Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Karen M. Qiang var 2016 modtageren af George J. Schroepfer Research Award på Rice University. Fanli Zhou er modtageren af en undervisning stipendium fra Rice University. Tjenester af Bloomington Drosophila Stock Center, Harvard tur facilitet, Wien Drosophila Resource Center er taknemmeligt erkendt.

1. forberedelse af larver
<ol><li>To eller flere dage før du begynder analysen, oprette krydsninger af den ønskede eksperimentelle og styre kombinationer (minimum 20 hunner og 10 hanner hver) i ægget-lay retter som beskrevet af Wieschaus og Nusslein-Volhard 13 men bruger 50 mL polypropylen bægre og 6,0 cm engangs petriskåle indeholdende drue agar og smurt med gær pasta lige før brug. Holde fluerne i ægget-lay retter i mørke ved stuetemperatur indtil det skal bruges.</li>
	<li>Drue agar opskrift – kombinere 100 mL frosne 100% drue saft koncentrat, 350 mL deioinized vand, 5 mL iskold eddikesyre og 13 g D. melanogaster agar i en 1 L glas bægerglas. Mikrobølgeovn i 1-2 min byger, omrøring mellem byger, indtil agaren er opløst. Afkøle løsningen i et par minutter, derefter tilsættes 10 mL 10% (w/v) af Nipagen (methyl-p-hydroxybenzoat) i 95% ethanol. Mix, så pipette 7 mL pr. plade i engangs 6,0 cm petriskåle, gør det muligt at gel og tørt ved stuetemperatur i 3-4 h. butik på 4 0C i plastikposer.</li>
	<li>Gær pasta opskrift-7 g tørret gær, 10 mL deioniseret vand, blandes med en spatel indtil ensartet konsistens.</li>
	<li>Timet æg samlinger til at generere eksperimentelle og styre larver. Brug af nye, gær-smurt, drue plader, indsamle æg stuetemperatur i 4 timer i mørke i morgentimerne. Fjerne disse 4 h samling plader og erstatte med frisk plader. Inkuber 4 h samling plader overnatning på 25 0C indtil om eftermiddagen den næste dag, da de fleste af larverne vil har udklækket. Indsamle disse første instar larver og bruge dem til opsætning af eksperimentet.</li>
</ol>2. opsætning af assay plader
<ol><li>Udarbejdelse af analysen plader. For en enkelt kørsel af analysen, forberede fem assay plader hver af 10 eksperimentelle larver og fem plader af 10 kontrol larver. Brug et 1,5 cm kork soegeren til at fjerne en central kerne af agar fra hver plade, at skabe et hul til maden. Sætte gær pasta (0,8 - 0,9 g) i hullet og dup forsigtigt med en spatel til at gøre en bunke fylde hullet.</li>
	<li>Agar plade forberedelse – kombinere 700 mL deioniseret vand med 16 g D. melanogaster agar i en 2 L glas bægerglas og mikroovn i 5 min. Fjern fra mikrobølgeovn og omrøres med en glasstav at bringe uopløst agar i løsningen. Tilføje 17,5 mL 10% (w/v) Nipagen 95% ethanol, mix, derefter fortsætte mikrobølgeovn varme i 30 s byger efterfulgt af omrøring, indtil alle agaren er fuldstændig opløst. Cool for et minut eller to, derefter afpipetteres 15 mL alikvoter i 10 cm plastik petriskåle. Tillad agar til gel, dæk plader med låg og lad dem tørre ved stuetemperatur i et par timer eller natten over. Store plader i forseglede plasticposer ved 18 ° C. Bemærk 1: For at undgå dannelsen af Nipagen krystaller på overfladen af pladerne på grund af overskydende dessiccation, skal du bruge plader inden for et par dage med forberedelse. Hvis det er nødvendigt, kan krystaller opløses igen ved at droppe et par microliters af 95% alkohol på dem. Note 2: partier af agar kan have forskellige geldannende egenskaber. Tør gel pladerne skal være fast at røre og tilstrækkeligt modstandsdygtige, en ren, intakt cirkel af agar kan fjernes, når du bruger cork soegeren oprette mad hul (se ovenfor).</li>
	<li>Opsætning af larver i assay plader. Bruge mekanisk pres kurven spidsen af en plastik microspatula og dyppe spidsen i gær pasta til at give "klæbende" for opsamle larver. Afhente første instar larver individuelt og placere dem på agar plade tæt på mad højen. Forbered mindst fem Repliker plader af 10 larver for både eksperimentelle og kontrol genotyper. Når først færdig, cap og mærke hver plade og sæt plader (låg side opad) i et mørkt rum ved stuetemperatur (i vores lab er 22 ° C).</li>
</ol>3. overvågning assay plader
<ol><li>Undersøge plader dagligt under en dissekere mikroskop og registrere antallet af larver på toppen af maden eller ud på agar overfladen. Bemærk nogen synlige døde eller døende larver. Bemærk Når, og hvis tunnelføring i agar undergrundens ses larver bevæger os ind i tredje instar. Bemærk datoer som pupper begynder at danne og Bemærk eventuelle puppe abnormiteter. Fortsat daglige observationer, indtil alle larver er døde eller pupated.</li>
