Name: generation of monoclonal antibodies against natural products
Uploaded: 2019-04-06T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Bu eser Ulusal Doğa Bilimleri Foundation of China (grant numaraları 81573573, 81473338 ve 81503344) ve klasik reçete temel araştırma ekibi Beijing Üniversitesi'nde Çin tıbbı tarafından desteklenmiştir.

Bu çalışmada gerçekleştirilen hayvan yordamların tümünü Çin tıbbı (onay numarası 2016BZYYL00109) Beijing Üniversitesi etik Değerlendirme Komitesi tarafından onaylanmış olması.
Not: Kadın BALB/c fare (8 haftalık) hapten-taşıyıcı protein conjugates ile aşı. Tek başına, küçük bir molekül kullanıldığında (< 1000 Da) bir bağışıklık yanıtı temin edemem. Ancak, bir taşıyıcı makromolekül sonuçlarında antijen sentezi için küçük molekül conjugating...

<ol>
	<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity.">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256, 495-497 (1975).</li><li>De Smet, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herbal+remedies.">Herbal remedies.</a> The New England journal of medicine. 347, 2046-2056 (2002).</li><li>Rowinsky, E. K., Donehower, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+pharmacology+of+paclitaxel+(Taxol).">The clinical pharmacology of paclitaxel (Taxol).</a> Seminars in oncology. 20, 16-25 (1993).</li><li>Yan, X., Zhao, Y., Zhang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monoclonal+Antibodies+and+Immunoassay+for+Medical+Plant-Derived+Natural+Products:+A+Review.">Monoclonal Antibodies and Immunoassay for Medical Plant-Derived Natural Products: A Review.</a> Molecules. 22, (2017).</li><li>Loungratana, P., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibody+against+ginkgolic+acids+in+Ginkgo+biloba+Linn.">Production of monoclonal antibody against ginkgolic acids in Ginkgo biloba Linn.</a> The American journal of Chinese medicine. 32, 33-48 (2004).</li><li>Fujii, S., Morinaga, O., Uto, T., Nomura, S., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+monoclonal+antibody-based+immunochemical+assay+for+liquiritin+and+its+application+to+the+quality+control+of+licorice+products.">Development of a monoclonal antibody-based immunochemical assay for liquiritin and its application to the quality control of licorice products.</a> Journal of agricultural and food chemistry. 62, 3377-3383 (2014).</li><li>Ishiyama, M., Shoyama, Y., Murakami, H., Shinohara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+and+development+of+an+ELISA+for+solamargine.">Production of monoclonal antibodies and development of an ELISA for solamargine.</a> Cytotechnology. 18, 153-158 (1995).</li><li>Xuan, L., Tanaka, H., Xu, Y., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+monoclonal+antibody+against+crocin+and+its+characterization.">Preparation of monoclonal antibody against crocin and its characterization.</a> Cytotechnology. 29, 65-70 (1999).</li><li>Leu, J. G., Chen, B. X., Schiff, P. B., Erlanger, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+polyclonal+and+monoclonal+anti-taxol+antibodies+and+measurement+of+taxol+in+serum.">Characterization of polyclonal and monoclonal anti-taxol antibodies and measurement of taxol in serum.</a> Cancer research. 53, 1388-1391 (1993).</li><li>Zhu, S., Shimokawa, S., Shoyama, Y., Tanaka, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+analytical+ELISA-based+methodology+for+pharmacologically+active+saikosaponins.">A novel analytical ELISA-based methodology for pharmacologically active saikosaponins.</a> Fitoterapia. 77, 100-108 (2005).</li><li>Phrompittayarat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+pseudojujubogenin+glycosides+from+Brahmi+based+on+immunoassay+using+a+monoclonal+antibody+against+bacopaside+I.">Determination of pseudojujubogenin glycosides from Brahmi based on immunoassay using a monoclonal antibody against bacopaside I.</a> Phytochemical analysis. 18, 411-418 (2007).</li><li>Limsuwanchote, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+a+monoclonal+antibody+against+notoginsenoside+R1,+a+distinctive+saponin+from+Panax+notoginseng,+and+its+application+to+indirect+competitive+ELISA.">Preparation of a monoclonal antibody against notoginsenoside R1, a distinctive saponin from Panax notoginseng, and its application to indirect competitive ELISA.