Name: a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae
Uploaded: 2018-03-27T12:30:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

Karen M. Qiang var 2016 mottagare av utmärkelsen George J. Schroepfer forskning vid Rice University. Fanli Zhou är mottagare av en undervisning stipendium från Rice University. Tjänster av stadens Bloomington Drosophila lager, Harvard resa anläggningen, Wien Drosophila Resource Center är erkänt tacksamt.

1. beredning av larver
<ol><li>Två eller flera dagar innan du börjar analysen, ställa in korsningar av önskad experimentella och kontrollera kombinationer (minimum 20 kvinnor och 10 män varje) i ägg-lay rätter som beskrivs av Wieschaus och Nusslein-Volhard 13 men med 50 mL polypropylen bägare och 6,0 cm disponibla petriskålar som innehåller druva agar och insmorda med jäst klistra in strax före användning. Hålla flugor i ägg-lay rätter i mörker vid rumstemperatur tills behövs.</li>
	<li>Grape agar recept – kombinera 100 mL fryst 100% grape juice koncentrat, 350 mL deioinized vatten, 5 mL koncentrerad ättiksyra och 13 g D. melanogaster agar i en 1 L glasbägare. Mikrovågsugn i 1-2 min skurar, omrörning mellan skurar, tills agar är alla upplöst. Cool lösningen för några minuter och tillsätt sedan 10 mL 10% (w/v) av Nipagen (metyl-p-hydroxibensoat) i 95% etanol. Mix, sedan pipetten 7 mL per platta till disponibla 6,0 cm petriskålar, låt gel och torka i rumstemperatur i 3-4 h. Store vid 4 0C i plastpåsar.</li>
	<li>Jästen pasta recept – 7 g torkad jäst, 10 mL avjoniserat vatten, blanda med en spatel tills enhetlig konsistens.</li>
	<li>Tidsinställda ägg samlingar att generera experimentella och styra larver. Använder nya, jäst-smetig, druva plattor, samla in ägg i rumstemperatur i 4 h i mörker under morgontimmarna. Ta dessa 4 h samlingsplattor och ersätta med färska plattor. Inkubera i 4 h samlingsplattor övernattning på 25 0C tills eftermiddagen nästa dag, när de flesta av larverna kommer har kläckts. Samla dessa första instar larver och använda dem för att ställa in experimentet.</li>
</ol>2. ställa in assay plattor
<ol><li>Beredning av assay plattor. För en enda körning av analysen, förbereda fem assay-plattor varje av 10 experimentella larver och fem plattor av 10 kontroll larver. Använd en 1,5 cm kork borer ta bort en central kärna av agar från varje platta som skapar ett hål för maten. Lägg jäst pasta (0.8 - 0.9 g) i hålet och klappa försiktigt med en spatel för att göra en kulle fyller hålet.</li>
	<li>Agar plattan tillredning – kombinera 700 mL avjoniserat vatten med 16 g D. melanogaster agar i en 2 L glasbägare och mikrovågsugn för 5 min. ta bort från mikrovågsugn och rör om med en glasstav att oupplöst agar i lösningen. Lägga till 17,5 mL 10% (w/v) Nipagen i 95% etanol, mix, sedan fortsätta mikrovågsugn värme i 30 s skurar följt av omrörning tills alla agar är helt upplöst. Cool i en minut eller två, sedan Pipettera 15 mL alikvoter i 10 cm petriskålar av plast. Tillåta agar till gel, täck plattorna med lock och låt dem torka i rumstemperatur ett par timmar eller över natten. Lagra plattor i förslutna plastpåsar vid 18 ° C. Observera 1: För att undvika bildandet av Nipagen kristaller på ytan av plattorna på grund av överskott dessiccation, använda tallrikar inom några dagar från beredningen. Vid behov kan kristaller upplösas igen genom att släppa några mikroliter 95% alkohol på dem. Not 2: partier av agar kan ha olika gelbildande egenskaper. Torra gel plattorna bör vara fast vid beröring och tillräckligt motståndskraftiga att en ren och intakt cirkel av agar kan tas bort när du använder den kork borer för att skapa mat hålet (se ovan).</li>
	<li>Ställa in larver i assay plattor. Använda mekaniskt tryck kurva spetsen på en plast microspatula och doppa spetsen i jäst pasta att tillhandahålla ”självhäftande” för att plocka upp larverna. Plocka upp första instar larver individuellt och placera dem på en agarplatta nära mat högen. Bered minst fem replikera plattor av 10 larver för både experimentell och kontroll genotyper. När klar, cap och märka varje platta och ställa in plattorna (locket uppåt) i en mörk plats vid rumstemperatur (i vårt labb detta är 22 ° C).</li>
</ol>3. övervakning assay plattor
<ol><li>Undersöka plattor dagligen under en dissekera Mikroskop och registrera antalet larver ovanpå maten eller ute på agar ytan. Observera eventuella synliga död eller döende larver. Observera när, och om, tunneling in den agar underskikt ses som larver flytta in tredje instar. Obs datum som puppor börjar bildas och observera eventuella Pupp avvikelser. Fortsätt dagliga observationer tills alla larver har dött eller pupated.</li>
	<li>Ta bort puppor försiktigt från plåten med en böjd retas nål och överföring till en druva tallrik. Om du vill fortsätta att övervaka puppor för att avgöra hur många eclose som vuxna.</li>
</ol>4. förbereda assay plattor för imaging
<ol><li>Försiktigt bort och kassera all jäst mat från centrala brunnen av varje platta.</li>
