Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

करेन एम Qiang राइस विश्वविद्यालय में जॉर्ज जे Schroepfer अनुसंधान पुरस्कार के 2016 प्राप्तकर्ता था । Fanli झोउ चावल विश्वविद्यालय से एक शिक्षण फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है । ब्लूमिंगटन Drosophila स्टॉक सेंटर, हार्वर्ड ट्रिप की सुविधा, वियना Drosophila रिसोर्स सेंटर की सेवाओं को कृतज्ञता से स्वीकार किया जाता है ।

1. लार्वा की तैयारी
<ol><li>दो या अधिक दिनों की परख शुरू करने से पहले, स्थापित वांछित प्रयोगात्मक और नियंत्रण के संयोजन के पार (ंयूनतम 20 महिलाओं और 10 पुरुषों प्रत्येक) अंडा में Wieschaus और Nusslein-Volhard द्वारा वर्णित के रूप में बर्तन रखना- 13 लेकिन उपयोग 50 एमएल के यूरिन और 6.0 सेमी डिस्पोजेबल पेट्री व्यंजन जिसमें अंगूर आगार होता है और उपयोग करने से पहले खमीर पेस्ट के साथ धब्बा होता है । अंडे में मक्खियों रखें जब तक जरूरत कमरे के तापमान पर अंधेरे में बर्तन रखना ।</li>
	<li>अंगूर आगर नुस्खा-100 मिलीलीटर जमे हुए 100% मिश्रण अंगूर का रस ध्यान लगाओ, 350 मिलीलीटर deioinized पानी, 5 मिलीलीटर हिमनदों एसिटिक और 13 जी melanogaster आगर एक 1L ग्लास चोंच में । 1-2 मिनट के फटने में माइक्रोवेव करें, फटने के बीच चमचे से, जब तक कि आगर सब घुल न जाए. कुछ मिनट के लिए समाधान ठंडा तो 95% इथेनॉल में 10% (डब्ल्यू/वी) Nipagen के 10 मिलीलीटर (मिथाइल पी-hydroxybenzoate) जोड़ें । मिश्रण है, तो प्रयोज्य 6.0 सेमी पेट्री व्यंजन में थाली प्रति पिपेट 7 मिलीलीटर, जेल और शुष्क करने के लिए कमरे के तापमान पर 3-4 एच स्टोर के लिए 4 0C में प्लास्टिक की थैलियों में अनुमति देते हैं ।</li>
	<li>खमीर पेस्ट नुस्खा-7 जी खमीर सूखे, 10 मिलीलीटर जल, एक रंग के साथ समान स्थिरता तक मिश्रण ।</li>
	<li>समय पर अंडा संग्रह प्रयोगात्मक और नियंत्रण लार्वा उत्पन्न करने के लिए । नए का प्रयोग, खमीर धब्बा, अंगूर की प्लेटें, सुबह घंटे के दौरान अंधेरे में 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंडे इकट्ठा । इन 4 एच संग्रह प्लेटें निकालें और ताजा प्लेटों के साथ बदलें । अगले दिन की दोपहर तक 25 0सी पर रात भर 4 एच संग्रह प्लेट्स की मशीन, जब लार्वा की सबसे रची होगी । इन सबसे पहले instar लार्वा एकत्र करें और प्रयोग सेट अप करने के लिए इनका उपयोग करे ।</li>
</ol>2. ऊपर परख प्लेट की स्थापना
<ol><li>परख प्लेट की तैयारी । एक रन की परख के लिए, पांच परख प्लेटें प्रत्येक 10 प्रयोगात्मक लार्वा और 10 नियंत्रण लार्वा की पांच प्लेटें तैयार करें । एक 1.5 सेमी कॉर्क बरमा का उपयोग करने के लिए एक भोजन के लिए एक छेद बनाने प्लेट से आगर के एक केंद्रीय कोर को दूर । छेद में खमीर पेस्ट (0.8-0.9 ग्राम) रखो और एक रंग के साथ धीरे से पॅट छेद भरने एक टीले बनाने के लिए ।</li>
	<li>आगर प्लेट तैयारी-एक 2L ग्लास चोंच और माइक्रोवेव में 5 मिनट के लिए 16 जी melanogaster आगर के साथ 700 मिलीलीटर जल गठबंधन और माइक्रोवेव से निकालें और एक गिलास रॉड के साथ हलचल समाधान में undissolved आगार लाने के लिए । 10% के 17.5 मिलीलीटर जोड़ें (डब्ल्यू/Nipagen 95% इथेनॉल में, मिश्रण, तो 30 एस में माइक्रोवेव हीटिंग जारी सरगर्मी के बाद फटने, जब तक सभी आगार पूरी तरह से घुल गया है । एक या दो मिनट के लिए अच्छा है, तो पिपेट 15 मिलीलीटर 10 सेमी प्लास्टिक पेट्री व्यंजन में aliquots । आगर जेल के लिए अनुमति दें, ढक्कन के साथ प्लेटों को कवर और उन्हें कुछ घंटे या रात के लिए कमरे के तापमान पर सूखी । 