	<li>Fjerne pupper omhyggeligt fra pladen med en bøjet drille nålen og overførsel til en drue plade. Hvis det ønskes, fortsat overvågning pupper Bestem hvor mange velsmagende som voksne.</li>
</ol>4. forberedelse assay plader til billedbehandling
<ol><li>Forsigtigt fjerne og kassere alle gær fødevarer fra de centrale godt af hver plade.</li>
	<li>Forsigtigt oversvømme hver plade med vand fra hanen og bruge en blød kunstner maling børste til forsigtigt gnide off rester, der har været spores på agar overfladen. Erstatte vandet flere gange og fortsætte med skånsom tandbørstning indtil hver plade er helt ren. Giv plader en sidste skylning med deioniseret vand, cap dem og forlade ved rumtemperatur natten til tørre. Bemærk: Tunnelføring i agaren er mest intens omkring mad højen (se figur 2). Som et resultat, udvidet rand af mad hul normalt ud over den indledende 1,5 cm i diameter. Derudover kan skrøbeligheden af den arbejdede agar i denne region forårsage små stykker af tunnelført agar er tabt fra omkredsen af hullet under rengøring. Stigende gel agarkoncentration kunne hjælpe med disse problemer, men korrektioner er muligt under billedet J kvantitering trin (se nedenfor).</li>
</ol>5. kvantificering af tunnelføring
<ol><li>Billede af plader. Forberede et billede af hver plade taget mod en sort baggrund for at vise tunnelerne i agaren som lyse hvide linjer. Bemærk: Vi bruger et system, der er almindeligt anvendt til at afbilde DNA geler til dette trin (Se tabel af materialer og reagenser). Alternativ billedsystemer kan skabe tiff-filer, såsom digitale kameraer eller mobiltelefon-kameraer kan modificeres til at producere passende billeder.</li>
	<li>Bruge programmet offentlige domæne NIH billede Jørgensen til at kvantificere larve tunneling. Downloade programmet fra http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Yderligere oplysninger om automatisk gå til http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Bemærk: Andre billeddiagnostiske systemer kan bruges til at kvantificere tunneling. Instruktionerne nedenfor gælder for NIH billede J.</li>
	<li>Efter åbning af en tiff-fil billede af en tunneling plade, skal du bruge værktøjet Oval for at definere et område for kvantitering, der repræsenterer hele agar overfladen men afgrøder ud plastic kanten af pladen.</li>
	<li>Anvend den automatiske tærskel for at producere et omvendt billede af pladen, med tunneler viser som sorte streger. Bruge farvevælgeren og pensel værktøj til hvid ud nogen sorte områder, der repræsenterer skader til agar snarere end tunneler.</li>
	<li>Vælg sæt skala under rullemenuen analyser | Klik for at fjerne skala og derefter på vinduet sæt målinger (også under Analyze) kontrollere område og grænse til tærskel.</li>
	<li>Tryk på CTRL tasten + M-tasten for at vise den sorte område (tunneler) i pixel.</li>
	<li>Kopiere og indsætte pixelværdi for hver plade er i et regnearksprogram (som Excel), der vil tillade kvantitativ analyse.</li>
	<li>Centralt hul er normalt udvidet på grund af intens tunnelføring i denne region. For at kvantificere den manglende tunneling, uncheck "Begræns til tærsklen" og bruge værktøjet tryllestav til at definere den centrale hul. Tryk på CTRL tasten + M for at få pixelværdien af dette område. Trække fra denne værdi pixelværdi af en 1,5 cm hul og tilføje forskellen til den opnåede i trin 5.6 tunneling værdi.</li>
	<li>For nogle plader, kan centralt hul mangle en brik af tunnelført agar, der omfatter et område på untunneled agar støder op til hullet. Når quantitating centralt hul til disse plader brug børste farvevælgeren og maling værktøjer til at tilføje en sort bjælke på tværs af regionen mangler at definere tunnelført regionen og udelukke ikke-tunnelforbindelsen området fra kvantitering. Bemærk 1: Hvis de eksperimentelle larver udføre enhver tunnelføring, tillader denne kvantitering beregning af gennemsnit tunnelføring for sæt af plader og statistisk sammenligning af kontrol og eksperimentelle værdier.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer, de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Vi har præsenteret her en simpel assay designet til at påvise væv hypoxi i D. melanogaster larver. Diagnosen er baseret på nedsat gravende ind i mad gravhøje i larve opvækst og fraværet af undergrundens tunneling sent i larve liv. Larve fortrængning kan forårsage for tidlig migration fra en fødekilde og dermed et kritisk aspekt af analysen er at et lille antal larver er analyseret i overværelse af et stort overskydende mad. Inkludering af fungicid methyl-p hydroxyl benzoate (Nipagen) i agar plader er også afgørende for at forhindre skimmelvækst under analysen.