</a> Planta medica. 80, 337-342 (2014).</li><li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ginsenoside+Rb1+from+Kalopanax+pictus+by+eastern+blotting+using+anti-ginsenoside+Rb1+monoclonal+antibody.">Isolation of ginsenoside Rb1 from Kalopanax pictus by eastern blotting using anti-ginsenoside Rb1 monoclonal antibody.</a> Phytotherapy research. 19, 255-258 (2005).</li><li>Morinaga, O., Nakajima, S., Tanaka, H., Shoyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+monoclonal+antibodies+against+a+major+purgative+component,+sennoside+B,+their+characterization+and+use+in+ELISA.">Production of monoclonal antibodies against a major purgative component, sennoside B, their characterization and use in ELISA.</a> The Analyst. 126, 1372-1376 (2001).</li><li>Sakamoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+determination+of+soy+isoflavone+glycosides,+daidzin+and+genistin+by+monoclonal+antibody-based+highly+sensitive+indirect+competitive+enzyme-linked+immunosorbent+assay.">Simultaneous determination of soy isoflavone glycosides, daidzin and genistin by monoclonal antibody-based highly sensitive indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay.</a> Food chemistry. 169, 127-133 (2015).</li><li>Shan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Baicalin.">Development of a Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Baicalin.</a> Journal of fluorescence. 25, 1371-1376 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+based+on+anti-puerarin+monoclonal+antibody+and+its+applications.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay based on anti-puerarin monoclonal antibody and its applications.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 953-954, 120-125 (2014).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+immunoaffinity+chromatography+for+glycyrrhizic+acid+using+an+anti-glycyrrhizic+acid+monoclonal+antibody.">Development of an enzyme-linked immunosorbent assay and immunoaffinity chromatography for glycyrrhizic acid using an anti-glycyrrhizic acid monoclonal antibody.</a> Journal of separation science. 38, 2363-2370 (2015).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Fluorescence-Linked+Immunosorbent+Assay+for+Paeoniflorin.">Development of Fluorescence-Linked Immunosorbent Assay for Paeoniflorin.</a> Journal of fluorescence. 25, 885-890 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+enzyme-linked+immunosorbent+assay+and+application+on+determination+of+ginsenoside+Re+in+human+saliva.">Establishment of an enzyme-linked immunosorbent assay and application on determination of ginsenoside Re in human saliva.</a> Planta medica. 80, 1143-1150 (2014).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+ELISA+for+detection+of+Rh1+and+Rg2+and+potential+method+of+immunoaffinity+chromatography+for+separation+of+epimers.">Development of ELISA for detection of Rh1 and Rg2 and potential method of immunoaffinity chromatography for separation of epimers.</a> Journal of chromatography B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences. 985, 197-205 (2015).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+immunoassay+and+rapid+immunoaffinity+chromatography+method+for+the+detection+and+selective+extraction+of+naringin+in+Citrus+aurantium.">Novel immunoassay and rapid immunoaffinity chromatography method for the detection and selective extraction of naringin in Citrus aurantium.</a> Journal of separation science. 39, 1389-1398 (2016).</li><li>Qu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+lateral-flow+immunoassay+for+the+quantum+dot-based+detection+of+puerarin.">Rapid lateral-flow immunoassay for the quantum dot-based detection of puerarin.</a> Biosensors &amp; bioelectronics. 81, 358-362 (2016).</li></ol>

Burada, mAbs doğal ürün kaynaklı küçük moleküller karşı başarılı üretim için bir iletişim kuralı mevcut. Temel adımları yordamda açıklanan olmuştur ve biz NAR bir örnek küçük molekül bu iletişim kuralı'nı yarar göstermiştir. Örnek spectra, reaktivite analizleri ve icELISA sonuçları temsilcisi deneysel ve bu iletişim kuralını kullanan elde edilen denetim verileri gösterir. Hybridomas örnek görüntüleri ne araştırmacı monoklonal ve poliklonal hybridomas arasında differentiating...

