av rekombinant human IgG monoklonala antikroppar från Immortaliserade Sorterat B-celler

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Mätning influensaneuraminidas Inhibition Antikroppstitrar genom enzymkopplad lektin analys

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Generering av murina monoklonala antikroppar genom hybridomteknik

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Generation av Escape varianter av neutraliserande influensa Virus monoklonala antikroppar

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Generation av diskriminerande humana monoklonala antikroppar från sällsynta Antigen-specifika B-celler som cirkulerar i blodet

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antigena liposomer för generering av sjukdom-specifika antikroppar

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...