Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Карен м. Цян был удостоен 2016 Джорджа Дж. Шрепфер исследований премии Университета Райс. Fanli Чжоу является получателем учебных стипендий из Университета Райса. Услуги центра дрозофилы фондовой Блумингтон, Гарвардский поездки фонда, Вена дрозофилы ресурсный центр с благодарностью.

1. Подготовка личинок
<ol><li>Два или более дней до начала анализа, установите кресты требуемого экспериментальных и контролировать комбинации (минимум 20 женщин и 10 мужчин каждый) в яйцо кладет блюда, как описано в Wieschaus и Nusslein-Фольхард 13 , но с использованием 50 мл полипропиленовые мензурки и 6.0 см одноразовые чашки Петри содержащие винограда агар и Намазанное клейстером дрожжи непосредственно перед использованием. Держите мух в яйцо кладет блюда в темноте при комнатной температуре до тех пор, пока требуется.</li>
	<li>Винограда агар рецепт – комбинат замороженных 100 мл 100% виноградный сок концентрированный, 350 мл deioinized воды, 5 мл ледниковых уксусной и 13 g D. melanogaster агар в стеклянный стакан 1 Л. Микроволновая печь в очередей 1-2 мин, помешивая между очередями, пока агар растворяется. Прохладный раствор на несколько минут, затем добавить 10 мл 10% (w/v) Nipagen (метил p гидроксибензоата) в 95% этаноле. Смесь, а затем пипеткой 7 мл на пластине в одноразовые 6.0 см Петри, позволяют гель и сушат при комнатной температуре 3-4 ч. хранить при 4 0C в пластиковых мешках.</li>
	<li>Дрожжи паста рецепт – 7 г сушеных дрожжей, 10 мл деионизированная вода, смесь с помощью шпателя до единой консистенции.</li>
	<li>Приурочен яйцо коллекции для создания экспериментальной и контролировать личинки. Использование новых, дрожжи смазывается, винограда пластин, Соберите яйца при комнатной температуре в течение 4 ч в темноте в утренние часы. Удалите эти 4 h коллекции пластины и заменить свежим пластины. Инкубировать 4 h коллекции пластины на ночь на 25 0C до полудня следующего дня, когда будет вылупились большую часть личинок. Собирать эти личинки первого возраста и использовать их для настройки эксперимента.</li>
</ol>2. Настройка пробирного пластины
<ol><li>Подготовка анализа плит. Для каждого отдельного запуска assay Подготовьте пять пробирного пластин 10 экспериментальных личинок и пять пластин 10 управления личинок. Используйте Борер Корк 1,5 см для удаления центральное ядро агар из каждой пластины, создание отверстие для пищи. Положите дрожжи пасты (0,8 - 0,9 г) в отверстие и нежно погладить шпателем сделать Курган заполнения отверстие.</li>
	<li>Агар подготовки пластины – объединить 700 мл деионизированной воды с 16 g D. melanogaster агар в стеклянный стакан 2 Л и СВЧ на 5 минут удалить из микроволновой печи и перемешать с стеклянный стержень для приведения нерастворенных агар в решение. 17,5 мл 10% (w/v) Nipagen в 95% этаноле, перемешать, добавить, а затем продолжить микроволновой нагрев 30 s очередей следуют помешивая, до тех пор, пока все агар полностью не растворится. Cool для минуту или две, затем Пипетка 15 мл аликвоты в пластиковых чашек Петри 10 см. Разрешить агар гель, накладки с крышкой и дайте им высохнуть при комнатной температуре через несколько часов или на ночь. Хранить пластины в запечатанных полиэтиленовых пакетах при 18 ° C. Примечание 1: Чтобы избежать образования кристаллов Nipagen на поверхности плит из-за избыточного dessiccation, используйте пластины в течение нескольких дней подготовки. При необходимости, кристаллы можно повторно распущен, сбрасывая несколько микролитров 95% спирта на них. 2 Примечание: партий агар может иметь различные гелеобразующего свойства. Сухой гель пластины должна быть твердой на ощупь и достаточно устойчивыми, что чистый, нетронутыми круг агар могут быть удалены при использовании Корк буром для создания продовольственной отверстие (см. выше).</li>
	<li>Настройка личинок в Пробирной пластины. Использование механического давления кривой кончик пластиковой microspatula и погрузите кончик в пасте дрожжей обеспечить «клей» для собирание личинок. Подобрать личинки первого возраста индивидуально и разместить их на пластину агар недалеко от пищи Курган. Подготовка по меньшей мере пять реплицировать плиты 10 личинок для обеих экспериментальных и управления генотипов. После завершения, крышка и этикетке каждой плиты и плиты (крышка стороной вверх) в темном пространстве при комнатной температуре (в нашей лаборатории это 22 ° C).</li>
</ol>3. Мониторинг пробирного пластины
<ol><li>Изучить пластины ежедневно под микроскопом рассечения и записывать количество личинок на вершине пищевой или на поверхности агара. Обратите внимание на любые видимые мертвых или умирающих личинки. Обратите внимание, когда и если туннелирование в субстрат агар рассматривается как личинки перемещаются в третьего возраста. Обратите внимание на даты, на которые куколок начинают формировать и отметить любые куколки аномалии. Продолжайте ежедневные наблюдения до тех пор, пока все личинки умерли или pupated.</li>