Monoklonal antikor (mAbs) olarak da bilinen mono özel antikorlar, tek bir B-lymphocyte klon üretilir ve tümünü aynı epitope1olarak bağla monovalent antikorların oluşmaktadır. Son yıllarda çok sayıda şifalı bitki kaynaklı doğal ürünler çeşitli hastalıklar2tedavisinde kullanılmaktadır. Gerçekten de, birçok küçük moleküler bileşikleri aslında doğal ürünlerden elde edilen şimdi artemisinin için sıtma ve paciltaxel (taxol) kanser2,3gibi ilk satır ilaçlar olarak uygulanır. Doğal ürünler çalışmanın çok büyük gelişme ve geleneksel analiz teknikleri, yüksek performanslı sıvı Kromatografi (HPLC) ve kütle spektrometresi (MS) dahil olmak üzere en iyi duruma getirme büyük ölçüde nedeniyle hızlı ilerleme kaydetmiştir. Ancak, hala onların karmaşık tedavi öncesi iletişim kuralları ve ilgili maliyetler açısından zaman, emek/uzmanlık ve gerekli aletleri4gibi bu yöntemler ile ilgili bazı sınırlamalar vardır.
Son zamanlarda, mAb-esaslı enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs) gıda ve doğal ürünler niteliksel ve kantitatif analiz etmek için uygulandı. Aslında, bu yöntem hem biyolojik örnekleri analiz ve klinik test için uygulanan ve ayrıca diğer analizler5ileilgili sıkıcı tedavi öncesi adımlar kaçınırken doğru duyarlı ve son derece etkili olduğu gösterilmiştir, 6.
Monoklonal antikorların hazırlanması ELISAs mAb tabanlı karmaşık doğal ürünleri incelemek için kullanırken, çekirdek adımlardan biridir. Ne yazık ki, bu tür maddeler6,7,8,9,10,11,12 mevcut küçük biyoaktif bileşenler için özel mAbs ,13,14,15 kez sınırlı protein antijenleri ile karşılaştırıldığında. Bu sorunu aşmak için özellikle mAbs karşı küçük bileşikleri oluşturmak için bir protokol geliştirdik. Burada sunulan Protokolü yapay antijen sentezi, fare bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA ve monoklonal Hibridoma hazırlık içerir.
Özellikle, bizim araştırma grubu mAbs karşı geleneksel Çin ilaç üzerinden küçük biyoaktif bileşiklerin oluşumunu eğitim edilmiş ve yıl boyunca onların uygulamaları geliştirme. Çalışmalarımız devam mAbs baicalin16, puerarin17, glycyrrhizic asit18, paeoniflorin19, ginsenoside Re20, ginsenoside Rh121ve birçok diğer küçük moleküller karşı geliştirdik. ELISA protokolümüze bu mAbs üzerinde çalışmalar bir dizi yanı sıra diğer biyoaktif bileşiklerin onların etkileşimleri bu küçük moleküller farmakokinetik değerlendirmek için kullanılmaktadır. Ayrıca, bu mAbs kullanarak, ayrıca epimers de dahil olmak üzere yapısal analogları ayrılması için immunoaffinity Kromatografi yöntemler geliştirdik. Son zamanlarda, daha sonra hızlı, yerinde tespiti bu bileşik için kullanılan bizim anti-puerarin mAb kullanarak bir yanal akışı immunoassay hazırladık. Bizim sonuçları bizim mAb tabanlı deneyleri Biyoloji ve doğal ürün türevi bileşikler, özellikle içinde geleneksel Çin ilaç kullanılan kalitesini çalışmak için vazgeçilmez ve uygun araçlar olduğunu gösteriyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="617">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">800 mesh (40 &#956;m nylon) filter&#160;</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td style="width:172px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">24 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">119567</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">25 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Labserv</td>
			<td style="width:123px;">310109016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">3,3&#8217;,5,5&#8217;-Tetramethylbenzidine(TMB)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">860336 1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">75 cm2 Flask</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">96 well culture plate</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">117246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">bovine serum albumin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">332</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cell strainer</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 15 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430645</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">centrifuge tube 50 mL</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">430828</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cryotubes, 1 mL&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">V7384-1CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">cultivator</td>
			<td style="width:101px;">DRP-9082&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Samsung</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">dialysis membrane (10kDa)</td>
			<td style="width:101px;">Heng Hui</td>
			<td style="width:123px;">45-10000D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">dimethylsulfoxide</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">DH105-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">electronic balance&#160;</td>
			<td style="width:101px;">BS124-S&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Sartorius</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">ELISA plates, 96 well</td>
			<td style="width:101px;">NUNC</td>
			<td style="width:123px;">655101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ethanol, 96%</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:101px;">Gibco</td>
			<td style="width:123px;">16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">fetal calf serum</td>
			<td style="width:101px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:123px;">10270106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, complete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBM2183V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Freund&#180;s adjuvant, incomplete</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">SLBL0210V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gelatin</td>
			<td style="width:101px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:123px;">9764-500g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Gradient cooler container</td>
			<td style="width:101px;">Nalgene</td>
			<td style="width:123px;">5100-0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HAT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0262-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">HRP-conjugated goat-anti-mouse IgG antibody</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">C1308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">HT media supplement</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H0137-10VL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Inverted Microscope</td>
			<td style="width:101px;">IX73</td>
			<td style="width:123px;">Olympus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">keyhole limpet hemocyanin</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">H8283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">MALDI-TOF-MS&#160;</td>
			<td style="width:101px;">Axima-CFR&#160; plus&#160;&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Axima&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Microplate Reader</td>
			<td style="width:101px;">BioTex</td>
			<td style="width:123px;">ELX-800&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">mouse</td>
			<td style="width:101px;">Vital River&#160;</td>
			<td style="width:123px;">BALB/c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">ovalbumin</td>
			<td style="width:101px;">Beijing BIODEE</td>
			<td style="width:123px;">5008-25g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">PEG</td>
			<td style="width:101px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:123px;">RNBC6325</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Penicillin&#38;Streptomycin solution</td>
			<td style="width:101px;">Hyclone</td>
			<td style="width:123px;">SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 10 mL</td>
			<td style="width:101px;">COSTAR</td>
			<td style="width:123px;">4488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">Pipette 25 mL</td>
			<td style="width:101px;">FALCON</td>
			<td style="width:123px;">357525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:101px;">Corning</td>
			<td style="width:123px;">10-040-CVR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">skim milk</td>
			<td style="width:101px;">applygen</td>
			<td style="width:123px;">P1622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:223px;">sodium periodate</td>
			<td style="width:101px;">Sinopharm Chemical</td>
			<td style="width:123px;">BW-G0008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:223px;">Sulfo-GMBS</td>
			<td style="width:101px;">Perbio Science Germany</td>
			<td style="width:123px;">22324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:223px;">TipOne Tips 1,000 &#181;L</td>
			<td style="width:101px;">Starlab</td>
			<td style="width:123px;">S1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of monoclonal antibodies against natural products