Vi finder, at agar plader kan være en kilde til variation i analysen. Typisk, larver af den samme genotype, fra forskellige partier af forældre eller fra forskellige samlinger af larver, Vis relativt begrænset variation i deres adfærd i analysen. Derimod agar plader lavet på forskellige dage eller med forskellige batches af agar kan give forskelle i tunneling. En betingelse er derfor at kontrol og eksperimentelle larver bør alle være testet ved hjælp af agar plader fra den samme batch forberedelse. Agar fra forskellige producenter eller endda forsendelser fra samme fremstilling kan variere i deres geldannende styrke, og så kan det være nødvendigt at justere agarkoncentration opad fra 2,2% bruges her til at opnå en optimal gel. Vi har fundet, at vildtype larver kan let graver gennem 3% agar geler.
For at vise værdien af denne analyse, har vi brugt det til at undersøge potentielle væv hypoxi i larver med undertrykt funktion af uninflatable i tracheae. Vores resultater giver stærke støtte til den hypotese, at tab af luftrør udtryk for dette gen kan producere hypoxi: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver viste manglende graver sig ned i fødevarer og komplette fravær af undergrundens tunneling under den tredje instar. I vores forudgående undersøgelser af andre genotyper, konstaterede vi, at hypoxi-induceret tab af mad gravende ikke er så komplet som tab af undergrundens tunneling og btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver studerede her opførte sig på samme måde. Den mislykkede tunneling komponent af denne analyse giver derfor det stærkeste tegn på hypoxi.
Selv om btl-Gal4 > uif RNAi larver viste adfærdstræk diagnostiske af hypoxi, de skære(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi ikke udstille disse abnormiteter. Btl og skære(ue) Gal4 drivere er udtrykt på forskellige stadier, og i forskellige mønstre, inden de larve tracheae. Btl-Gal4 driver kommer til udtryk i hele trakeal systemet med udgangspunkt i sin udvikling i embryogenese og fortsætter gennem larve liv. I kontrast, Gal4 udtryk fra de skære(ue)-Gal4 driver kun begynder i slutningen af embryonale liv, efter morfogenese af tracheae, og er begrænset til de ekstreme bageste afsnit af de dorsale kufferter, den store langsgående fartøjer luftrør systemet. UIF knockdown med denne Gal4 kan ikke reducere uif udtryk derfor tidligt nok eller stort nok til at producere nogle tærskelniveauet for hypoxi kræves for at udløse opførsel målt i denne analyse.
En forudgående undersøgelse fandt, at tredje instar larver udsat for lav (10%) ilt niveauer viser nedsat vækst og forsinkede debut af pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver studerede her udviklet sig til den tredje instar men virkningerne på deres vækst og pupation satser var mere udtalt: de var betydeligt mindre end kontrol med meget lidt fedtvæv under den epidermis (figur 3) og kun en mindre fraktion (~ 10%) forsøgt pupariation. Disse forskelle tyder btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver oplevet en større grad af hypoxi, enten fordi uif knockdown i tracheae var til stede hele livet hele larve, eller fordi det er produceret en mere svær iltmangel i tredje instar. Hvordan tab af uif funktion i tracheae kan forhindre ilt transport er uklare på dette punkt. Tracheae af btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver var let synlige gennem neglebånd (figur 3), tegn på at de indeholdt luft og blev ikke skadet til det punkt, at væske post kompromitteret funktion. Derfor er det formelt muligt at luftrør skade lavet af tab af uif funktion ikke fremkalde hypoxi, men derimod nogle andre fejl, der hæmmer tunneling. For genotyper undersøgt tidligere, vi har besluttet at undladelse af at tunnel er forbundet med forhøjede niveauer af LDH mRNA7, de kanoniske indikator af glykolyse og hypoxi i slutningen tredje instar larver 15. Således endelig bekræftelse af hypoxi for btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver (og i larver undersøgt fremover bruge dette assay) ville indebære RT-PCR for at vurdere LDH mRNA niveau eller brug af et kommercielt tilgængelige indikator til at måle intracellulære ilt niveauer (for eksempel Se 16).