18 डिग्री सेल्सियस पर सील प्लास्टिक बैग में प्लेट्स स्टोर । नोट 1: अतिरिक्त dessiccation के कारण प्लेटों की सतह पर Nipagen क्रिस्टल के गठन से बचने के लिए, तैयारी के कुछ दिनों के भीतर प्लेट का उपयोग करें । यदि आवश्यक हो, क्रिस्टल उन पर 95% शराब के कुछ microliters छोड़ने के द्वारा फिर से भंग किया जा सकता है । नोट 2: आगर के बैचेस भिन्न बीच बढ़िया तालमेल गुण हो सकते हैं । सूखी जेल प्लेटें स्पर्श करने के लिए फर्म होना चाहिए और पर्याप्त लचीला है कि एक साफ, आगर के बरकरार सर्कल भोजन छेद बनाने के लिए काग बरमा का उपयोग करते समय हटाया जा सकता है (ऊपर देखें) ।</li>
	<li>परख प्लेटों में लार्वा की स्थापना करना । एक प्लास्टिक microspatula की नोक वक्र करने के लिए यांत्रिक दबाव का प्रयोग करें और लार्वा उठा के लिए "चिपकने वाला" प्रदान करने के लिए खमीर पेस्ट में टिप डुबकी । पहले instar लार्वा व्यक्तिगत रूप से उठाओ और उंहें खाद्य टीले के पास आगर प्लेट पर जगह है । प्रायोगिक और नियंत्रण पादी दोनों के लिए 10 लार्वा के कम से पांच दोहराने प्लेटें तैयार करें । एक बार पूरा, टोपी और लेबल प्रत्येक प्लेट और प्लेट (ढक्कन ऊपर की ओर) सेट कमरे के तापमान पर एक अंधेरे अंतरिक्ष में (हमारी प्रयोगशाला में यह 22 डिग्री सेल्सियस है) ।</li>
</ol>3. निगरानी परख प्लेटें
<ol><li>एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत रोजाना प्लेटों की जांच करें और आगर की सतह पर भोजन के शीर्ष पर या बाहर लार्वा की संख्या रिकॉर्ड करे । किसी भी दृश्य मृत या मर लार्वा ध्यान दें । ध्यान दें जब, और यदि, आगर उपपरत में सुरंग लार्वा तीसरे instar में ले जाने के रूप में देखा जाता है । नोट दिनांक जिस पर प्यूपा करने के लिए प्रारंभ करें और किसी भी pupal विषमताओं पर ध्यान दें । सभी लार्वा की मृत्यु या pupated होने तक दैनिक अवलोकन जारी रखें ।</li>
	<li>एक तुला चिढ़ा सुई और एक अंगूर की थाली को हस्तांतरण के साथ थाली से प्यूपा ध्यान से निकालें । यदि वांछित, जारी निगरानी प्यूपा वयस्कों के रूप में कितने eclose निर्धारित करने के लिए ।</li>
</ol>4. इमेजिंग के लिए परख प्लेट की तैयारी
<ol><li>ध्यान से निकालें और प्रत्येक थाली के मध्य कुआं से सभी खमीर खाना त्यागें ।</li>
	<li>धीरे नल का पानी के साथ प्रत्येक थाली बाढ़ और एक नरम कलाकार पेंट ब्रश का उपयोग करने के लिए ध्यान से मलबे कि आगर सतह पर नज़र रखी गई है रगड़ । पानी की जगह कई बार और प्रत्येक थाली पूरी तरह से साफ है जब तक कोमल ब्रशिंग जारी है । प्लेटें एक अंतिम कुल्ला पानी के साथ, उंहें टोपी और कमरे के तापमान पर रात भर के लिए सूखी छोड़ दें । नोट: आगर में सुरंग खाना टीला के आसपास सबसे अधिक तीव्र है (चित्रा 2 देखें) । एक परिणाम के रूप में, खाद्य छेद के रिम आमतौर पर प्रारंभिक 1.5 cm व्यास से परे का विस्तार किया है । इसके अलावा, इस क्षेत्र में काम किया आगर की कमजोरी सुरंगी आगर के छोटे टुकड़े के कारण सफाई के दौरान छेद की परिधि से खो सकता है । जेल आगर एकाग्रता में वृद्धि इन समस्याओं के साथ मदद कर सकता है, लेकिन सुधार छवि J quantitation चरणों के दौरान संभव हो रहे हैं (नीचे देखें).</li>
</ol>5. सुरंग की Quantitation
<ol><li>छवि प्लेटें । एक काली पृष्ठभूमि के खिलाफ लिया थाली की एक छवि तो के रूप में उज्ज्वल सफेद लाइनों के रूप में आगर में सुरंगों को दिखाने के लिए तैयार करें । नोट: हम आमतौर पर इस कदम के लिए छवि डीएनए जैल के लिए इस्तेमाल एक प्रणाली का उपयोग करें ( सामग्री और रिएजेंट की तालिकादेखें) । वैकल्पिक इमेजिंग सिस्टम झगड़ा फ़ाइलें, जैसे डिजिटल कैमरा या सेल फोन कैमरों पैदा करने में सक्षम करने के लिए उपयुक्त छवियों का उत्पादन समायोजित किया जा सकता है ।</li>
