Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Karen M. Qiang var 2016 mottakeren av George J. Schroepfer forskning prisen ved Rice University. Fanli Zhou er mottakeren av en undervisning Fellowship fra Rice University. Tjenestene til Bloomington Drosophila lager sentrum, Harvard tur anlegget, Wien Drosophila Resource Center er takknemlig anerkjent.

1. utarbeidelse av larver
<ol><li>To eller flere dager før analysen, sette opp krysser de ønskede eksperimentelle og kontroll kombinasjoner (minimum 20 kvinner og 10 menn hver) egg-lay retter som beskrevet av Wieschaus og Nusslein-Volhard 13 men bruker 50 mL polypropylen kanner og 6.0 cm disponibel Petri retter som inneholder drue agar og smurt med gjær lim like før bruk. Oppbevare flies egg-lay retter i mørket ved romtemperatur inntil nødvendig.</li>
	<li>Drue agar oppskrift-Kombiner 100 mL frosset 100% drue juice konsentrat, 350 mL deioinized vann, 5 mL glacial eddiksyre og 13 g D. melanogaster agar i en 1 liters glass kanne. Mikrobølgeovn i 1-2 min sprekker, røring mellom sprekker, til agar er alle oppløst. Cool løsningen i noen minutter og deretter legge 10 mL av 10% (w/v) av Nipagen (methyl-p-hydroxybenzoate) i 95% etanol. Blanding og pipette 7 mL per plate i disponibel 6.0 cm Petri retter, la gel og tørr ved romtemperatur for 3-4 h. butikken på 4 0C i plastposer.</li>
	<li>Gjær lime oppskrift-7 g tørket gjær, 10 mL vaskebuffer vann, bland med en slikkepott til uniform konsistens.</li>
	<li>Tidsbestemt egg samlinger å generere eksperimentelle og kontroll larver. Bruke nye, gjær-smurt, drue plater, samle egg ved romtemperatur 4 h i mørket i morgentimene. Fjerne disse 4 h samling platene og erstatte med fersk plater. Inkuber 4 h samling platene overnatting på 25 0C til ettermiddagen av neste dag, når de fleste Larvene er klekket. Samle disse første skikkelsen larver og bruke dem til å sette opp eksperimentet.</li>
</ol>2. sette opp analysen plater
<ol><li>Utarbeidelse av analysen plater. For en enkelt kjøre til analysen, forberede fem analysen hver av 10 eksperimentelle larver og fem plater av 10 kontroll larver. Bruk en 1,5 cm cork borer for å fjerne en sentral kjerne av agar fra hver plate skape et hull for maten. Sette gjær lim (0,8 - 0.9 g) i hullet og klappe forsiktig med en slikkepott til å gjøre en jordhaug fylle hullet.</li>
	<li>Agar plate forberedelse-Kombiner 700 mL vaskebuffer vann med 16 g D. melanogaster agar i et 2 L glass beaker og mikrobølgeovn 5 min. Fjern fra mikrobølgeovnen og rør med glass stang å bringe fra ikke agar i løsningen. Legge 17.5 mL av 10% (w/v) Nipagen i 95% etanol, mix, og deretter fortsette mikrobølgeovn oppvarming 30 s støt etterfulgt av omrøring, inntil alle agar er fullstendig oppløst. Kult i et minutt eller to, så Pipetter 15 mL dele i 10 cm plast Petri retter. Tillate agar gel, dekke plater med lokk og la dem tørke i romtemperatur i noen timer eller over natten. Lagre plater i forseglede plastposer på 18 ° C. Note 1: For å unngå dannelsen av Nipagen krystaller på overflaten av platene på grunn av overflødig dessiccation, bruke plater innen få dager med forberedelser. Om nødvendig kan krystaller re løses ved å slippe et par microliters 95% alkohol på dem. Note 2: grupper av agar kan ha ulike gelling egenskaper. Tørr gel plater bør være fast å ta og tilstrekkelig robust at en ren, intakt sirkel av agar kan fjernes ved cork borer lage mat hullet (se ovenfor).</li>
	<li>Definere larver i analysen plater. Bruke mekanisk belastning kurve spissen av en plast microspatula og dyppe tipset i gjær lim å gi "limet" for å plukke opp larvene. Plukke opp første skikkelsen Larvene individuelt og plassere dem på agar tallerkenen nær mat haugen. Forbered minst fem Repliker plater av 10 Larvene både eksperimentelle og kontroll genotyper. En gang fullført, cap og merke hver plate og sett platene (lokket siden opp) i et mørkt rom ved romtemperatur (i vår lab dette er 22 ° C).</li>
</ol>3. overvåking analysen plater
<ol><li>Undersøk plater daglig under dissecting mikroskop og registrere antall larver på maten eller ute på agar overflaten. Merk alle synlige døde eller døende larver. Merk Når og hvis tunnelering i agar undergrunnen er sett på som larver flytter inn i tredje skikkelsen. Merk datoene som pupae begynner å danne og Merk noe pupal unormalt. Fortsett daglige observasjoner til alle Larvene har dødd eller pupated.</li>