	<li>Осторожно снимите куколки от пластины с вогнутыми дразня иглы и передачи винограда пластины. При желании Продолжайте мониторинг куколок, чтобы определить сколько Эклоз как взрослые.</li>
</ol>4. Подготовка пробирного пластины для обработки изображений
<ol><li>Осторожно снимите и Выбросьте все дрожжей питание от центральной скважины каждой плиты.</li>
	<li>Аккуратно наводнения каждой пластины с водопроводной водой и использовать мягкую художника кисть для тщательно протереть мусора, который отслеживается на поверхности агара. Замените воду несколько раз и продолжают нежной чистки до тех пор, пока каждая пластина совершенно чистой. Дать окончательное полоскание с дейонизированной водой пластины, крышка их и оставить при комнатной температуре на ночь, чтобы высушить. Примечание: Туннелирование в агар является наиболее интенсивным вокруг кургана продовольствия (см. рисунок 2). В результате оправе отверстие пищи обычно расширяется за пределы первоначального 1,5 см в диаметре. Кроме того хрупкость работал агар в этом регионе может вызвать небольшие кусочки туннелированного агара быть утрачены из окружности отверстия во время очистки. Повышение концентрации агар гель может помочь с этими проблемами, но исправления возможны во время изображения J количественный шаги (см. ниже).</li>
</ol>5. количественный туннелирования
<ol><li>Изображения пластины. Подготовьте изображение каждой пластины, принятых на черном фоне с тем, чтобы показать в туннелях в агар как яркие белые линии. Примечание: Мы используем систему обычно используется для изображения ДНК гели для этого шага (см. таблицу материалы и реагенты). Альтернатива, диагностические системы, способные генерировать файлы tiff, таких как цифровые камеры или камеры мобильного телефона могут быть скорректированы для получения подходящих изображений.</li>
	<li>Используйте программу общественного достояния NIH Image J чтобы quantitate личиночной туннелирования. Скачайте программу с http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Для получения дополнительных сведений о программе, перейдите на http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Примечание: Другие системы могут использоваться для quantitate туннелирования. Инструкции ниже относятся к NIH Image Дж.</li>
	<li>После открытия файла изображения в формате tiff туннельные плиты, используйте инструмент «Овал» для определения области для количественный, который представляет весь агар поверхность, но культур из пластиковой кромкой плиты.</li>
	<li>Примените автоматический порог производить обратный образ пластины, с туннелями, показаны как черные линии. Используйте палитру цветов и инструменты кисть белого любой черный областей, которые представляют собой ущерб агар вместо туннелей.</li>
	<li>В раскрывающемся меню Analyze , выберите масштаб набор | Нажмите для удаления накипи и затем в окне задать измерения (также под Analyze) проверить области и предел порога.</li>
	<li>Нажмите клавишу Cntrl + M ключ для отображения области черный (туннели) в пикселях.</li>
	<li>Копировать и вставить в программу электронных таблиц (например, Excel), которая позволит обеспечить количественный анализ является значение пикселя для каждой пластины.</li>
	<li>Центральное отверстие обычно расширяется благодаря интенсивным туннелирование в этом регионе. Чтобы quantitate отсутствующих туннелирование, снимите флажок «Ограничить порог» и используйте средство палочка для определения центральное отверстие. Нажатием комбинации клавиш CTRL + M ключ для получения значения пикселей в этой области. Вычесть из этого значения значение пиксела отверстием 1,5 см и добавить разница для туннелирования значение, полученное на шаге 5.6.</li>
	<li>Для некоторых пластин центральное отверстие может отсутствовать часть туннелированного агар, который включает в себя область untunneled агар рядом с отверстием для. Когда quantitating центральное отверстие для использования этих пластин цвета и краски Кистевые инструменты для добавления черной полосой во всем регионе отсутствует для определения туннелированного региона и исключить области туннель от quantitation. Примечание 1: Если экспериментальные личинки выполнять любые туннелирование, этот количественный позволяет расчет средней, туннелирование и экспериментальные значения для набора пластин и статистическое сравнение элемента управления.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Мы представили здесь простой пробирного, предназначенных для выявления гипоксии тканей в D. melanogaster личинки. Диагноз основывается на снижение прячась в продовольственной курганы ранних личиночных жизни и отсутствие субстрат, туннелирование в конце жизни личинок. Личинок скученность может привести к преждевременной миграции от источника питания и таким образом одним из важнейших аспектов assay что небольшое количество личинок assayed присутствии большого пищи избытке. Включение фунгицида метил p гидроксила бензоат (Nipagen) в плиты агара также важно для предотвращения плесени во время анализа.