	<li>quantitate लार्वा टनल के लिए सार्वजनिक डोमेन प्रोग्राम NIH छवि J का उपयोग करें । http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html से कार्यक्रम डाउनलोड करें । प्रोग्राम के बारे में अधिक जानकारी के लिए http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html पर जाएं । नोट: अंय इमेजिंग प्रणालियों quantitate सुरंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । नीचे दिए गए निर्देश NIH छवि J पर लागू होते हैं.</li>
	<li>एक सुरंगिंग प्लेट की एक tiff फ़ाइल छवि खोलने के बाद, quantitation के लिए एक क्षेत्र है कि पूरे आगर सतह का प्रतिनिधित्व करता है, लेकिन प्लेट के प्लास्टिक के किनारे बाहर फसलों को परिभाषित करने के लिए अंडाकार उपकरण का उपयोग करें ।</li>
	<li>प्लेट की एक रिवर्स छवि, काली लाइनों के रूप में दिखा सुरंगों के साथ उत्पादन करने के लिए स्वचालित सीमा लागू होते हैं । रंग बीनने और तूलिका उपकरण का उपयोग करने के लिए बाहर सफेद किसी भी काले क्षेत्रों है कि बजाय सुरंग से आगर को नुकसान का प्रतिनिधित्व करते हैं ।</li>
	<li>पुल-डाउन मेनू का विश्लेषण करें के तहत, सेट स्केल । स्केल हटाने के लिए क्लिक करें और फिर सेट माप विंडो पर ( विश्लेषणके अंतर्गत भी), जांच क्षेत्र और थ्रेशोल्ड के लिए सीमा।</li>
	<li>प्रेस Cntrl कुंजी + एम पिक्सल में काले क्षेत्र (सुरंगों) को दिखाने के लिए कुंजी ।</li>
	<li>प्रत्येक प्लेट के लिए पिक्सेल मान कॉपी और पेस्ट करें (जैसे कि Excel) स्प्रेडशीट प्रोग्राम में है जो मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देगा ।</li>
	<li>सेंट्रल होल आमतौर पर इस क्षेत्र में तीव्र सुरंगीकरण के कारण विस्तार किया गया है । लापता सुरंग quantitate करने के लिए, अनचेक करें "सीमा तक सीमित" और केंद्रीय छेद को परिभाषित करने के लिए छड़ी उपकरण का उपयोग करें । इस क्षेत्र का पिक्सेल मान प्राप्त करने के लिए Cntrl कुंजी + M कुंजी दबाएं । इस मान से घटाना एक 1.5 cm छेद का पिक्सेल मान और चरण 5.6 में प्राप्त टनलिंग मान के लिए अंतर जोड़ें ।</li>
	<li>कुछ प्लेटों के लिए, सेंट्रल होल सुरंगी आगर का एक टुकड़ा है कि छेद करने के लिए आसंन सुरंग ी आगर के एक क्षेत्र शामिल लापता हो सकता है । जब quantitating इन प्लेटों के लिए केंद्रीय छेद रंग बीनने और पेंट ब्रश उपकरण का उपयोग करने के लिए सुरंगों क्षेत्र को परिभाषित और quantitation से गैर सुरंग क्षेत्र को बाहर करने के लिए लापता क्षेत्र भर में एक काली पट्टी जोड़ने के लिए । नोट 1: यदि प्रयोगात्मक लार्वा किसी भी सुरंग प्रदर्शन करते हैं, इस quantitation प्लेटों और नियंत्रण और प्रयोगात्मक मूल्यों के सांख्यिकीय तुलना के सेट के लिए औसत सुरंग मूल्यों की गणना परमिट ।</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. 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लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

हम यहां एक सरल डी. melanogaster लार्वा में ऊतक हाइपोक्सिया का पता लगाने के लिए डिज़ाइन परख प्रस्तुत किया है । निदान जल्दी लार्वा जीवन में खाद्य टीले में घटी हुई burrowing पर आधारित है और लार्वा जीवन में देर तक सुरंग के अभाव । लार्वा भीड़ समय से पहले प्रवास के कारण एक खाद्य स्रोत से दूर है और इस तरह परख के एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि लार्वा की एक छोटी संख्या एक बड़े अतिरिक्त भोजन की उपस्थिति में परख रहे है कर सकते हैं । फंजीसाइड मिथाइल-p हाइड्रॉक्सिल benzoate (Nipagen) को आगर प्लेटों में शामिल करना भी परख के दौरान मोल्ड विकास को रोकने के लिए आवश्यक है ।