	<li>Fjerne pupae nøye fra platen med en bøyd teasing nål og overføre til en drue plate. Eventuelt kan du fortsette å overvåke pupae for å fastslå hvor mange dra som voksne.</li>
</ol>4. forberede analysen plater for bildebehandling
<ol><li>Nøye fjerne og slette alle gjær mat fra sentrale godt av hver plate.</li>
	<li>Forsiktig flom hver plate med vann fra springen og bruk en myk kunstners pensel å forsiktig gni av rusk som har blitt sporet på agar overflaten. Sett vannet flere ganger og fortsette mild penselen til hver plate er helt rent. Gi plater en siste skylling med deionisert vann, cap dem og la ved romtemperatur over natten for å tørke. Merk: Tunnelering agar er mest intense rundt mat haugen (se figur 2). Resultatet utvides kanten av mat hullet vanligvis utover den første 1,5 cm i diameteren. I tillegg forårsake gebrekkelighet av den arbeidet agar i dette området små biter av tunnelert agar tapt fra omkretsen av hullet under rengjøringen. Øker gel agar konsentrasjonen kunne hjelpe med disse problemene, men rettelser er mulig under bildet J kvantifisering trinnene (se nedenfor).</li>
</ol>5. kvantifisering av tunnelering
<ol><li>Bilde platene. Klargjør et bilde av hver plate tatt mot en svart bakgrunn for å vise tunneler i agar som lyse hvite linjer. Merk: Vi bruker et system brukte å image DNA gels for dette trinnet (se tabell av materialer og reagenser). Alternativ imaging systemer kan generere tiff-filer, som digitale kameraer eller mobiltelefon kameraer kan justeres for å produsere egnede bilder.</li>
	<li>Bruke frivare programmet NIH bilde J for å quantitate larver tunnelering. Last ned programmet fra http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. For mer informasjon om programmet gå til http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Merk: Andre imaging-systemer kan brukes å quantitate tunnelering. Instruksjonene nedenfor gjelder NIH bilde J.</li>
	<li>Etter åpning en tiff-fil bilde av en tunnelering plate, kan du bruke verktøyet ellipse til å definere et område for kvantifisering som representerer hele agar overflaten men avlinger ut plast kanten av platen.</li>
	<li>Gjelde automatiske terskelen for å produsere et speilvendt bilde av plate, med tunneler vises som svarte linjer. Bruk fargevelgeren og pensel verktøy til hvitt ut alle svarte områder som representerer skade til agar i stedet for tunneler.</li>
	<li>Velg Sett skala under rullegardinmenyen analyser | Klikk for å fjerne skala , og kontroller deretter området og Limit terskelen angi målinger i vinduet (også under analyser).</li>
	<li>Trykk Cntrl-tast + M å vise svart området (tunnels) i piksler.</li>
	<li>Kopier og lim inn pikselverdien for hver plate er i et regnearkprogram (for eksempel Excel) som tillater kvantitativ analyse.</li>
	<li>Den sentrale hullet er vanligvis utvidet på grunn av intens tunnel i denne regionen. For å quantitate manglende tunneling, uncheck "Begrens terskelen" og bruke verktøyet tryllestaven til å definere de sentrale hullet. Trykk på Cntrl + M tasten blir pikselverdien i dette området. Trekk fra denne verdien blir pikselverdien i 1,5 cm hull og bare tunnelering verdien fikk i trinn 5.6.</li>
	<li>For noen plater mangle den sentrale hullet et stykke tunnelert agar som inkluderer en region untunneled agar tilstøtende til hullet. Når quantitating sentrale hullet for disse platene bruk pensel fargevelgeren og maling verktøy for å legge til en svart linje over regionen mangler definere tunnelert regionen og ekskludere ikke-tunnelerte området fra kvantifisering. Note 1: Hvis eksperimentelle Larvene utføre noen tunnelering, tillater denne kvantifisering beregning av gjennomsnittlig tunnelering for sett av plater og statistiske sammenligning av kontroll og eksperimentelle verdier.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Vi har presentert her en enkel analysen utviklet for å oppdage vev hypoksi i D. melanogaster larver. Diagnosen er basert på redusert grave inn mat hauger i larver oppvekst og fravær av undergrunnen tunnelering sent i larver liv. Larver stimlet kan forårsake tidlig migrasjon fra mat og dermed en viktig del av analysen er at et lite antall Larvene er assayed et stort overskudd mat. Inkludering av soppdreper metyl-p hydroksyl benzoate (Nipagen) i agar platene er også avgjørende for å hindre muggvekst under analysen.