Мы находим, что плиты агара может быть источником изменчивости в assay. Как правило личинки же генотипа, из разных партий родителей, или из различных коллекций личинок, показать сравнительно ограниченные изменения в их поведении в assay. В отличие от плиты агара на разные дни или с различных серий агар может принести различия в туннелирования. Одно условие поэтому этот элемент управления и экспериментальной личинки должны все быть протестированы с использованием плиты агара от же подготовки пакета. Агар из разных производителей или даже грузы от же производства может варьироваться в их гелеобразующего силы, и поэтому она может потребоваться регулировка концентрации агара вверх от 2,2%, здесь используется для достижения оптимального гель. Мы обнаружили, что дикого типа личинки могут легко закапываться через 3% агар гели.
Для того, чтобы продемонстрировать значение этот assay, мы использовали его для расследования возможных гипоксии тканей в личинки с подавленной функцией uninflatable в трахею. Наши выводы оказывать решительную поддержку гипотезы, что потеря трахеи экспрессия этого гена могут производить гипоксии: btl-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки показали неспособность зарываются в пищевой и полное отсутствие субстрат туннелирование во время третьего возраста. В наших предыдущих исследований других генотипов, мы наблюдали, что гипоксия индуцированной потери продовольствия роющих не как потеря субстрат туннелирования и btlполной-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки учился здесь ведут себя аналогичным образом. Неудачных туннелирования компонент этот assay поэтому обеспечивает сильные проявление гипоксии.
Хотя btl-Gal4 > uif RNAi личинки показал поведенческие черты диагностики гипоксии, Вырезать(ue)-Gal4 > UAS -ГФИ интерференции не проявляют эти ненормальности. Btl и Вырезать(ue) Gal4 драйверы выражаются на различных этапах и в различных моделей, в трахею личинки. Btl-Gal4 драйвер выражается во всей системе трахеи, начиная от ее развития в эмбриогенезе и продолжая до личинок жизни. В отличие от Gal4 выражения из Вырезать(ue)-Gal4 драйвер только начинается в конце эмбриональной жизни, после морфогенез трахею и ограничивается крайней задней секции спинной стволы, основных продольных сосудов системе трахеи. ГФИ сногсшибательно с этой линией Gal4 поэтому не может уменьшить ГФИ выражение достаточно рано или широко достаточно производить некоторые порогового уровня гипоксии, необходимые для запуска поведения измеряется в этот assay.
Предварительного исследования обнаружили, что третий instar личинки воздействию низких уровнях кислорода (10%) показывают снижение роста и задержки начала pupariation 14. Btl-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки учился здесь достигла третьего возраста, но влияние на темпы роста и Окукливание были более выраженными: они были значительно меньше, чем элементы управления с очень мало жировой ткани под pupariation попытка эпидермиса (рис. 3) и лишь незначительные часть (~ 10%). Эти различия свидетельствуют о btl-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки испытал большую степень гипоксии, потому что ГФИ нокдаун в трахею присутствовал на протяжении всей жизни личинок, либо потому, что она подготовила более тяжелые кислорода в третьего возраста. На данный момент неясно как потеря функции ГФИ в трахею может предотвратить транспорта кислорода. Трахею btl-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки были легко видны через кутикулу (рис. 3), указывает, что они содержатся воздуха и не были повреждены до того, что поступления флюида нарушена функция. Поэтому формально возможно что трахеи ущерб, созданные потери функции ГФИ не вызывают гипоксии, но скорее некоторые другие дефект, который подавляет туннелирования. Для генотипов, изучал ранее мы определили, что неспособность туннель ассоциируется с повышенный уровень ЛДГ мРНК7, канонические Индикатор гликолиза и гипоксии в конце третьего возраста личинок 15. Таким образом, окончательное подтверждение гипоксии для btl-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки (и в личинки, рассмотрены в будущем использовать этот assay) будет включать RT-PCR оценить уровни mRNA ЛДГ или использование коммерчески доступных индикаторов для измерения уровень внутриклеточного кислорода (например, см. 16).