हम पाते है कि आगर प्लेट परख में परिवर्तनशीलता का एक स्रोत हो सकता है । आमतौर पर, एक ही जीनोटाइप के लार्वा, माता-पिता के विभिन्न बैचों से, या लार्वा के विभिन्न संग्रहों से, परख में उनके व्यवहार में अपेक्षाकृत सीमित भिन्नता दिखाते हैं. इसके विपरीत, आगर विभिन्न दिनों या आगर के विभिन्न बैचों के साथ बनाई गई प्लेटें सुरंग में अंतर उपज कर सकते हैं. एक शर्त इसलिए कि नियंत्रण और प्रयोगात्मक लार्वा सभी एक ही बैच तैयारी से आगर प्लेट का उपयोग कर परीक्षण किया जाना चाहिए है । एक ही निर्माण से अलग निर्माताओं या यहां तक कि लदान से आगर उनके बीच बढ़िया तालमेल शक्ति में भिन्न हो सकते हैं, और इसलिए यह एक इष्टतम जेल प्राप्त करने के लिए यहाँ इस्तेमाल किया 2.2% से ऊपर की ओर एकाग्रता को समायोजित करने के लिए आवश्यक हो सकता है. हमने पाया है कि जंगली प्रकार के लार्वा आसानी से 3% आगर जैल के माध्यम से चिपमंक कर सकते हैं ।
आदेश में इस परख के मूल्य प्रदर्शित करने के लिए, हम इसका इस्तेमाल किया है tracheae में un फुला या के दमन समारोह के साथ लार्वा में संभावित ऊतक हाइपोक्सिया की जांच करने के लिए। हमारे निष्कर्षों की परिकल्पना के लिए मजबूत समर्थन प्रदान करते है कि इस जीन की सांस अभिव्यक्ति की हानि हाइपोक्सिया उत्पादन कर सकते हैं: btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा भोजन में चिपमंक और बुनियाद सुरंग के दौरान पूर्ण अनुपस्थिति में विफलता दिखाई तीसरा instar । अंय पादी के हमारे पूर्व अध्ययन में, हमने देखा है कि खाद्य burrowing के हाइपोक्सिया प्रेरित नुकसान के रूप में उपबुनियाद सुरंग के नुकसान के रूप में पूरा नहीं है और btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा यहां का अध्ययन इसी तरह व्यवहार किया । इस परख के विफल सुरंग घटक इसलिए हाइपोक्सिया का सबसे मजबूत संकेत प्रदान करता है ।
हालांकि btl-Gal4 > uif RNAi लार्वा हाइपोक्सिया के व्यवहार लक्षण नैदानिक दिखाया, कट(यत)-Gal4 > यूएएस-uif RNAi इन विषमताओं का प्रदर्शन नहीं किया । btl और कट(यत) Gal4 ड्राइवरों विभिंन चरणों में व्यक्त कर रहे हैं, और विभिंन पैटर्न में, लार्वा tracheae के भीतर । btl-Gal4 चालक embryogenesis में अपने विकास से शुरू करने और लार्वा जीवन के माध्यम से जारी सांस प्रणाली भर में व्यक्त की है । इसके विपरीत, कट(यत) से Gal4 अभिव्यक्ति-Gal4 चालक केवल भ्रूण जीवन के अंत में शुरू होता है, tracheae के morphogenesis के बाद, और पृष्ठीय चड्डी के चरम पीछे वर्गों के लिए सीमित है, के प्रमुख अनुदैर्ध्य जहाजों सांस व्यवस्था आहे. इस Gal4 लाइन के साथ uif पछाड़ना इसलिए कम नहीं हो सकता है uif अभिव्यक्ति जल्दी पर्याप्त या मोटे तौर पर पर्याप्त हाइपोक्सिया के कुछ सीमा स्तर के उत्पादन के लिए इस परख में मापा व्यवहार को ट्रिगर करने की आवश्यकता है ।
