Name: broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds
Uploaded: 2018-02-14T15:00:00
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岬-ブラジル、研究集会-ブラジル、FAP/DF の金融支援に感謝いたします。原稿の校正のため博士ヒューゴ コスタ ・ パエスに感謝しております。

1. ソリューションとメディア
<ol><li>2 X ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 媒体、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、サブロー ・ デキスト ロース ・ スープ、表 1に従ってサブロー デキスト ロース寒天培地を準備します。</li>
</ol>2. 真菌の菌の成長条件
<ol><li>必要になるまで、-80 ° c、35% のグリセロールで凍結する在庫としてすべての真菌系統を格納します。</...

<ol>
	<li>Armstrong-James, D., Meintjes, G., Brown, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+neglected+epidemic:+fungal+infections+in+HIV/AIDS.">A neglected epidemic: fungal infections in HIV/AIDS.</a> Trends Microbiol. 22 (3), 120-127 (2014).</li><li>Romani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunity+to+fungal+infections.">Immunity to fungal infections.</a> Nat Rev Immunol. 11 (4), 275-288 (2011).</li><li>Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+drug+resistance:+mechanisms,+epidemiology,+and+consequences+for+treatment.">Antifungal drug resistance: mechanisms, epidemiology, and consequences for treatment.</a> Am J Med. 125 (1 Suppl), S3-S13 (2012).</li><li>Hancock, R. 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CLSI document M27-A3. , (2008).</li><li>Guilhelmelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+Scorpion+Venom-Derived+Antifungal+Peptides+against+Planktonic+Cells+of+Candida+spp.+and+Cryptococcus+neoformans+and+Candida+albicans+Biofilms.">Activity of Scorpion Venom-Derived Antifungal Peptides against Planktonic Cells of Candida spp. and Cryptococcus neoformans and Candida albicans Biofilms.</a> Front Microbiol. 7, 1844 (2016).</li><li>Roongruangsree, U. T., Kjerulf-Jensen, C., Olson, L. W., Lange, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viability+Tests+for+Thick+Walled+Fungal+Spores+(ex:+Oospores+of+Peronospora+manshurica).">Viability Tests for Thick Walled Fungal Spores (ex: Oospores of Peronospora manshurica).</a> Journal of Phytopathology. 123 (3), 244-252 (1988).</li><li>Boedijn, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+as+stain+for+fungi.">Trypan blue as stain for fungi.</a> Stain Technol. 31 (3), 115-116 (1956).</li><li>Goihman-Yahr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+plating+efficiency+and+estimation+of+viability+of+suspensions+of+Paracoccidioides+brasiliensis+yeast+cells.">Studies on plating efficiency and estimation of viability of suspensions of Paracoccidioides brasiliensis yeast cells.</a> Mycopathologia. 71 (2), 73-83 (1980).</li><li>Tati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histatin+5-spermidine+conjugates+have+enhanced+fungicidal+activity+and+efficacy+as+a+topical+therapeutic+for+oral+candidiasis.">Histatin 5-spermidine conjugates have enhanced fungicidal activity and efficacy as a topical therapeutic for oral candidiasis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58 (2), 756-766 (2014).</li><li>Petrou, M. A., Shanson, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+of+Cryptococcus+neoformans+by+the+NCCLS+microdilution+and+Etest+methods+using+five+defined+media.">Susceptibility of Cryptococcus neoformans by the NCCLS microdilution and Etest methods using five defined media.</a> J Antimicrob Chemother. 46 (5), 815-818 (2000).</li><li>Zaragoza, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process+analysis+of+variables+for+standardization+of+antifungal+susceptibility+testing+of+nonfermentative+yeasts.">Process analysis of variables for standardization of antifungal susceptibility testing of nonfermentative yeasts.</a> Antimicrob Agents Chemother. 55 (4), 1563-1570 (2011).</li><li>Rodriguez-Tudela, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+shaking+on+antifungal+susceptibility+testing+of+Cryptococcus+neoformans:+a+comparison+of+the+NCCLS+standard+M27A+medium,+buffered+yeast+nitrogen+base,+and+RPMI-2%+glucose.">Influence of shaking on antifungal susceptibility testing of Cryptococcus neoformans: a comparison of the NCCLS standard M27A medium, buffered yeast nitrogen base, and RPMI-2% glucose.</a> Antimicrob Agents Chemother. 44 (2), 400-404 (2000).</li><li>Beggs, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+phase+in+relation+to+ketoconazole+and+miconazole+susceptibilities+of+Candida+albicans.">Growth phase in relation to ketoconazole and miconazole susceptibilities of Candida albicans.</a> Antimicrob Agents Chemother. 25 (3), 316-318 (1984).</li><li>Alcouloumre, M. S., Ghannoum, M. A., Ibrahim, A. S., Selsted, M. E., Edwards, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungicidal+properties+of+defensin+NP-1+and+activity+against+Cryptococcus+neoformans+in+vitro.">Fungicidal properties of defensin NP-1 and activity against Cryptococcus neoformans in vitro.</a> Antimicrob Agents Chemother. 37 (12), 2628-2632 (1993).</li></ol>

希釈テスト目標化合物、化合物の少量を使用して潜在的な抗真菌活性を解析したり、同時に濃度の範囲でそれをテストします。したがって、潜在的な新規抗真菌化合物のスクリーニングの最初のステップとしては、このプロトコルの使用をお勧めします。ここで提示されたプロトコルは、抗真菌療法診療所の選択を支援するために設計、M27 A3 プロトコルに基づいており、さまざまな新しい抗...