Сложный спектр молекулярных генетических инструментов, имеющихся в D. melanogaster делают его ценным организма для изучения эволюции сохранение биологических процессов. Основные молекулярные ответы на наличие кислорода доказали быть сохранены через эволюцию и предварительного исследования в D. melanogaster породили проницательности в универсальные компоненты этих сигнальные пути 1,2, 3,4,5,6.
В рамках исследования, направленные на разбор функции сенсорного нейрона в D. melanogaster личинки мы определили два поведенческих реакций, которые оказались активироваться тканевой гипоксии в нормальной кислорода уровнях 7. Один из них, неспособность зарываются в пищу, очень связано с ответ на низкой кислорода, сообщает Wingrove и O'Farrell 8. Второй поведение, неспособность туннель в мягкое субстрата в конце третьего instar блуждающих фазы, не были определены ранее как связанные с гипоксией. Мы определили, что разоблачение блуждающих личинки дикого типа с низким содержанием кислорода уровнях также ингибирует субстрат, туннелирование 7, таким образом устанавливая, что обе эти поведения происходят от гипоксии,-либо индуцированного повреждения тканей или низкое потребление кислорода. Здесь мы описываем assay которую мы разработали, чтобы quantitate эти два гипоксия индуцированного поведения, который начинается с замечания сразу же после вылупления личинок.
Гипоксический ответы на ранних личиночных стадиях не были изучены ранее и поэтому анализ всей личиночной жизни является ценным компонентом нашего анализа. Большинство очевидных проявлений гипоксии – медленное развитие, слабый рост и вялость опорно – совпадают с личинок фенотипов, производимые многие мутации. Но мы обнаружили, что только третьего возраста личинки с гипоксией Показать полный провал туннеля 7. Таким образом мы определили, что даже личинок более угрозу с точки зрения роста и передвижения чем наши гипоксических личинки, все еще осуществляется туннелирование, тогда как гипоксическая личинки никогда не туннель 7. Таким образом, еще одним ценным элементом этот assay является, что она предоставляет способ установить при гипоксии является источником определенного набора плейотропный фенотипы, в отличие от некоторых других стресс или метаболических неисправности. Как проявление assay, здесь мы опишем его использования при характеристике ответы личинки с сокращением трахеи выражением uninflatable, ген, который функционирует в личиночной airways 9.
Мы предполагаем, что этот assay будет иметь ценность для исследователей, занимающихся характеризующие личиночной фенотипов, которые включают медленный рост и вялый поведение. В результате, новые гены, которые влияют на распространение, использование или ответы, могут быть определены кислород по всему телу. Кроме того включение этот assay в мутанта скрининг протокол обеспечит прямой маршрут для выявления мутаций, которые производят гипоксии. Этот assay также будет ценным в анализе схема, которая вызывает гипоксия индуцированной врожденное поведение, описанных здесь. Анализ нейронной сети этого типа является фокус много текущих исследований и простой нервной системы D. melanogaster личинка является ценным системы для рассечения из автоматического поведения. Уже были определены Сенсорные нейроны участвуют в восприятии личиночной кислорода, обеспечивая первый шаг на пути определения полной схемы для гипоксия индуцированной ответы 10,11. С помощью нашего анализа в сочетании с выборочной нейронных нокдаун через GAL4-Уан системы12 является четкий маршрут для определения дальнейших компонентов нейронной сети.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Лишение кислорода в животных может привести от воздействия низкого атмосферного кислорода или повреждения внутренних тканей, который влияет на распределение кислорода. Это также возможно, что аберрантное поведение кислорода зондирования нейронов может вызвать гипоксию подобное поведение при наличии нормальной кислорода. В D. melanogasterразвития на уровнях низкой кислорода приводит к ингибированию роста и вялый поведение личиночных стадиях. Однако эти установленные проявлений дефицита кислорода значительно пересекаются с фенотипов многие мутации, которые регулируют рост, стресс ответы или передвижения. Как результат в настоящее время не проба для выявления i) сотовых гипоксии, индуцированные мутации или ii) гипоксия подобное поведение при индуцированных ненормальное поведение нейронов.
Недавно мы определили два отличительных поведения в D. melanogaster личинки, которые происходят на нормальный кислород уровнях в ответ на внутренние обнаружения гипоксии. Во-первых на всех этапах, такие личинки избежать, прячась в пищу, часто отходит далеко от источника питания. Во-вторых туннелирование в мягкой субстрат, который обычно происходит на этапе блуждающих третьего возраста полностью отменяется при гипоксических личинки. Assay, описанные здесь предназначены для обнаружения и quantitate эти поведения и таким образом обеспечить способ выявления гипоксии, вызванные внутренние повреждения, а не низкой внешней кислорода. Пробирного пластины с агар субстрат и Центральный дрожжей пасты используются для поддержки животных через личиночной жизни. Позиции и состояния личинки отслеживаются ежедневно они перейти от первого до третьего возраста. Степени туннелирования в субстрат агар блуждающих этапе предел после Окукливание с помощью NIH ImageJ. Assay будет значение в определении, когда гипоксии является компонентом мутант фенотип и таким образом обеспечить понимание возможных мест действий в вопросе гена.

