Name: novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue
Uploaded: 2018-05-08T14:00:00
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この作品は、延世大学医科学脳韓国 21 プラス プロジェクトによって支えられました。さらに、この作品は、韓国の国立研究財団 (NRF-2017R1D1A1B03030315) からの助成金によって支えられました。

すべてのプロシージャは、延世大学医科大学研究倫理委員会によって承認されています。延世大学医科大学実験動物の世話委員会のガイドラインに従ってすべての実験動物が犠牲に。
1. 試薬の調製
注意: パラホルムアルデヒド (PFA) アクリルアミドおよびナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 有害刺激を適切な個人用保護具 (PPE; 白衣、手袋、保護メガネ) と発?...

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	<li>Zhu, X., Xia, Y., Wang, X., Si, K., Gong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+brain+imaging:+A+powerful+tool+for+neuroscience.">Optical brain imaging: A powerful tool for neuroscience.</a> Neurosci Bull. 33 (1), 95-102 (2017).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions.">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Sci Rep. 7, 44810 (2017).</li><li>Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Dev Biol. 14, 48 (2014).</li><li>Jensen, K. H. R., Berg, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+perspectives+in+tissue+clearing+using+CLARITY.">Advances and perspectives in tissue clearing using CLARITY.</a> J Chem Neuroanat. 86, 19-34 (2017).</li><li>Treweek, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+tissue+stabilization+and+selective+extractions+via+tissue-hydrogel+hybrids+for+high-resolution+intact+circuit+mapping+and+phenotyping.">Whole-body tissue stabilization and selective extractions via tissue-hydrogel hybrids for high-resolution intact circuit mapping and phenotyping.</a> Nat Protoc. 10 (11), 1860-1896 (2015).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Neckel, P. H., Mattheus, U., Hirt, B., Just, L., Mack, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+tissue+clearing+(PACT):+Technical+evaluation+and+new+perspectives+in+immunofluorescence,+histology,+and+ultrastructure.">Large-scale tissue clearing (PACT): Technical evaluation and new perspectives in immunofluorescence, histology, and ultrastructure.</a> Sci Rep. 6, 34331 (2016).</li><li>Woo, J., Lee, M., Seo, J. M., Park, H. S., Cho, Y. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+the+optical+transparency+of+rodent+tissues+by+modified+PACT-based+passive+clearing.">Optimization of the optical transparency of rodent tissues by modified PACT-based passive clearing.</a> Exp Mol Med. 48 (12), 274 (2016).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>Roberts, D. G., Johnsonbaugh, H. B., Spence, R. D., MacKenzie-Graham, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+clearing+of+the+mouse+central+nervous+system+using+passive+CLARITY.">Optical clearing of the mouse central nervous system using passive CLARITY.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+A+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: A simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Choi, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products+in+neurons+and+astrocytes+in+a+triple+transgenic+mouse+model+of+Alzheimer's+disease.">Increased expression of the receptor for advanced glycation end products in neurons and astrocytes in a triple transgenic mouse model of Alzheimer's disease.</a> Exp Mol Med. 46, 75 (2014).</li><li>Chang, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contralaterally+transplanted+human+embryonic+stem+cell-derived+neural+precursor+cells+(ENStem-A)+migrate+and+improve+brain+functions+in+stroke-damaged+rats.">Contralaterally transplanted human embryonic stem cell-derived neural precursor cells (ENStem-A) migrate and improve brain functions in stroke-damaged rats.</a> Exp Mol Med. 45, 53 (2013).</li><li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+differential+plaque+depositions+in+the+brains+of+Tg2576+and+Tg-APPswe/PS1dE9+transgenic+mouse+models+of+Alzheimer+disease.">Analysis of differential plaque depositions in the brains of Tg2576 and Tg-APPswe/PS1dE9 transgenic mouse models of Alzheimer disease.</a> Exp Mol Med. 44 (8), 492-502 (2012).</li><li>Kinameri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prdm+proto-oncogene+transcription+factor+family+expression+and+interaction+with+the+Notch-Hes+pathway+in+mouse+neurogenesis.">Prdm proto-oncogene transcription factor family expression and interaction with the Notch-Hes pathway in mouse neurogenesis.</a> PLoS One. 3 (12), e3859 (2008).</li></ol>

大幅改善の前の組織をわかりやすく2,3,4、7等をクリアで達成一貫性協定受動的、非電気泳動抽出方法に勤めている間,8テクニックが最も急を要するが最大組織明確12を達成するために必要な時間の長さ、いくつかの欠点はいまだに。現在の研究では、組?...