एक पूर्व अध्ययन में पाया गया कि तीसरे instar लार्वा कम करने के लिए उजागर (10%) ऑक्सीजन के स्तर में कमी की वृद्धि और pupariation 14की शुरुआत में देरी दिखा. btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा का अध्ययन किया यहां तीसरे instar के लिए प्रगति की है लेकिन उनके विकास और pupation दरों पर प्रभाव अधिक स्पष्ट थे: वे काफी छोटे के तहत बहुत कम फैटी ऊतक के साथ नियंत्रण से थे छोटे एपिडर्मिस (चित्र 3) और केवल एक मामूली अंश (~ 10%) pupariation का प्रयास किया । इन मतभेदों का सुझाव है btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा हाइपोक्सिया की अधिक से अधिक डिग्री का अनुभव है, क्योंकि या तो uif में पछाड़ना tracheae अपने पूरे लार्वा जीवन भर में मौजूद था, या क्योंकि यह एक अधिक उत्पादन तीसरे instar में गंभीर ऑक्सीजन अभाव । कैसे tracheae में uif समारोह के नुकसान को रोकने के ऑक्सीजन परिवहन इस बिंदु पर स्पष्ट नहीं है हो सकता है । tracheae के btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा छल्ली (चित्रा 3) के माध्यम से आसानी से दिखाई दे रहे थे, एक संकेत है कि वे हवा में निहित है और इस बात को क्षतिग्रस्त नहीं थे कि द्रव प्रवेश समझौता समारोह । यह औपचारिक रूप से इसलिए संभव है कि सांस नुकसान के द्वारा बनाई गई uif समारोह हाइपोक्सिया नहीं है, बल्कि कुछ अंय दोष है कि सुरंग को रोकता है । पादी के लिए पहले अध्ययन किया, हम निर्धारित किया है कि सुरंग में विफलता LDH mRNA7के ऊंचा स्तर के साथ जुड़ा हुआ है, देर से तीसरे हाइपोक्सिया लार्वा 15में glycolysis और instar के विहित संकेतक । इस प्रकार, btlके लिए हाइपोक्सिया की अंतिम पुष्टि-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा (और इस परख के भविष्य के उपयोग में जांच की लार्वा में) आरटी-पीसीआर शामिल होगा LDH mRNA के स्तर का आकलन करने के लिए या एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संकेतक के उपयोग को मापने के लिए intracellular ऑक्सीजन का स्तर (उदाहरण के लिए 16देखें) ।

आणविक आनुवंशिक उपकरण की परिष्कृत सरणी melanogaster में उपलब्ध evolutionarily जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक मूल्यवान जीव बनाते हैं । प्रमुख आणविक प्रतिक्रियाओं को ऑक्सीजन की उपलब्धता के लिए विकास और D. melanogaster में पूर्व अध्ययनों में संरक्षित होना साबित कर दिया है इन संकेतन रास्ते के सार्वभौमिक घटकों में अंतर्दृष्टि उत्पंन 1,2, 3,4,5,6.
D. melanogaster लार्वा में संवेदी ंयूरॉन फ़ंक्शन को विच्छेदन करने के उद्देश्य से अध्ययन के भाग के रूप में, हम दो व्यवहार प्रतिक्रियाओं कि सामांय ऑक्सीजन स्तर 7पर ऊतक हाइपोक्सिया द्वारा सक्रिय साबित की पहचान की । इनमें से एक, भोजन में चिपमंक करने के लिए विफलता, अत्यधिक Wingrove और O'Farrell 8द्वारा रिपोर्ट कम ऑक्सीजन के स्तर की प्रतिक्रिया से संबंधित है । दूसरा व्यवहार, देर से तीसरे चरण भटक instar के दौरान एक नरम बुनियाद में सुरंग के लिए विफलता, पहले हाइपोक्सिया के रूप में पहचान नहीं की गई थी संबंधित । हमने पाया है कि जंगली प्रकार कम ऑक्सीजन के स्तर को भटक लार्वा को उजागर भी 7, इस प्रकार की स्थापना है कि इन दोनों व्यवहार हाइपोक्सिया से शुरू-या तो ऊतक क्षति से प्रेरित या कम ऑक्सीजन का सेवन स्तर द्वारा स्थापित है । यहां हम एक परख हम इन दो हाइपोक्सिया प्रेरित व्यवहार है, जो टिप्पणियों के साथ शुरू होता है लार्वा सेने के बाद तुरंत बाद quantitate विकसित किया है का वर्णन ।