В качестве демонстрации значения этот assay мы использовали его для расследования возможных гипоксии в личинки с нарушениями функции гена uninflatable (ГФИ) в трахею. ГФИ кодирует большой трансмембранный белок, который сильно выражена на апикальной поверхности клеток личиночной трахеи. Мутанты ГФИ было ранее отмечено аберрантное поведение, которое может указывать гипоксии тканей из-за неисправности трахеи 9. Мы специально подавлены ГФИ выражение в личиночной трахеи, с использованием системы Gal4-бас. Две Gal4 линии были использованы: i) дыхание (btl)-Gal4, которая сильно выражена в трахею с самого начала их эмбрионального развития и ii) Вырезать(ue)-Gal4, который начинается выражение в небольшой задний региона основной ствол спинной трахею в конце эмбриогенеза и продолжается сильное выражение в этом регионе на протяжении жизни личинок 7. Уан -ГФИ RNAi линия была получена из Вены дрозофилы исследовательский центр (VDRC ID #1050).
Как описано в протоколе выше, пять реплицировать плиты только что вылупившихся первый instar, которую личинки были созданы для каждого из четырех кресты следующим образом.
Эксперимент 1 1) управления 1 - Вырезать(ue)-Gal4 x кантона-S (+) 2) экспериментальный 1 - Вырезать(ue)-Gal4 x UAS-ГФИ RNAi
Эксперимент 2 3) управления 2 - btl-Gal4 x кантона-S (+) 4) экспериментальный 2 - btl-Gal4 x UAS-ГФИ RNAi
Вырезать(ue) поведение-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинок 1 эксперимент был сопоставим с управления Вырезать(ue)-Gal4 > + животных с точки зрения роющих, туннелирование и выживание Окукливание, (Рисунок 1 и Рисунок 2). В противоположность этому вниз регулируя ГФИ выражение во всей системе трахеи от в начале развития (Experiment 2) производства заметно разные ответы. Btl-Gal4 > UAS -ГФИ RNAi личинки отображаются оба поведенческих проявлений тканевой гипоксии – сокращение продовольственной роющих и полное отсутствие субстрат, туннелирование позже в личиночной жизни (рис. 1 и Рисунок 2 ). Экспериментальный личинки были также заметно меньше, тоньше и более вялым, чем элементы управления (рис. 3) и показал высокий уровень смертности в ходе анализа. Как обсуждалось выше, снижение роста, вялость и научные смерти известны симптомы личиночной гипоксии. Кроме того большинство экспериментальных личинок не пытаться Окукливание и оставался как третий Инстар личинки долго после того, как pupated контроль личинки. Некоторые личинки выжили более чем за 15 дней до в конце концов умирает без pupating (рис. 1A). Некоторые экспериментальные личинок пытался окукливаются, но во всех случаях аномальных куколки были сформированы не создающих жизнеспособных взрослых.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Рисунок 1. Количественный пищи они самые и личинок развития. (A) доля живых личинок за пределами курганы продовольствия для четырех генотипов, учился здесь. Показаны средние значения для пяти пробирного пластин, используемых для каждого генотипа. На 3 день после вылупления, ~ 70% btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi личинки были вне пищи, тогда как не личинки были обнаружены за пределами пищу или на поверхности агара для трех других генотипов. Btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi личинки медленно умирать между дней 4-20, с ~ 15% из них живы через 15 дней после вылупления. Черная стрелка вдоль оси x здесь и в (B) указывает на день, в которой pupated все личинки трех других генотипов. (Б) процент погибших личинок видимые за пределами пищу для четырех генотипов. Показаны средние значения для пяти пробирного пластины для каждого генотипа. Мертвые btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi личинки накапливаются с течением времени с большинство умирает за пределами пищу. Другие всех генотипов выжить Окукливание (C) процент выживания для Окукливание для четырех генотипов изучал. Показаны средние значения для пяти пробирного пластины для каждого генотипа. Нет нормальных куколок btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi генотип были произведены. Планки погрешностей по всей фигуры представляют SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Рисунок 2. Количественный личиночной туннелирования. (A) примеры пробирного пластин для всех четырех генотипов учился после подготовки для туннелирования quantitation. Отметить полное отсутствие туннелирование для btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi личинки. Пробирного пластины являются плиты Петри 10 см. (B) туннелирование количественный производными от Image J для четырех генотипов. Средние значения пикселов для пяти пробирного пластины для каждого генотипа. Не туннелирование было отмечено для btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi личинки. Планки погрешностей = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> На рисунке 3. Сравнение btl-Gal4 > UAS ГФИ RNAi и btl-Gal4 > + личинки Личинки аналогичного возраста (6 день после вылупления) для btl-Gal4 > UAS ГФИ интерференции (A) и btl-Gal4 > + (B) генотипов. Красные стрелки указывают на трахею спинной ствола. Обе личинки, отображаемого в том же масштабе. Шкалы бар = 0.5 мм. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Протокол описывает простой проба для выявления Drosophila melanogaster личинки, которые испытывают гипоксии при нормальных атмосферного кислорода. Этот протокол позволяет гипоксических личинок необходимо отличать от других мутантов, которые показывают перекрывающихся фенотипов как вялость или медленный рост.