Den sofistikerede vifte af molekylær genetiske værktøjer til rådighed i D. melanogaster gør det en værdifuld organisme for studiet af evolutionært bevarede biologiske processer. Centrale molekylære svar til ilt tilgængelighed har vist sig at være bevaret på tværs af evolution og forudgående undersøgelser i D. melanogaster har genereret indsigt i de universelle komponenter af disse signalering veje 1,2, 3,4,5,6.
Som led i en undersøgelse med henblik på dissekere sensoriske neuron funktion i D. melanogaster larver, identificeret vi to adfærdsmæssige reaktioner, der viste sig at blive aktiveret af væv hypoxi på normale ilt niveauer 7. En af disse, undladelse af at graver sig ned i maden, er stærkt relateret til svar på lav ilt niveauer rapporteret af Wingrove og O'Farrell 8. Den anden adfærd, manglende tunnel i en blød undergrundens under den sene tredje instar vandrer fase, havde ikke tidligere identificeret som hypoxi-relaterede. Vi besluttet at udsætte vildtype vandrer larverne til lavt iltindhold også hæmmer undergrundens tunneling 7, således om oprettelse af at begge disse adfærdsmønstre stammer fra hypoxi - enten induceret af vævsskader eller lavt iltindhold indtag. Her beskriver vi en analyse, vi har udviklet for at kvantificere disse to hypoxi-induceret opførsel, som starter med observationer umiddelbart efter larve udklækningen.
Hypoksiske svar i de tidlige larve faser er ikke undersøgt tidligere og derfor udfører en analyse i hele larve liv er en værdifuld del af vores analyse. De fleste af de åbenlyse manifestationer af hypoxi-langsom udvikling, dårlig vækst og bevægeapparatet træghed-overlapper med larve fænotyper produceret af mange mutationer. Men vi har fundet, at kun tredje instar larver med hypoxi viser en total mangel på tunnel 7. Dermed, vi besluttet at selv larver mere kompromitteret vækst og bevægelse end vores hypoksiske larver, stadig udført nogle tunneling, hvorimod hypoksiske larverne aldrig tunnelforbindelsen 7. Et andet værdifuldt element af denne analyse er således, at det giver en måde at etablere når hypoxi er kilden til et bestemt sæt af pleiotrope fænotyper, i modsætning til nogle andre stress eller metaboliske funktionsfejl. Som en demonstration af analysen her beskriver vi dets anvendelse i kendetegner svar af larver med reduceret trakeal udtryk for uninflatable, et gen, der fungerer i larve airways 9.
Vi forestiller os, at denne analyse vil være af værdi for forskere involveret i kendetegner larve fænotyper, der omfatter dårlig vækst og træg adfærd. Som et resultat, nye gener, der har indflydelse på distribution, forbrug eller svar til, kunne ilt rundt i kroppen identificeres. Yderligere, indarbejde denne analyse i en mutant screening protokol ville give en direkte rute til at identificere mutationer, der producerer hypoxi. Denne analyse vil også være værdifulde i at analysere det kredsløb, der fremkalder hypoxi-induceret medfødte adfærd beskrevet her. Neurale netværksanalyse af denne type er fokus for megen Aktuel forskning og enkel nervesystemet af D. melanogaster larve er et værdifuldt system til dissekere ud automatiseret adfærd. Sensoriske neuroner involveret i larve ilt opfattelse er allerede konstateret, at give et første skridt i retning af definere den komplette kredsløb for hypoxi-induceret svar 10,11. Ved hjælp af vores analyse i kombination med selektiv neurale knockdown via GAL4-UAS system12 er en klar rute for afgrænse yderligere komponenter af neurale netværk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Iltmangel hos dyr kan skyldes eksponering for lav atmosfæriske ilt niveauer eller fra indre vævsskade, der forstyrrer ilt distribution. Det er også muligt, at afvigende adfærd af ilt-sensing neuroner kunne fremkalde hypoxi-lignende adfærd i overværelse af normal ilt niveauer. I D. melanogasterresultater udvikling på lavt iltindhold i hæmning af væksten og træg adfærd under de larve faser. Men disse etablerede manifestationer af ilt underskud overlapper betydeligt med fænotyper af mange mutationer, der regulerer vækst, stress svar eller bevægelse. Som resultat er der i øjeblikket ingen tilgængelige til at identificere i) cellulære hypoxi forårsaget af en mutation eller ii) hypoxi-lignende opførsel når induceret af unormal neuronal opførsel analyse.
Vi har for nylig identificeret to karakteristiske opførsel i D. melanogaster larver, der finder sted på normale iltindholdet i svar på intern registrering af hypoxi. Først, undgå sådanne larver på alle stadier, gravende ind i maden, ofte forvilde sig langt væk fra en fødekilde. For det andet er tunnelføring i en blød undergrundens, som normalt opstår i vandrer tredje instar fase helt afskaffet hvis larver er hypoksiske. Analysen beskrevet her er designet til at detektere og kvantificere disse adfærdsmønstre og dermed til at give en måde at opdage hypoxi induceret af indre skader i stedet for lave eksterne ilt. Assay plader med en agar-substrat og en central plug gær pasta bruges til at understøtte dyr gennem larve liv. Holdninger og tilstand af larver registreres dagligt, når de går videre fra første til tredje instar. Omfanget af tunnelføring i agar undergrundens vandrer fase er quantitated efter pupation ved hjælp af NIH ImageJ. Analysen vil være af værdi med at afgøre hvornår hypoxi er en komponent af en mutant fænotype og dermed give indsigt i mulige steder for det pågældende gen.