科学的・臨床的調査の基本的な目的を含む器官の構造と機能の完全な理解を達成します。ただし、哺乳類の器官の非常に複雑な性質はしばしば完全に1この目的を達成するために障壁として機能します。透明度 (明確な脂質交換アクリルアミド ハイブリダイズ剛体イメージング互換かみしめハイドロゲル)2,3,4、そのまま組織からアクリルアミド ベース ハイドロゲル ハイブリッドを構築する関係を実現します。その構造的な整合性の5を維持しながら脳、肝臓、および脾臓を含む臓器の様々 な光のクリアランス。明快さは可視化だけでなく、複雑な携帯電話ネットワークとを区分することがなく組織形態を細かく分析する機会に従ってきました。
組織クリアランスを達成するために明快さは、手でサンプルの脂質含量を削除する電気泳動法を採用しています。電気泳動の組織の清算 (など) の方法を使用が褐変、エピトープ損傷を含む組織品質の面で様々 な結果を生成することを研究で示されている明快さは物理的に安定した組織ハイドロゲルのハイブリッド車を生産するために注目されている中、蛋白質の損失の5,6。これらの問題に対処するため、パッシブ、イオン洗剤ベース脱脂法など治療に置き換えます、協定 (受動的な明快さ技術) などのプロトコルの修正は先進7,8,9をされています。にもかかわらず、結果の一貫性を達成するため、ただし、協定は最大の認可を得るためのより多くの時間を必要です。さらに、これらの技術のどれもが、CNS フォーム全体またはラット、モルモットなど大きい齧歯動物モデルで適用まだされています。
本研究は、psPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定)、全体の中枢神経系と内臓マウスとラットの両方のモデルのための10の高速のクリアランスを促進するための新規方法論を提案し、これらの制限に対処しようとします。具体的には、psPACT プロセス 0.25% と 4% アクリルアミド組織ハイドロゲル形成; 中に 2 つの別々 の手順で VA-044mPACT は基本的に同じ手順が含まれますが、0.5% α-チオグリセ キー試薬として、SDS 決済ソリューションのサプリメントします。両方の技術は、光クリアランスを生成するために必要な時間を大幅に削減する内因性の全身と脳脊髄液循環システムを活用します。原理の証拠として我々 はクリア組織10血管パターンを分析する共焦点顕微鏡の使用を示します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix, Inc.</td>
			<td>75819</td>
			<td>Clearing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nycodenz</td>
			<td>Axia-Shield</td>
			<td>1002424</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% Acrylamide Solution</td>
			<td>Bio Rad Laboratories, Inc.</td>
			<td>161-0140</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,2&#180;-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] Dihydrochloride</td>
			<td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td>
			<td>017-19362</td>
			<td>Polymerization (VA-044)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Thioglycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1753-100ML</td>
			<td>Clearing solution (mPACT)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Georgiachem</td>
			<td>9005-64-5</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787-50ML</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Bovogen</td>
			<td>BSA100</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>375095</td>
			<td>Perfusion (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002-25G</td>
			<td>nRIMS solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PECAM-CD31 antibody</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-28188</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit-IgG Cy3 fluorescent conjugate</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Inc.</td>
			<td>111-165-003</td>
			<td>Immuno Staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPP-9004</td>
			<td>Perfusion, Polymerization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X Phosphate Buffered Saline (pH 7.4)</td>
			<td>Tech &#38; Innovation</td>
			<td>BPB-9121</td>
			<td>Perfusion, Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL stripette</td>
			<td>Coatar</td>
			<td>4488</td>
			<td>Solution transfer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td>Clearing tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm Cell culture dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>20035</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal dish</td>
			<td>SPL</td>
			<td>211350</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>26G 1/2</td>
			<td>Anesthetize&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Korea vaccine Co., Ltd</td>
			<td>21G1 1/4</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrylamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3553</td>
			<td>Polymerization (A4P0)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman 3MM paper</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z270849</td>
			<td>Blotting paper for gel removal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM780</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN lite Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>ZEN 2012</td>
			<td>Imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Longerpump</td>
			<td>BT100-1F</td>
			<td>Perfusion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Lifecanvas Technologies</td>
			<td>EasyGel</td>
			<td>Tissue gel hybridization system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

novel passive clearing methods for the rapid production of optical transparency in whole cns tissue

明快さの開発以来らせんの技術をクリアできる透明な組織内三次元表現型写像立方 (明確な遮るもののない脳イメージングを含む新規クリア方法論の多数カクテルと解析) スイッチ (対話時間のシステム全体にわたるコントロール) および化学物質の体内動態、マップ (拡大、プロテオーム解析)、および協定 (受動的な明快さテクニック)、更なる拡大のため既存のツールキットに確立されています。生体組織の顕微解析。本研究の目的を改善し、全体の中枢神経系 (CNS)、腎臓、脾臓、および全体のマウス胚を含む無傷の齧歯動物組織の配列の元の協定の手順を最適化します。PsPACT (別のプロセス協定) と mPACT (変更された協定) と呼ばれる、これらの手法は、細胞回路をマッピングとそのまま正常および病的組織における細胞内の構造を視覚化する非常に有効な手段を提供します。次のプロトコルの psPACT と mPACT を介して構造完全性の最小の侵入と最大組織クリアランスを実現する方法について詳細なステップバイ ステップの概要を提供します。

最適化された受動的なクリアリングの技術を使用して全体の中枢神経系の透明なモデルの生成
マウスおよびラットの全中枢神経組織の光のクリアランスは、様々 な受動的なクリアリング テクニック (図 1) を使用して急速に達成されました。時間をかけてクリア組織の模式図を<strong class...

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Novel Passive Clearing Methods for the Rapid Production of Optical Transparency in Whole CNS Tissue

新規パッシブ全体の中枢神経系組織における光透過性の急速な生産のための方法をクリア

MPACT 最大の光透過性とそのまま齧歯動物のティッシュ血管系の後続の顕微解析を実現するため、psPACT 2 つの新しい方法論を提案するここでは、全体の中枢神経系。

Since the development of CLARITY, a bioelectrochemical clearing technique that allows for three-dimensional phenotype mapping within transparent tissues, ...

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