Assay Берроуинг/туннелирования для выявления гипоксии в Drosophila melanogaster личинки

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

Метод проверки влияния экологических сигналов на поведение спаривания в<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Автоматизированный быстрого итеративного негативные Geotaxis Assay для анализа поведения взрослых восхождение в модели дрозофилы нейродегенеративные

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Высокопроизводительный метод измерения времени седации алкоголя индивидуальной дрозофилы меланогастер

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

Улучшенный анализ и инструменты для измерения механического ноцицепции в Drosophila Larvae

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

Высокопроизводительный анализ микропластинчатого питателя для количественной оценки потребления дрозофилы

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Крупномасштабный гравитационный анализ личинок Caenorhabditis Dauer

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

Простой метод анализа двигательной активности дрозофилы

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Advancing Sleep Disorder Treatments: A Drosophila-Based Screening Approach

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System (Video) | JoVE

Высокопроизводительный скрининг низкомолекулярных препаратов на возрастные нарушения сна с использованием Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Analysis of Sugar-Induced Foraging Behavior in Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Author Spotlight: Exploring Behavioral Pathways Through Cross-Species Insights in Foraging and Communication

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

Cognitive Improvement in Chronic Hypoxia Mice with Acupuncture

Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction

Author Spotlight: Improving Anesthesia Protocols for Enhanced Mouse Acupuncture Research

The treatment of central nervous disorders has consistently posed significant challenges to the medical field. Acupuncture, a non-pharmacological practice ...