Gıda ve doğal ürünler mevcut biyoaktif bileşenler analizi çalışma geleneksel Çin tıp ve gıda güvenliği/toksikoloji de dahil olmak üzere birçok alanda popüler bir alanı haline gelmiştir. Klasik analiz teknikleri çok pahalı ekipman ve/veya uzmanlık gerektirir. Özellikle, enzim bağlı immunosorbent deneyleri (ELISAs) gıda ve doğal ürünler analizi için gelişmekte olan bir yöntem haline gelmiştir. Bu yöntem hedef bileşenleri antikor aracılıklı tespiti dayanmaktadır. Ancak, birçok doğal ürünler biyoaktif bileşen olarak küçüktür (< 1000 Da) ve bağışıklık yanıtının neden değil, onlara karşı monoklonal antikorlar (mAbs) oluşturma genellikle zor. Bu protokol için biz mAbs karşı olanların bileşim içinde birden fazla örnekleri hızlı çözümlenmesi için ilişkili dolaylı rekabet (IC) ELISA oluşturmak için gerekli yanı sıra hedef molekülleri oluşturmak için gereken adımları ayrıntılı bir açıklama sağlar. Yordam, yapay antijen (Yani, hapten-taşıyıcı eşlenik) sentezi, aşılama, hücre füzyon, monoklonal Hibridoma hazırlama, mAb karakterizasyonu ve mAb ELISA tabanlı uygulama açıklar. Hapten-taşıyıcı eşlenik sodyum tarafından sentez yöntemi periodate ve MALDI-TOF-MS tarafından değerlendirilir. Bağışıklama sonra splenocytes aşılı fare ile en yüksek antikor titresi yalıtılmış ve hypoxanthine-aminopterin-timidin (şapka) - hassas fare miyelom hücre kültürünü Sp2/0 - Ag14 ile erimiş polietilen glikol (PEG) kullanarak-yöntemi dayalı. MAbs hedef antijen reaktif salgılayan hybridomas özgüllük ve olan icELISA tarafından gösterildi. Ayrıca, sınırlayıcı seyreltme yöntemi monoklonal hybridomas hazırlamak için uygulandı. Son mAbs daha da icELISA tarafından karakterize ve doğal ürünler içinde örnek hapten (naringin (NAR)) hızlı ve kolay tespiti için ELISA tabanlı bir uygulamada kullanılmaktadır.