Vi finner at agar platene kan være en kilde til variasjoner i analysen. Larver av samme genotype, fra ulike grupper av foreldre eller fra ulike samlinger av larvene, viser vanligvis relativt begrenset variasjon i deres atferd i analysen. Derimot agar plater laget på ulike dager eller med ulike grupper av agar kan gi forskjeller i tunnelering. En fastsettelse derfor er kontrollen og eksperimentelle Larvene bør alle være testet med agar plater fra samme batch forberedelse. Agar fra forskjellige produsenter eller selv forsendelser fra samme produksjon kan variere i sin gelling styrke, og så det kan være nødvendig å justere agar konsentrasjonen oppover fra 2.2% brukt her for å oppnå en optimal gel. Vi har funnet at wild type Larvene kan lett hule gjennom 3% agar gels.
For å demonstrere verdien av denne analysen, har vi brukt den for å undersøke mulige vev oksygenmangel i Larvene med undertrykt funksjon av uninflatable i tracheae. Våre funn gir sterk støtte for hypotesen at tap av tracheal uttrykk for dette genet kan produsere hypoksi: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver viste å hule i mat og fullstendig fravær av undergrunnen tunneling under den tredje skikkelsen. I vår tidligere studier av andre genotyper, observerte vi at hypoksi-indusert tap av mat gravende ikke er så komplett som tap av undergrunnen tunnelering og btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver studert her oppførte seg på samme måte. Den mislykkede tunnelering komponenten av denne analysen gir derfor den sterkeste tegn på hypoksi.
Selv om btl-Gal4 > uif RNAi larver viste opptreden personlighetstrekk diagnostiske av oksygenmangel, i cut(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi ikke viser disse unormalt. Btl og kuttet(ue) Gal4 sjåførene uttrykkes på ulike stadier, og i ulike mønstre, innenfor de larver tracheae. Btl-Gal4 sjåfør uttrykkes gjennom tracheal systemet fra utviklingen i embryogenesis og fortsetter gjennom larver livet. I kontrast, Gal4 uttrykk i kuttet(ue)-Gal4 driveren bare begynner på slutten av embryonale liv, etter morphogenesis av tracheae, og er begrenset til ekstreme bakre deler av dorsal stammene, store langsgående blodårene i tracheal systemet. UIF knockdown med denne Gal4-linjen kan ikke derfor redusere uif uttrykk tidlig nok eller bredt nok til å produsere viss terskel hypoksi for å utløse atferd målt i denne analysen.
En tidligere studie fant at tredje skikkelsen Larvene utsatt for lavt oksygennivå (10%) viser redusert vekst og forsinket utbruddet av pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver studert her kommet til den tredje skikkelsen men virkningene på sine vekst og pupation priser var mer uttalt: de var betydelig mindre enn kontroller med lite fettvev under den overhuden (Figur 3) og bare en liten brøkdel (~ 10%) forsøkte pupariation. Disse forskjellene foreslå btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver opplevde en større grad av hypoksi, enten fordi uif knockdown i tracheae var til stede gjennom hele larver livet, eller fordi det produsert mer alvorlig oksygenmangel i tredje skikkelsen. Hvordan tap av uif funksjon i tracheae kan hindre oksygen transport er uklare på dette punktet. Tracheae av btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver var synlig gjennom cuticle (Figur 3), en indikasjon på at de inneholdt luft og var ikke skadet til punktet at væske oppføring kompromittert funksjon. Det er derfor formelt mulig at tracheal skaden opprettet av tap av uif funksjon ikke framprovosere hypoksi men heller noen andre feil som hemmer tunnelering. For genotyper studerte tidligere, fastslått vi at unnlatelse av å tunnel er forbundet med forhøyede nivåer av LDH mRNA7, den kanoniske indikatoren på Glykolysen og hypoksi i slutten tredje skikkelsen Larvene 15. Dermed endelig bekreftelse av oksygenmangel for btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver (og larver undersøkt i fremtiden bruke denne analysen) ville innebære RT PCR å vurdere LDH mRNA nivåer eller bruk av en kommersielt tilgjengelig indikator for å måle intracellulær oksygen nivåer (for eksempel se 16).