प्रारंभिक लार्वा चरणों में Hypoxic प्रतिक्रियाओं पहले जांच नहीं की गई है और इसलिए लार्वा जीवन भर में एक विश्लेषण प्रदर्शन हमारे परख का एक महत्वपूर्ण घटक है । हाइपोक्सिया के स्पष्ट अभिव्यक्तियों के अधिकांश-धीमी गति से विकास, गरीब विकास, और हरकत छाई-लार्वा phenotypes कई उत्परिवर्तनों द्वारा उत्पादित के साथ ओवरलैप । लेकिन हमने पाया है कि हाइपोक्सिया के साथ केवल तीसरी instar लार्वा टनल 7को पूरी तरह विफलता दिखाती है । इस प्रकार, हमने यह निर्धारित किया कि हमारे hypoxic लार्वा की तुलना में वृद्धि और गतिवान के मामले में भी लार्वा अधिक समझौता करते हैं, फिर भी कुछ सुरंग का प्रदर्शन करते हैं, जबकि hypoxic लार्वा 7की सुरंग नहीं होती । इस परख का एक और मूल्यवान तत्व इस प्रकार है कि यह एक तरह से स्थापित जब हाइपोक्सिया pleiotropic phenotypes के एक विशेष सेट का स्रोत है प्रदान करता है, के रूप में कुछ अंय तनाव या चयापचय खराबी का विरोध किया । परख के एक प्रदर्शन के रूप में, यहां हम निस्र्पक में इसके उपयोग के कम सांस अभिव्यक्ति के साथ लार्वा की प्रतिक्रियाओं का वर्णन un फुलाया, एक जीन है कि लार्वा एयरवेज 9में कार्य करता है ।
हम कल्पना की है कि यह परख मूल्य के निस्र्पक लार्वा phenotypes में लगे शोधकर्ताओं को होगा कि गरीब विकास और सुस्त व्यवहार शामिल हैं । नतीजतन, नए जीन है कि वितरण, उपयोग, या प्रतिक्रियाओं को प्रभावित शरीर भर में ऑक्सीजन की पहचान की जा सकती है । इसके अलावा, एक उत्परिवर्ती स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल में इस परख शामिल उत्परिवर्तनों कि हाइपोक्सिया उत्पादन की पहचान करने के लिए एक सीधा रास्ता प्रदान करेगा । यह परख भी सर्किट है कि हाइपोक्सिया-प्रेरित सहज व्यवहार में लाती है विश्लेषण में मूल्यवान होगा यहां वर्णित है । इस प्रकार के तंत्रिका नेटवर्क विश्लेषण बहुत वर्तमान अनुसंधान का ध्यान केंद्रित है और melanogaster लार्वा के सरल तंत्रिका तंत्र स्वचालित व्यवहार बाहर विदारक के लिए एक मूल्यवान प्रणाली है । संवेदी न्यूरॉन्स लार्वा ऑक्सीजन धारणा में शामिल पहले से ही पहचान की गई है, हाइपोक्सिया-प्रेरित प्रतिक्रियाओं के लिए पूर्ण सर्किट को परिभाषित करने की दिशा में एक पहला कदम प्रदान 10,11. GAL4-यूएएस प्रणाली12 के माध्यम से चयनात्मक तंत्रिका पछाड़ना के साथ संयोजन में हमारे परख का प्रयोग तंत्रिका नेटवर्क के आगे घटकों delineating के लिए एक स्पष्ट मार्ग है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

पशुओं में ऑक्सीजन वंचित कम वायुमंडलीय ऑक्सीजन के स्तर के लिए जोखिम से या आंतरिक ऊतक क्षति है कि ऑक्सीजन वितरण के साथ हस्तक्षेप से परिणाम कर सकते हैं । यह भी संभव है कि ऑक्सीजन सेंसिंग न्यूरॉन्स के ंयायपालिका व्यवहार सामान्य ऑक्सीजन के स्तर की उपस्थिति में हाइपोक्सिया की तरह व्यवहार पैदा कर सकता है. D. melanogasterमें, कम ऑक्सीजन स्तर पर विकास लार्वा चरणों के दौरान विकास और सुस्त व्यवहार के निषेध में परिणाम है । हालांकि, ऑक्सीजन घाटे के इन स्थापित अभिव्यक्तियां काफी कई उत्परिवर्तनों कि विकास को विनियमित, तनाव प्रतिक्रियाओं या गतिवान के phenotypes के साथ ओवरलैप । परिणाम के रूप में, वहां वर्तमान में नहीं है मैं पहचान के लिए उपलब्ध परख) सेलुलर हाइपोक्सिया एक उत्परिवर्तन या द्वितीय द्वारा प्रेरित) हाइपोक्सिया-व्यवहार की तरह जब असामांय ंयूरॉंस व्यवहार द्वारा प्रेरित किया ।