真菌感染症となっている重要な医学的関心最近数十年でがん治療と HIV/エイズとともに生きる人の受診者など免疫不全の個体数の増加を主因は増大したことや臓器1,2を移植しました。ただし、使用可能な抗真菌薬の非常に限られた配列とそれらにカビ抵抗性の報告数の増加が全身性真菌症3の治療法に関する主要な問題に貢献します。
新規抗真菌化合物の潜在的なソースは、抗菌ペプチド (アンペア)、感染4彼らの生得の免疫反応の一部として多くの生物によって生成される小さなカチオン性ペプチドです。それにもかかわらず、真菌病原体に対するこれらの化合物をテストするスクリーニング法は標準化されていません。異なったプロシージャは、時に同じモデル微生物5,6,7アンペアの抗真菌活性を評価するために使用されています。これらの相違点といくつかのプロトコルの細部の欠乏は、化合物とフラワーの再現性比較を複雑にします。
新しい薬剤の候補者の試験を標準化する方法の 1 つは、臨床などの臨床現場における抗真菌薬感受性を定義するために使用し、実験室標準研究所 (CLSI) M27 A3 のガイドラインに従うことです。ただし、これらの抗真菌薬感受性試験が厳しすぎると考慮しない代謝の変化を考察種類を渡って、彼らはのみいくつかの [エージェントの確立されました。たとえば、とることはありません考慮非発酵性酵母の代謝の必要な。
このプロトコルにより、将来の抗真菌活性物質の活動の評価と抗真菌ペプチドの検索ここに実装されています。それは、新しい化合物8,9のスクリーニングを最適化修正 CLSI M27 A3 ガイドラインからスープ希釈感受性テストに基づいています。これらの変更はコントロールとして参照を抗真菌薬の使用で結果を標準化しながら、最適の事前テスト成長少量化合物の温度や初期とさまざまなメディアでのバリエーションの使用を許可します。ウェル培養皿の使用で、このメソッドでは、画面多数の化合物の迅速かつ確実に可能です。
その固有の柔軟性のため化合物のいくつかの適応で、他の微生物に対する別の化学の授業でこのプロトコルを使用することができます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Media and Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium with l-glutamine, without sodium bicarbonate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31800-022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-(N-morpholino) propane sulfonic acid (MOPS) (o que a gente usa tem um s&#243;dio, completa o nome dele please)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>Use to buffer 2X RPMI medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Din&#226;mica</td>
			<td>1528-1</td>
			<td>137 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>3040-01</td>
			<td>2.7 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000129</td>
			<td>10 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>60230</td>
			<td>2 mM for Phosphate buffered saline (PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud dextrose broth</td>
			<td>BD</td>
			<td>238230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Difco Sabouraud Dextrose Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>210950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V000123</td>
			<td>35% for (solu&#231;&#227;o de estoque? Criopreserva&#231;&#227;o?)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Para dilui&#231;&#227;o das drogas na dilui&#231;&#227;o seriada</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antifungal drugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caspofungin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PHR1160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastics</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.547.254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dish petri</td>
			<td>J.Prolab</td>
			<td>0304-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Solution Reservoir</td>
			<td>KASVI</td>
			<td>K30-208</td>
			<td>Use to pippet the solutions using the multichannel pippet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment and other materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>E200MV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugue</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>MegaFuge 16R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Ethik Technology</td>
			<td>403-3D</td>
			<td>Set to 37&#176; C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E25</td>
			<td>Set to 37&#176; C, 200 RPM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting chamber, Neubauer</td>
			<td>BOECO Germany</td>
			<td>BOE 13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>HTL</td>
			<td>5123</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

broth microdilution in vitro screening: an easy and fast method to detect new antifungal compounds

真菌感染症になっている最後の十年の重要な医療条件ですが使用可能な抗真菌薬の数は限られています。このシナリオでは、新しい抗真菌薬のサーチが必要です。ここで報告されるプロトコルは、抗真菌薬のプロパティの画面のペプチドにメソッドを詳しく説明します。それは潜在的な新しい抗真菌薬としての抗菌ペプチドの研究に合わせて変更と臨床と研究室の標準研究所 (CLSI) M27 A3 ガイドラインからスープの希釈感受性テストに基づいています。このプロトコルは、抗真菌化合物の活性を評価する機能の試金を記述および調査の下の分子の特定のクラスに合わせて簡単に変更可能性があります。法は、少量を使用して 96 ウェル プレートで実行される、大規模スクリーニングは、特に場合は、自動設定で実施時間の短時間で完了できます。この手順では、標準化された、調節可能な臨床プロトコルが真菌症の治療を改善するために新しい分子のベンチ作業の追求を助けることができる方法を示しています。

マイクは、潜伏期間の終わりに目に見えるカビを完全に阻害する最も低い抗菌化合物の濃度として定義されます。任意も濁度負/増殖制御井戸に似ていますが、明確なメディア空井戸のようで、よくは肯定的な結果を考慮この議定書の目的は画面の潜在的な抗真菌薬の高速メソッドを持っているため、否定的な考え。ただし、指定されたアンプは菌や殺菌するかどうか...

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Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

抗真菌化合物をスクリーニングするための簡単と適応のスープ微量液体希釈法。

スープ希釈の in Vitroスクリーニング: 新しい抗真菌化合物を検出するための簡単かつ高速メソッド

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