Monoklonal hybridomas nesil
Hapten-taşıyıcı eşlenik molekül ağırlığı MALDI-TOF-MS analizi tarafından doğrulandı. Moleküler ağırlığı BSA ve NAR bilinen gibi küçük moleküller BSA ile Birleşik sayısı hesaplanır. NAR-BSA22geniş bir tepe m/z 77,058 görüntüler, temsilcisi spektral sonuçları şekil 1 gös...

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products at JoVE.com

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Bu makale hazırlanması ve doğal ürünler kullanmak üzere çeşitli uzun karşı Monoklonal antikor değerlendirilmesi için detaylı bir protokol sağlar. Bu yordam bağışıklama, hücre füzyon, dolaylı rekabet ELISA olumlu klon eleme ve monoklonal Hibridoma hazırlık için içerir. Antikor karakterizasyonu MALDI-TOF-MS ve ELISA analizleri kullanarak spesifikasyonları da temin edilmektedir.

Doğal ürünler karşı monoklonal antikorların üretimi

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

Monoklonal antikorlar, tek bir B-lenfosit klonundan üretilen mono-spesifik antikorlar ve aynı epitopa bağlanan monovalent antikorlar olarak bilinir. Son zamanlarda, monoklonal antikor tabanlı ELISA gıdalar veya doğal ürünlerin nitel veya nicel analizi için gelişmekte olan platform haline gelmiştir. Bu yöntem sıkıcı ön işlem adımları olmadan doğru, hassas ve etkili bir yöntemdir.Bu biyolojik numuneler ve gelecekteki klinik uygulamalar için gereklidir. TCM mAD'lerinin hazırlanması, TCM formülünün karmaşık sistem özellikleri üzerine yapılan çalışmalarda hayati bir adımdır. Yapay antijen sentezi, fare bağışıklığı ve hücre füzyonu da dahil olmak üzere küçük moleküler bileşiklere karşı mAB'ler üretmek için bir protokol geliştirdik.Hapten yapay antijen sentezlemek için taşıyıcı protein ile bağlıdır. Yapay antijen ve komple adjuvants karıştırılır ve emülsifiye edilir. Fare deri altı enjeksiyonla aşılanmış.Aşılanmış farenin dalağını çıkar ve tek hücreli süspansiyon yapın. Miyelom hücrelerini karıştırın. Splenositler PEG yöntemi ile HAT duyarlı fare miyelom hücre hattı ile izole edilir ve eritilir.ELISA ile antikorları hazırlayabilen bir hücre hattı seçin. Antijene reaktif olan monoklonal antikorları salgılayan hibridomomlar klonlanır. Hibridoma hücre hattı kurmak cryopreserved olduğunu.Bir narigin BSA konjuge sentezinde periodate oksidasyon prosedürü kullanılmıştır. İlk olarak, narigin narigin çözeltisi beş mililitre taze hazırlanmış sodyum pariodate çözeltisi 100 mikrolitre mililitre başına miligram bir miligram son konsantrasyonda çözüldü. Bir saat oda sıcaklığında karışımı karıştırın.İkinci olarak, narigin sodyum periodate reaksiyon karışımına iki mililitre taşıyıcı protein ekleyin. Karışımı pH dokuz çözeltisine ayarlayın ve altı ila sekiz saat boyunca reaksiyona devam edin. Üçüncü olarak, yapay antijen CBS yabancılaşmak için üç gün boyunca PDS diyaliz yöntemi ile saflaştırılmış oldu.Freund'un tam adjuvan ve eksik adjuvan fare bağışıklama için kullanılmıştır. Aşılama için, Freund'un tam adjuvan eşit hacmi ile eşleç 50 mikrogram karıştırın ve tamamen emülsifiye. Dorsal deri altı enjeksiyon yoluyla her BALB/c faresine bu karışımın 100 mikrogramını administrate.