Sofistikert utvalg av molekylær genetisk verktøyene i D. melanogaster gjør det en verdifull organisme for studier av evolusjonært bevarte biologiske prosesser. Nøkkel molekylær svar oksygen tilgjengelighet har vist seg å være bevart over utviklingen og tidligere studier i D. melanogaster har generert innsikt i universell komponentene av disse signalnettverk trasé 1,2, 3,4,5,6.
Som en del av en studie rettet mot dissekerende sensoriske Nevron funksjon i D. melanogaster larver, identifisert vi to atferdsdata svar som viste seg å være aktivert av vev hypoksi på normal oksygen nivåer 7. En av disse, unnlatelse av å hule i mat, er svært knyttet til svaret lavt oksygennivå rapportert av Wingrove og O'Farrell 8. Det andre opptreden, manglende tunnel til en myk undergrunnen under den sene tredje skikkelsen vandring fase, hadde ikke tidligere identifisert som hypoksi-relaterte. Vi bestemt at utsette vill type vandrende Larvene til lavt oksygennivå hemmer også undergrunnen tunnelering 7, dermed etablere at begge disse atferd kommer fra hypoksi - enten indusert vevsskade eller lavt oksygennivå inntak. Her beskriver vi analysen har vi utviklet for å quantitate disse to hypoksi-indusert atferd, som starter med observasjoner umiddelbart etter larver.
Hypoxic svar i de tidlige larver stadiene har ikke blitt undersøkt tidligere og derfor utfører en analyse gjennom larver livet er en verdifull del av analysen vår. De fleste av de åpenbare manifestasjoner av hypoksi-langsom utvikling, dårlig vekst og locomotor treghet-overlapper med larver fenotyper produsert av mange mutasjoner. Men vi har funnet at bare tredje skikkelsen Larvene med hypoksi viser en fullstendig fiasko til tunnel 7. Derfor vi funnet ut at selv Larvene mer kompromittert vekst og bevegelse enn våre hypoxic larver, fortsatt utført noen tunnelering, mens hypoxic Larvene aldri tunnelerte 7. En annen verdifull element av denne analysen er at det gir en måte å opprette når hypoksi er kilden til et bestemt sett av pleiotropic fenotyper, i motsetning til noen andre stress eller metabolske funksjonsfeil. Som en demonstrasjon av analysen, her vi beskriver bruken karakteriserer svarene på Larvene med redusert tracheal uttrykk for uninflatable, et gen som fungerer i larver airways 9.
Vi ser at denne analysen vil være av verdi for forskere i karakteriserer larver fenotyper med dårlig vekst og svak atferd. Som et resultat, nye gener som påvirker distribusjon, bruk, eller svar til kan oksygen i kroppen identifiseres. Videre ville omfatter denne analysen i en mutant screening protokoll gi en direkte rute til identifisere mutasjoner som produserer hypoksi. Denne analysen vil også være verdifull i å analysere kretsene som utløser hypoksi-indusert medfødte atferd beskrevet her. Nettverk analyse av denne typen er fokus for mye aktuell forskning og enkel nervesystemet av D. melanogaster Larven er en verdifull system for dissekere ut automatisert atferd. Sensoriske neurons involvert i larver oksygen oppfatning har allerede blitt identifisert, gir et første skritt mot å definere komplett kretskobling for hypoksi-indusert svar 10,11. Bruke analysen vår i kombinasjon med selektiv nevrale knockdown via GAL4-UAS systemet12 er en klar rute for skildre ytterligere komponenter av nettverk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Oksygenmangel i dyr kan resultere fra eksponering for atmosfærisk oksygen nivåer eller interne vevsskade som forstyrrer oksygen distribusjon. Det er også mulig at Avvikende atferd av oksygen-sensing neurons kan indusere hypoksi-lignende oppførsel i nærvær av normal oksygennivået. I D. melanogaster, utvikling på lavt oksygennivå resulterer i Hemming av vekst og svak oppførsel fra larver faser. Men overlapper disse etablerte manifestasjoner av oksygen underskudd betydelig av fenotyper av mange mutasjoner som regulerer vekst, stressresponser eller bevegelse. Som resultat er det ingen analysen tilgjengelig for å identifisere i) mobilnettet hypoksi indusert av en mutasjon eller ii) hypoksi-lignende oppførsel når indusert av unormal neuronal atferd.
Vi har nylig funnet to atskillelse opptreden i D. melanogaster larver som oppstår ved normal oksygennivået svar på interne påvisning av hypoksi. Først i alle stadier unngå slike Larven grave inn mat, ofte avvik langt borte fra mat. Andre fjernes tunnelering i en myk undergrunnen, som vanligvis oppstår under den vandrende skikkelsen scenen helt hvis larver hypoxic. Analysen beskrevet her er utviklet for å oppdage og quantitate disse atferd og dermed til å oppdage hypoksi indusert av interne skader i stedet for eksterne oksygen. Analysen plater med en agar undergrunnen og en sentral plugg gjær lim brukes til å støtte dyr gjennom larver liv. Posisjonene og delstaten Larvene spores daglig de går videre fra første til tredje. Omfanget av tunnelering i agar undergrunnen under vandring fase er quantitated etter pupation med NIH ImageJ. Analysen vil være av verdi i å bestemme når hypoksi er en komponent i en mutant fenotypen og dermed gi innsikt i mulige områder av genet i spørsmålet.