हमने हाल ही में दो विशिष्ट व्यवहार D. melanogaster लार्वा की पहचान की है जो सामांय ऑक्सीजन स्तर पर हाइपोक्सिया के आंतरिक पता लगाने के उत्तर में होते हैं । सबसे पहले, सभी चरणों में, इस तरह के लार्वा खाने में burrowing से बचते हैं, अक्सर एक खाद्य स्रोत से दूर भटक जाते हैं । दूसरा, एक नरम बुनियाद है, जो आम तौर पर घूमते तीसरे instar चरण के दौरान होता है में सुरंग पूरी तरह से अगर लार्वा hypoxic है समाप्त हो गया है । परख यहां वर्णित का पता लगाने और इन व्यवहार quantitate और इस तरह एक तरह से आंतरिक क्षति से प्रेरित हाइपोक्सिया का पता लगाने के बजाय कम बाहरी ऑक्सीजन प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । एक आगर बुनियाद और खमीर पेस्ट के एक केंद्रीय प्लग के साथ परख प्लेटें लार्वा जीवन के माध्यम से पशुओं का समर्थन किया जाता है । लार्वा की स्थिति और स्थिति प्रतिदिन ट्रैक की जाती है क्योंकि वे पहले तीसरी instar से आगे बढ़ते हैं । भटकना चरण के दौरान आगर उपबुनियाद में सुरंग की हद तक NIH ImageJ का उपयोग कर pupation के बाद quantitated है । परख मूल्य का निर्धारण जब हाइपोक्सिया एक उत्परिवर्ती phenotype का एक घटक है और इस तरह के सवाल में जीन की कार्रवाई की संभव साइटों में अंतर्दृष्टि प्रदान करने में होगा ।

इस परख के मूल्य के एक प्रदर्शन के रूप में हम इसका इस्तेमाल किया है tracheae में जीन un फुला या (uif) के बिगड़ा समारोह के साथ लार्वा में संभावित हाइपोक्सिया की जांच । uif एक बड़े transmembrane प्रोटीन है कि दृढ़ता से लार्वा सांस कोशिकाओं के शिखर सतह पर व्यक्त किया है encodes । uif के म्यूटेंट पहले ंयायपालिका व्यवहार है कि ऊतक हाइपोक्सिया सांस खराबी के कारण संकेत सकता है प्रदर्शन के लिए नोट किया गया था 9। हमने विशेष रूप से uif व्यंजक को Gal4-यूएएस सिस्टम का उपयोग करते हुए लार्वा श्वासनली में दबा दिया । दो Gal4 लाइनों का इस्तेमाल किया गया: i) बेदम (btl)-Gal4, जो tracheae में उनके भ्रूण विकास और द्वितीय की शुरुआत से दृढ़ता से व्यक्त किया जाता है) कट(यत)-Gal4, जो की एक छोटे से पीछे क्षेत्र में अभिव्यक्ति शुरू होता है embryogenesis के अंत में मुख्य पृष्ठीय ट्रंक tracheae और लार्वा जीवन 7भर में इस क्षेत्र में मजबूत अभिव्यक्ति जारी है । वियना Drosophila रिसर्च सेंटर (VDRC ID #1050) से एक यूएएस-uif RNAi लाइन प्राप्त हुई ।
के रूप में ऊपर प्रोटोकॉल में वर्णित है, पांच नए रची पहली instar लार्वा की दोहराने प्लेटों के रूप में चार पार से प्रत्येक के लिए स्थापित किया गया था इस प्रकार है ।
प्रयोग 1 1) नियंत्रण 1- कट(यत)-Gal4 x गुआंगज़ौ-S (+) 2) प्रायोगिक 1- कट(यत)-Gal4 x यूएएस-uif RNAi
प्रयोग 2 3) नियंत्रण 2- btl-Gal4 एक्स गुआंगज़ौ-S (+) ४) प्रायोगिक २- btl-Gal4 x यूएएस-uif RNAi
कटका व्यवहार (यत)-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा प्रयोग 1 की तुलना में उस पर नियंत्रण कट(यत)-Gal4 > + पशुओं के संदर्भ में burrowing, सुरंग और pupation को अस्तित्व, (चित्रा 1 और चित्रा 2) । इसके विपरीत, नीचे के विकास में जल्दी से पूरे सांस प्रणाली भर में uif अभिव्यक्ति विनियमन (प्रयोग 2) स्पष्ट रूप से अलग प्रतिक्रियाओं का उत्पादन किया । btl-Gal4 > यूएएस-uif RNAi लार्वा ऊतक हाइपोक्सिया के दोनों व्यवहार अभिव्यक्तियां प्रदर्शित – कम खाद्य burrowing और उपबुनियाद सुरंग की कुल अनुपस्थिति में बाद में लार्वा जीवन (चित्रा 1 और 2 चित्रा ). प्रयोगात्मक लार्वा भी ध्यान से छोटे थे, पतले और नियंत्रण से अधिक सुस्त (चित्रा 3), और परख के दौरान एक उच्च मृत्यु दर दिखाया । के रूप में ऊपर चर्चा की, कम वृद्धि, छाई और जीव मृत्यु लार्वा हाइपोक्सिया के लक्षण ज्ञात कर रहे हैं । इसके अलावा, प्रयोगात्मक लार्वा के अधिकांश pupation प्रयास करने में विफल रहा है और तीसरे instar लार्वा के रूप में बने लंबे समय के बाद नियंत्रण लार्वा pupated था । कुछ लार्वा pupating (चित्र 1a) के बिना अंततः मरने से 15 दिन से अधिक बच गए । प्रयोगात्मक लार्वा के कुछ pupate करने की कोशिश की लेकिन सभी मामलों में असामांय प्यूपा गठन किया गया है कि व्यवहार्य वयस्कों उत्पंन नहीं था ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> चित्र 1. खाद्य burrowing और लार्वा विकास के Quantitation । (क) यहाँ अध्ययन की गई चार पादी के लिए भोजन के टीले के बाहर जीवित लार्वा का प्रतिशत. पांच परख प्रत्येक जीनोटाइप के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों के लिए औसत दिखाया गया है । 