İki hafta sonra eksik adjuvan ile karışık konjuge aynı miktarda deri altı enjeksiyon ile bir güçlendirici aşı teslim. Primer bağışıklama için Freund'un komple adjuvan ve immünojeni subdermal enjeksiyon ile kullanıldı. Güçlendirici bağışıklama için Freund'un eksik adjuvan ve immünojensubenjeksiyon ile kullanıldı.Adjuvan olmadan darbe aşısı için subdermal enjeksiyon veya intraperineal enjeksiyon ile sadece immünojen kullanıldı. Yem tabakası hücreleri esas olarak abdominal epitel hücreleri veya makrofaj kökenli. HAT ekran ortamının hazırlanmasında RPMI 1640 FBS ve HAT kullanılmıştır.HAT takviyesi 10 mililitre RPMI orta çözülmüş, daha sonra içine eklendi 500 mililitre RPMI 1640 içeren 20% FBS. ICR faresi beş dakika boyunca %75 etil alkolle sterilize edildi. Hemostatik forceps ile karın kürk çıkardıktan sonra,% 75 etanol ile bölgeyi dezenfekte.Karın boşluğuortaya çıkarmak için dış deri kesin. Karın içine steril RPMI 1640 orta üç mililitre enjekte. Sonra çözelti içine ek hücreleri ayırmak için karın masaj.15 mililitrelik bir santrifüj tüpü içine fetal hücre süspansiyon aspire. 1, 000g 10 dakika hücre süspansiyon santrifüj sonra, supernatant atın ve tek hücre süspansiyon almak için fetal hücreleri yeniden askıya. Bu işlemden sonra, HAT ortamı nı kullanarak hücreleri çözün.Hücre üyelerinden mililitre başına 100,000 yapmak için hücreleri say. Hücreleri 96 kuyu hücre kültür plakasına aktarın. Plakaları bir gecede 37 derece, %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın.Seçilen aşılanmış fare beş dakika boyunca %75 etil alkol le sterilize edildi. Yıkama tamponu olarak ASpire RPMI 1640 orta. Dalak ortaya çıkarmak için makas kullanarak deri ve kas dokusu çıkarın.Dalağını cımbızla dikkatlice izole edin. Daha sonra DALağını RPMI 1640'ta yıkayın. Dalağını izole edin ve parçalara ayırın.Yavaşça dalağını vur. Daha sonra bir dalak hücre süspansiyon hazırlamak için hücreleri çözmek için bir RMPI 1640 orta ile tedavi edildi. Bundan sonra, hücreler 800 örgü hücresüz tarafından filtre edildi.Büyük dokuları çıkarmak için dalağını dikkatlice çivile. Büyük dokulardan kaçınmak hücrelerin füzyonunu etkiler. RPMI 1640 orta ile dalak hücre süspansiyon oldu.Sonra hücre süspansiyonu santrifüj tüpüne eklendi. 10 dakika boyunca 1,000g de santrifüj tarafından dalak hücreleri hasat. Ve sonra supernatant atın.Dalak hücrelerinin bir ila 10 milyar arasında olması gerekiyordu. Ekili ve güçlendirilmiş miyelom hücrelerini kuvözden çıkarın ve hücre süspansiyonu elde etmek için şişeyi hafifçe sallayın. RPMI ile süspansiyon iki kez oldu.Dalak hücre süspansiyonu ve miyelom hücrelerini karıştırın. Hücreleri say ve konsantrasyonu ayarla. Dalak hücrelerinin miyelom hücrelerine son rasyonu 1-5-10 arasında olmalıdır.Hücre karışımını santrifüj edin ve süpernatantı çıkarın. Hücrelere% 50 polietilen glikol çözeltisi bir mililitre ekleyin ve yavaşça bir dakika için 37 derece karıştırın. 