Som en demonstrasjon av verdien av denne analysen har vi brukt den til å undersøke mulige oksygenmangel i Larvene med nedsatt funksjon av genet uninflatable (uif) i tracheae. UIF koder et stort transmembrane protein som uttrykkes sterkt på apikale overflaten av larver tracheal cellene. Mutanter av uif var tidligere nevnt viser Avvikende atferd som kan indikere vev hypoksi på grunn av tracheal feil 9. Vi undertrykt spesielt uif uttrykk i larver luftrøret ved hjelp av Gal4-UAS-systemet. To Gal4 linjer ble brukt: jeg) andpusten (btl)-Gal4, som er uttrykt sterkt i tracheae fra begynnelsen av embryonale utvikling og ii) klippe(ue)-Gal4, som starter uttrykk i en liten bakre region de viktigste dorsal stammen tracheae på slutten av embryogenesis og fortsetter sterke uttrykk i denne regionen gjennom larver livet 7. En UAS -uif RNAi linje er Hentet fra Wien Drosophila Research Center (VDRC ID #1050).
Som beskrevet i protokollen ovenfor, gjenskape fem plater nyklekte første skikkelsen Larvene ble satt opp for hver av fire kors som følger.
Eksperiment 1 1) kontroll 1 - kuttet(ue)-Gal4 x Canton-S (+) 2) Experimental 1 - kuttet(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Eksperimentet 2 3) control 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+) 4) Experimental 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
Oppførselen til den skjær(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larver eksperiment 1 var sammenlignes med i kontroll kuttet(ue)-Gal4 > + dyr gravende, tunnelering og overlevelse til pupation, (figur 1 og figur 2). Derimot produsert ned-regulere uif uttrykk gjennom hele tracheal systemet fra tidlig i utviklingen (eksperiment 2) markant forskjellige svar. Btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver vises både atferdsmessige manifestasjoner av vev hypoksi-redusert mat gravende og totalt fravær av undergrunnen tunnelering senere i larver livet (figur 1 og figur 2 ). Eksperimentell Larvene var også betydelig mindre, tynnere og svakere enn kontroller (Figur 3), og viste en høy dødelighet i løpet av analysen. Som drøftet over, er redusert, treghet og organismebiologi død kjent symptomer på larver hypoksi. I tillegg skikkelsen de fleste av eksperimentelle Larvene kunne prøve pupation og forble som larver lang etter kontroll Larvene hadde pupated. Noen larver overlevde mer enn 15 dager før slutt døde uten pupating (figur 1A). Noen av eksperimentelle Larvene prøvde å forpuppe seg, men i alle tilfeller var unormale pupae dannet som ikke genererte levedyktig voksne.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figur 1. Kvantifisering av mat gravende og larver utvikling. (A) prosent av live Larvene utenfor mat hauger for de fire genotyper studert her. Gjennomsnitt for fem analysen platene brukes for hver genotype vises. Dag 3 etter klekking, ~ 70% av btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver var utenfor mat, mens ingen Larvene ble funnet utenfor maten eller på agar overflaten for de andre tre genotyper. Btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver dør langsomt mellom dager 4-20, ~ 15% av dem fortsatt i live 15 dager etter klekking. Den svarte pilen langs x-aksen angir her og (B) dagen som alle larver av de tre andre genotyper hadde pupated. (B) prosent av død Larvene synlig utenfor maten for de fire genotyper. Gjennomsnitt for fem analysen platene for hver genotype vises. Død btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver samler seg over tid med de fleste døende utenfor maten. De andre genotyper alle overleve til pupation (C) prosent overlevelse til pupation for de fire genotyper studerte. Gjennomsnitt for fem analysen platene for hver genotype vises. Ingen vanlig pupae av btl-Gal4 > UAS uif RNAi genotype ble produsert. Feilfelt i figuren representerer søkemotormarkedsførere. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figur 2. Kvantifisering av larver tunnelering. (A) eksempler på analysen platene for alle fire genotyper studerte etter forberedelse til tunnelering kvantifisering. Merk fullstendig fravær av tunnelering for btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver. Analysen platene er 10 cm Petri plater. (B) tunneling kvantifisering avledet fra bildet J for de fire genotyper. Gjennomsnittlig bildepunktverdier for fem analysen platene for hver genotype. Ingen tunnelering ble observert i btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver. Feilfelt = søkemotormarkedsførere. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figur 3. Sammenligning av btl-Gal4 > UAS uif RNAi og btl-Gal4 > + larver Larvene lignende alder (dag 6 etter) for btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) og btl-Gal4 > + (B) genotyper. Røde piler peker til dorsal stammen tracheae. Både larvene fotografert på samme forstørrelse. Skala bar = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Protokollen beskriver en enkel analyse for å identifisere Drosophila melanogaster larver som opplever hypoksi under normalt atmosfærisk oksygen nivåer. Denne protokollen tillater hypoxic Larvene skilles fra andre mutanter som viser overlappende fenotyper som treghet eller langsom vekst.

