Name: novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00
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Diese Arbeit wurde durch das Gehirn Korea 21 PLUS Projekt für die medizinische Wissenschaft, Yonsei Universität unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit durch ein Stipendium der National Research Foundation of Korea (NRF-2017R1D1A1B03030315) unterstützt.

Alle Verfahren wurden von der Ethikkommission der entsprechenden Forschung an der Yonsei University College of Medicine genehmigt. Alle Versuchstiere sind nach den Richtlinien des Ausschusses Labor Tierbetreuung Yonsei University College of Medicine geopfert.
1. Vorbereitung der Reagenzien
Achtung: Paraformaldehyd (PFA), Acrylamid und Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) sind giftige Reizstoffe und somit in einer Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA,...

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	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

Während die passive, nicht elektrophoretischen Extraktionsmethoden beschäftigt verbessert Pakt deutlich die Konsistenz erreicht mit früheren Gewebe clearing-Methoden wie Klarheit2,3,4,7 , 8, trägt die Technik noch mehrere Mängel auf, die dringendsten davon die Länge der Zeit benötigt, um maximale Gewebe Klarheit12zu erreichen ist...

Ein grundlegendes Ziel der wissenschaftlichen und klinischen Untersuchung beinhaltet ein vollständiges Verständnis der Orgel Struktur und Funktion zu erreichen; die überaus komplexe Natur der Säugetier-Organe dient jedoch oft als Hindernis für voll und ganz diesem Ziel1zu erreichen. Klarheit (klare Lipid ausgetauscht Acrylamid-hybridisiert starre Imaging-kompatible Tisssue-hYdrogel)2,3,4, der beinhaltet den Aufbau einer Acrylamid-basierte Hydrogel-Hybrid von intakten Gewebe, erreicht optische Clearance von verschiedenen Organen, einschließlich Gehirn, Leber und Milz, unter Beibehaltung ihrer strukturellen Integrität-5. Klarheit konnte somit nicht nur die Visualisierung, sondern auch die Möglichkeit, komplexe Mobilfunknetze und Gewebe Morphologien ohne Schnitt fein sezieren.
Um Gewebe Abstand zu erreichen, setzt Klarheit elektrophoretische Methoden zum Entfernen von Lipidgehalt der Probe zur Verfügung. Während Klarheit gemerkt worden ist, für die Herstellung von physikalisch stabile Gewebe-Hydrogel Hybriden, Studien haben gezeigt, dass seine Verwendung der elektrophoretischen Gewebe Clearing (ETC) Methoden unterschiedliche Ergebnisse in Bezug auf Qualität Gewebe, einschließlich gebräunt, Epitop Schaden ergibt und Protein Verlust5,6. Um diese Probleme zu beheben, wurden modifizierte Protokolle wie Pakt (PAssive Technik, Klarheit), der die usw. Behandlung mit einer passiven, Ionische Spülmittel auf der Grundlage delipidierung-Technik ersetzt, entwickelten7,8,9. Trotz eine größere Konsistenz in Ergebnisse zu erreichen, erfordert jedoch Pakt mehr Zeit zum maximalen Abstand zu erhalten. Darüber hinaus wurden keine dieser Techniken noch auf das ganze CNS-Formular oder in größere Nager-Modelle wie Ratten und Meerschweinchen übernommen.
Die vorliegende Studie versucht, diese Einschränkungen zu beheben, indem er vorschlägt neuartige Methoden, PsPACT ("Prozess-separater Pakt") und mPACT (modifizierte Pakt), für erleichtern die schnelle Abfertigung von die ganze CNS und inneren Organe bei Maus und Ratte Modelle10. Im einzelnen verarbeitet PsPACT Gewebe in 4 % Acrylamid und 0,25 % VA-044 in zwei getrennten Schritten während Hydrogel Bildung; mPACT im Wesentlichen die gleichen Schritte beinhaltet, sondern ergänzt die SDS-basierte Clearing-Lösung mit 0,5 % α-Thioglycerol als zentrale Reagens. Beide Techniken nutzen die endogenen systemische und Liquor Kreislaufsystem um den Zeitaufwand zum optischen Freiraum produzieren deutlich zu reduzieren. Als Beweis des Prinzips zeigen wir den Einsatz der konfokalen Mikroskopie, Blutgefäß-Muster in den geräumten Gewebe10zu analysieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

Seit der Entwicklung von Klarheit ermöglicht ein Bioelectrochemical clearing-Technik, die für die dreidimensionale Phänotyp Zuordnung in den transparenten Geweben, eine Vielzahl von neuartigen Clearing Methoden einschließlich KUBISCH (klar, unverbaute bildgebenden Cocktails und computergestützte Analyse), SWITCH (systemweite Kontrolle der Interaktionszeit) und die Kinetik der Chemikalien, Karte (vergrößerte das Proteom-Analyse) und Pakt (passive Klarheit-Technik), eingerichtet, um das bestehende Instrumentarium für weiter ausbauen die mikroskopische Analyse von biologischen Geweben. Die vorliegende Studie zielt darauf ab, bei der Verbesserung und Optimierung der ursprünglichen Pakt-Prozedur für ein Array intakt Nagetier Gewebe, einschließlich das gesamte zentrale Nervensystem (ZNS), Nieren, Milz und ganze mausembryonen. PsPACT (Prozess-separater Pakt) und mPACT ("modifizierte Pakt") bezeichnet, bieten diese neuartige Techniken hochwirksamen Mittel mapping Zelle Schaltung und subzelluläre Strukturen in intakten normalen und pathologischen Geweben zu visualisieren. Das folgende Protokoll bieten wir eine ausführliche, schrittweise Gliederung wie maximale Gewebe Abstand mit minimaler Invasion ihre strukturelle Integrität über PsPACT und mPACT zu erreichen.

Generation ein transparentes Modell des gesamten ZNS mit optimierten passiven Clearing-Techniken
Optische Clearance von Maus und Ratte ganze CNS-Gewebe wurde schnell erreicht mit verschiedenen Techniken der passiven Clearing (Abbildung 1). Abbildung 2Azeigt eine schematische Darstellung des Gewebes im Laufe der Zeit löschen. Im Gegensatz zu der Origina...

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Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

Neuartige passiv Clearing Methoden für die schnelle Produktion von optischen Transparenz im gesamten ZNS-Gewebe

Hier stellen wir zwei neue Methoden, PsPACT und mPACT zur Erreichung maximaler optischer Transparenz und anschließende mikroskopische Analyse des Gewebes Gefäßsystem in das intakte Nagetier ganze CNS.

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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