Som en demonstration af værdien af denne analyse har vi brugt det til at undersøge potentielle hypoxi i larver med nedsat funktion af genet uninflatable (uif) i tracheae. UIF koder en store transmembrane protein, der er stærkt udtrykt på den apikale overflade af larve trakeal celler. Mutanter af uif var tidligere bemærket for at udstille afvigende adfærd, der kunne indikere væv iltmangel på grund af luftrør funktionsfejl 9. Vi undertrykt specifikt uif udtryk i larve luftrøret ved hjælp af Gal4-UAS system. To Gal4 linjer blev brugt: Jeg) åndeløs (btl)-Gal4, som er udtrykt stærkt i tracheae fra begyndelsen af deres embryonale udvikling og ii) skæres(ue)-Gal4, der begynder udtryk i en lille posterior region i de dorsale hovedstammen tracheae i slutningen af embryogenese og fortsat stærke udtryk i denne region i hele larve liv 7. En UAS -uif RNAi linje blev indhentet fra Wien Drosophila Research Center (VDRC ID #1050).
Som beskrevet i ovennævnte protokol, replikere 5 plader af nyklækkede første instar larver var sat op til hvert af fire Kors som følger.
Eksperiment 1 1) kontrol 1 - cut(ue)-Gal4 x Canton-S (+) 2) eksperimentel 1 - cut(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Eksperiment 2 3) kontrol 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+) 4) eksperimentel 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
Opførsel af skære(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larver af eksperiment 1 var sammenlignelig med den kontrol skære(ue)-Gal4 > + dyr gravende, tunneling og overlevelse til pupation, (figur 1 og figur 2). Derimod produceret ned-regulering uif udtryk gennem hele trakeal systemet fra tidligt i udviklingen (eksperiment 2) markant forskellige svar. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver vises begge adfærdsmæssige manifestationer af væv hypoxi – reduceret mad gravende og en total mangel på undergrundens tunneling senere i larve liv (figur 1 og figur 2 ). De eksperimentelle larver var også mærkbart mindre, tyndere og mere træg end kontrol (figur 3), og viste en høj dødelighed i løbet af analysen. Som omtalt ovenfor, er nedsat vækst, træghed og kropsligt død kendt symptomer på larve hypoxi. Desuden, instar de fleste af de eksperimentelle larver mislykkedes at forsøge pupation og forblev som tredje larver lang efter kontrol larver havde pupated. Nogle larver overlevede mere end 15 dage før de til sidst dør uden pupating (figur 1A). Et par af de eksperimentelle larver forsøgte at forpupper men i alle tilfælde unormal pupper blev dannet, ikke generere levedygtige voksne.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figur 1. Kvantitering af mad gravende og larve udvikling. (A) procentdel af levende larver udenfor mad mounds for de fire genotyper studerede her. Gennemsnit for de fem assay plader anvendes til hver genotype er vist. Dag 3 efter udrugning, ~ 70% af btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver var uden for maden, mens ingen larver blev fundet uden for maden eller på agar overfladen for de andre tre genotyper. Btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver dø langsomt mellem dage 4-20, med ~ 15% af dem stadig er i live 15 dage efter klækning. Den sorte pil langs x-aksen angiver her og i (B) den dag, hvor alle larver af de tre andre genotyper havde pupated. B procentdelen af døde larver synlig uden for mad til de fire genotyper. Gennemsnit for fem assay pladerne for hver genotype er vist. Døde btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver akkumulerer over tid med de fleste dør uden for maden. De andre genotyper alle overleve til pupation C procentdelen overlevelse til pupation for de fire genotyper studerede. Gennemsnit for fem assay pladerne for hver genotype er vist. Ingen normale pupper af btl-Gal4 > UAS uif RNAi genotype blev produceret. Fejllinjer i hele tal repræsenterer SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figur 2. Kvantitering af larve tunneling. (A) eksempler på assay plader for alle fire genotyper studerede efter forberedelse til tunnelføring kvantitering. Bemærk komplet fravær af tunnelføring for btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver. Assay plader er 10 cm Petri plader. B tunneling kvantitering afledt af Image Jørgensen for de fire genotyper. Gennemsnitlige pixelværdier for fem assay plader for hver genotype. Ingen tunneling blev observeret for btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver. Fejllinjer = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figur 3. Sammenligning af btl-Gal4 > UAS uif RNAi og btl-Gal4 > + larver Larver af tilsvarende alder (dag 6 efter klækning) for btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) og btl-Gal4 > + b genotyper. Røde pile peger på de dorsale stammen tracheae. Begge larver afbildet på samme forstørrelse. Skalalinjen = 0.5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Protokollen beskriver en simpel analyse for at identificere Drosophila melanogaster larver, der oplever hypoxi under normale atmosfæriske ilt niveauer. Denne protokol tillader hypoksiske larver kan skelnes fra andre mutanter, der viser overlappende fænotyper som træghed eller langsom vækst.