30 saniye boyunca ayakta, rpmi 1640 orta iki mililitre ekleyin ve reaksiyonu sona erdirmek için iki dakika boyunca 37 derece kuluçka.Başka bir dakika için iki mililitre RPMI ekleyin. Sonra, 10 mililitre RPMI 1640 ekleyin. 10 dakika 800g de Santrifüj.Supernatant atılması, HAT çözeltisi ekleyin ve 37 derece 5% karbondioksit yedi gün boyunca hücreleri yetiştirmek için devam. Yedi gün sonra, 96 kuyu plakasındaki hücre süpernatanları hücre füzyonundan sonra aspire edildi ve kaplama antijeni ile önceden kaplanmış ELISA plakalarına eklendi. Bir saat boyunca 37 derecede ekili, ikincil antikor eklendi ve yarım saat için ekili.Substrat çözeltisi 100 mikrolitre ekledikten sonra. Tepkiyi durdur. Mikroplaka okuyucuiçine ELISA plakaları için, endpoint yöntemi 450 nanometre veri okuyun kullanılmıştır.450 nanometre de ölçülen emicilik ve pozitif hibridomlar ekran. Monoklonal hibridomları hazırlamak için sınırlayıcı seyreltme yöntemini kullanın. Seçilen hibridomlardan HD ortamını çıkardıktan sonra RPMI 1640'taki hücreleri yeniden askıya alın ve sayarsınız.RpMI 1640 tarafından bir hücre, iki hücre ve her kuyu başına dört hücrenin 96 iyi plaka ve kültür deki hücrelerini seyreltin. 24 kuyu plakası, 25 ve 75 santimetre kare şişeler için pozitif hibridomlardan hücreleri ekimi için transfer. Miyodomaları eksi 80 derecede 24 saat boyunca bir degrade soğutma kutusunda saklayın.Daha sonra uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarın. Antiserumların titremi dolaylı ELISA tarafından belirlendi. Fare bir ile dört narigin BSA konjuge ile aşılanmış önemli ölçüde aşılı olmadan kontrol faredaha yüksekti.1'den 5'e, 000'e kadar olan titre yeterli difüzyondur. Hapten konjuge'nin moleküler ağırlığı MALDI-TOF analizi ile doğrulandı. Şekil 2'de gösterildiği gibi, BSA standardı ve nariginin moleküler ağırlığı bilindiği için, narigin moleküllerinin BSA ile konjuge olduğunu hesaplayabilir ve belirleyebiliriz.HAT seçim medyasında sadece hybridoma hayatta kalabilir ve büyüyebilir. Büyüme yedi gün sonra, hücre kültürü ELISA tarafından test edilebilir. Pozitif hibridomlar yeniden klonlandı ve genişletildi.Bu görüntüler istikrarlı monoklonal ve poliklonal hibridoma hücre hatları için konvansiyonel sonucu göstermektedir. Bu deneyin kritik noktası hapten için özel mAbs tarama, ancak taşıyıcı protein değil. MAb'nin özgüllüğü daha sonra yapısal olarak ilişkili diğer bileşiklerin varlığında incelendi.Çapraz reaktivite antijen için mAb özgüllüğünü değerlendirmek için hesaplandı. Naringin kalibrasyon eğrisi ve astar aralığı elde edildi. Antijene özgü monoklonal hibridomlar genişletildi ve uzun süreli depolama için sıvı nitrojen de kriyoopreserved edildi.Bu videoyu izledikten sonra, ben küçük bir moleküler bileşiklere karşı monoklonal antikorlar oluşturmak için nasıl iyi bir anlayışa sahip umuyoruz. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneyler için iyi şanslar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Passive Administration of Monoclonal Antibodies Against H. capsulatum and Others Fungal Pathogens