En Burrowing/Tunneling analysen for gjenkjenning av oksygenmangel i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

En metode for å teste effekten av miljøvennlige påkjenningshendelser i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

En automatisert rask iterativ Negative Geotaxis analysen for å analysere voksen klatring atferd i Drosophila modell av Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Høy gjennomstrømningmetode for måling av alkoholsedasjonstid for individuell drosofilmelanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En forbedret analyse og verktøy for måling av mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

En mikroplatemateranalyse med høy gjennomstrømning for kvantifisering av forbruk i Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Storskala gravitakseanalyse av Caenorhabditis dauer larver

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

En enkel teknikk for å analysere lokomotorisk aktivitet i Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Advancing Sleep Disorder Treatments: A Drosophila-Based Screening Approach

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System (Video) | JoVE

Høy gjennomstrømning av småmolekylær legemiddelscreening for aldersrelaterte søvnforstyrrelser ved bruk av Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Analysis of Sugar-Induced Foraging Behavior in Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Author Spotlight: Exploring Behavioral Pathways Through Cross-Species Insights in Foraging and Communication

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

Cognitive Improvement in Chronic Hypoxia Mice with Acupuncture

Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction

Author Spotlight: Improving Anesthesia Protocols for Enhanced Mouse Acupuncture Research

The treatment of central nervous disorders has consistently posed significant challenges to the medical field. Acupuncture, a non-pharmacological practice ...