En gravende/Tunneling Assay til påvisning af hypoxi i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

En metode til at teste effekten af ​​miljøvinkler på parringsadfærd i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

En automatiseret hurtige iterativ Negative Geotaxis analyse til at analysere voksen klatring adfærd i en Drosophila Model af Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

High-Throughput metode til måling af alkohol sedation Tid af individuelle Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En forbedret analyse og værktøjer til måling af mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

En høj gennemløb Mikroplade Feeder Assay til kvantificering af forbruget i Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Storstilet gravitaxis-analyse af Caenorhabditis Dauer-larver

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

En simpel teknik til at analysere lokomotorisk aktivitet i Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Advancing Sleep Disorder Treatments: A Drosophila-Based Screening Approach

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System (Video) | JoVE

High-throughput Small Molecule Drug Screening for aldersrelaterede søvnforstyrrelser ved hjælp af Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Analysis of Sugar-Induced Foraging Behavior in Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Author Spotlight: Exploring Behavioral Pathways Through Cross-Species Insights in Foraging and Communication

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

Cognitive Improvement in Chronic Hypoxia Mice with Acupuncture

Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction

Author Spotlight: Improving Anesthesia Protocols for Enhanced Mouse Acupuncture Research

The treatment of central nervous disorders has consistently posed significant challenges to the medical field. Acupuncture, a non-pharmacological practice ...