3 दिन तक सेने के बाद, ~ 70% btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi लार्वा भोजन के बाहर थे, जबकि अन्य तीन पादी के लिए भोजन के बाहर या आगर सतह पर कोई लार्वा नहीं पाया गया । btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi लार्वा 4-20 दिनों के बीच धीरे मर जाते हैं, के साथ ~ उनमें से 15% अभी भी जिंदा हैच के बाद 15 दिन । x अक्ष के साथ यहां और (B) में काला तीर उस दिन को इंगित करता है जिसके द्वारा तीन अंय पादी के सभी लार्वा pupated थे । (ख) चार पादी के लिए भोजन के बाहर दिखाई देने वाले मृत लार्वा का प्रतिशत । प्रत्येक जीनोटाइप के लिए पांच परख प्लेट के लिए औसत दिखाया गया है । मृत btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi लार्वा समय के साथ सबसे अधिक खाने के बाहर मरने के साथ जमा । अंय पादी सभी जीवित pupation के लिए (ग) चार पादी अध्ययन के लिए pupation को प्रतिशत उत्तरजीविता । प्रत्येक जीनोटाइप के लिए पांच परख प्लेट के लिए औसत दिखाया गया है । btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi जीनोटाइप का कोई सामांय प्यूपा उत्पादन किया गया । चित्र में त्रुटि पट्टियां SEMs का प्रतिनिधित्व करती हैं । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> चित्र 2. लार्वा सुरंगी का Quantitation. (एक) सभी चार पादी सुरंग quantitation के लिए तैयारी के बाद अध्ययन के लिए परख प्लेटों के उदाहरण । नोट btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi लार्वा के लिए सुरंग के पूर्ण अनुपस्थिति । परख प्लेटें 10 सेमी पेट्री प्लेटें हैं । (ख) सुरंग quantitation चार पादी के लिए छवि जंमू से व्युत्पंन । प्रत्येक जीनोटाइप के लिए पांच परख प्लेट के लिए औसत पिक्सेल मूल्यों । btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi लार्वा के लिए कोई सुरंगिंग नहीं देखी गई । त्रुटि पट्टियां = SEMs । <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> चित्र 3. btlकी तुलना-Gal4 > यूएएस uif RNAi और btl-Gal4 > + लार्वा इसी तरह की उम्र के लार्वा (6 दिन सेने के बाद) के लिए btl-Gal4 > यूएएस uif RNAi (A) और btl-Gal4 > + (B) पादी. लाल तीर पृष्ठीय ट्रंक tracheae को इंगित करते हैं । दोनों लार्वा एक ही आवर्धन पर छवि । स्केल बार = 0.5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.</a>

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A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

प्रोटोकॉल एक सरल परख का वर्णन करने के लिए Drosophila melanogaster लार्वा है कि सामांय वायुमंडलीय ऑक्सीजन के स्तर के तहत हाइपोक्सिया का सामना कर रहे है की पहचान । इस प्रोटोकॉल hypoxic लार्वा अन्य म्यूटेंट से प्रतिष्ठित किया जा करने के लिए अनुमति देता है कि अतिव्यापी phenotypes जैसे छाई या धीमी वृद्धि दिखाने.

Drosophila melanogaster लार्वा में हाइपोक्सिया का पता लगाने के लिए एक Burrowing/सुरंग परख

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