Karşı Monoklonal Antikorlar Pasif Yönetim H. capsulatum Ve Diğerleri Fungal Patojenler

The purpose of the use of this methodology is 1) to advance our capacity to protect individuals with antibody or vaccine for preventing or treating ...

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Tüm Influenza Kantitatif Analiz Basit Slot Blot Tahliller Evrensel Antikorlar kullanarak Viral Hemagglutinins ve nöraminidaz yazın

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

Hücre içi Karşı Antileishmanial Tarama için Parasite Kurtarma ve Dönüşüm Testi<em&gt; Leishmania donovani</emTHP1 İnsan Akut Monositik Lösemi Hücre Hattı&gt; Amastigotes

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

Riboflavin ile Trombosit Ürünleri ve UV Işık Tedavisi: Yüksek Titre Bakteriyel Kontaminasyon Karşı Etkinliği

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Ölümsüzleştirilmiştir Sıralama B hücrelerinden Rekombinant İnsan IgG Monoklonal Antikorlarının Üretimi

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Measuring Influenza Neuraminidase Inhibition Antibody Titers by Enzyme-linked Lectin Assay

Enzim-linked Lektin Testi tarafından Grip Nöraminidaz İnhibisyon antikor titreleri Ölçme

Antibodies to neuraminidase (NA), the second most abundant surface protein on influenza virus, contribute toward protection against influenza. Traditional ...

Generation of Murine Monoclonal Antibodies by Hybridoma Technology

Hibridoma teknolojisi ile murin monoklonal antikorlar üretilmesi

Monoclonal antibodies are universal binding molecules and are widely used in biomedicine and research. Nevertheless, the generation of these binding ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Grip virüsü monoklonal antikorları nötralize kaçış türevleri üretimi

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Kanda dolaşan nadir antijen spesifik B hücreleri Discriminative insan monoklonal antikorların üretimi

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Antigenic Liposomes for Generation of Disease-specific Antibodies

Antijenik lipozomlar hastalığa özgü antikorların üretimi için

Antibody responses provide critical protective immunity to a wide array of pathogens. There remains a high interest in generating robust antibodies for ...