	<li>Försiktigt översvämning varje platta med kranvatten och använda en mjuk konstnärens pensel att försiktigt gnugga bort skräp som har spårats tryckytan agar. Ersätta vattnet flera gånger och fortsätta skonsam borstning tills varje platta är helt ren. Ger plattorna en sista sköljning med avjoniserat vatten, förslut dem och lämna i rumstemperatur över natten för att torka. Obs: Tunnel till ägarn är mest intensiva runt mat högen (se figur 2). Som ett resultat, är kanten av mat hålet vanligtvis expanderat bortom den ursprungliga 1,5 cm i diametern. Dessutom kan bräcklighet av arbetat agar i denna region orsaka små bitar av tunnlade agar förloras från omkretsen av hålet under rengöringen. Ökande gel agar koncentrationen kunde hjälpa till med dessa problem, men korrigeringar är möjliga under bild J kvantitering stegen (se nedan).</li>
</ol>5. kvantifiering av tunnlar
<ol><li>Bild plattorna. Förbereda en bild av varje platta som vidtas mot en svart bakgrund för att Visa tunnlarna i ägarn som ljusa vita linjer. Obs: Vi använder ett system som vanligen används till bild DNA geler för detta steg (se tabell för material och reagenser). Alternativ imaging system kan generera tiff-filer, till exempel digitalkameror eller cell telefonerna kamera kunde justeras för att producera lämpliga bilder.</li>
	<li>Använda programmet public domain NIH bild J för att kvantifiera larval tunneling. Ladda ner programmet från http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Mer information om programmet finns på http://imagej.nih.gov/ij/docs/intro.html. Obs: Andra bildgivande system kan användas för att kvantifiera tunneling. Instruktionerna nedan gäller för NIH bild J.</li>
	<li>Efter öppnandet en tiff fil bild tunneling platta, verktyget Oval för att definiera ett område för kvantitering som representerar hela agar ytan men grödor ut plast kanten av plattan.</li>
	<li>Tillämpa tröskelvärdet automatisk för att producera en omvänd bild av plattan, med tunnlarna visar som svarta linjer. Använd färgväljaren och pensel verktyg till vitt ut några svarta områden som representerar skador till agar snarare än tunnlar.</li>
	<li>Under analysera nedrullningsbara menyn, Välj Set skala | Klicka för att ta bort skala och sedan i fönstret Ange mått (under Analyze), kontrollera området och gräns för tröskeln.</li>
	<li>Tryck Cntrl-tangenten + M för att visa det svarta området (tunnlar) i bildpunkter.</li>
	<li>Kopiera och klistra in är pixelvärdet för varje platta till ett kalkylprogram (som Excel) som tillåter kvantitativ analys.</li>
	<li>Hål i mitten utökas vanligtvis på grund av intensiv tunneling i denna region. För att kvantifiera saknas tunneldrivning, avmarkera ”begränsa tröskel” och använda verktyget trollspö för att definiera hål i mitten. Tryck Cntrl-tangenten + M för att erhålla pixelvärdet i detta område. Subtrahera från detta värde pixelvärdet i ett 1,5 cm hål och lägga till skillnaden till det tunneling värde som erhålls i steg 5,6.</li>
	<li>För vissa plattor, kan hål i mitten saknas en bit av tunnlade agar som omfattar en region av untunneled agar anslutning till hålet. När quantitating hål i mitten för dessa plattor borsta i färgväljaren och måla verktyg för att lägga till en svart bar över regionen saknas att definiera regionen tunnlad och utesluta området icke-tunnel från kvantifieringsmetoden. Observera 1: Om experimentell larverna utföra någon tunneling, tillåter denna kvantitering beräkning av genomsnittet tunneling för uppsättningar av plattor och statistisk jämförelse av kontroll och experimentella värden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conserved+responses+to+oxygen+deprivation.">Conserved responses to oxygen deprivation.</a> J. Clin. Invest. 107 (6), 671-673 (2001).</li><li>Lavista-Llanos, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+the+hypoxic+response+in+D.+melanogaster+by+the+basic+helix-loop-helix+pas+protein+Similar.">Control of the hypoxic response in D. melanogaster by the basic helix-loop-helix pas protein Similar.</a> Mol. Cell. Biol. 22 (19), 6842-6853 (2002).</li><li>Reiling, J. H., Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hypoxia-induced+paralogs+Scylla+and+Charybdis+inhibit+growth+by+down-regulating+S6K+activity+upstream+of+Tsc+in+D.+melanogaster.">The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of Tsc in D. melanogaster.</a> Genes Dev. 18 (23), 2879-2892 (2004).</li><li>Gorr, T. A., Gassmann, M., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensing+and+responding+to+hypoxia+via+Hif+in+model+invertebrates.">Sensing and responding to hypoxia via Hif in model invertebrates.</a> J. Insect Physiol. 52 (4), 349-364 (2006).</li><li>Romero, N. M., Dekanty, A., Wappner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+developmental+adaptations+to+hypoxia:+A+D.+melanogaster+perspective.">Cellular and developmental adaptations to hypoxia: A D. melanogaster perspective.</a> Meth. Enzymol. 435, 123-144 (2007).</li><li>Dijkers, P. F., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+a+hypoxia-induced,+nitric+oxide-mediated+signaling+cascade.">Dissection of a hypoxia-induced, nitric oxide-mediated signaling cascade.</a> Mol. Biol.Cell. 20 (18), 4083-4090 (2009).</li><li>Zhou, F., Qiang, K. M., Beckingham, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Failure+to+burrow+and+tunnel+reveals+roles+for+jim+lovell+in+the+growth+and+endoreplication+of+the+D.+melanogaster+larval+tracheae.">Failure to burrow and tunnel reveals roles for jim lovell in the growth and endoreplication of the D. melanogaster larval tracheae.</a> PLOS ONE. 11, e0160233 (2016).</li><li>Wingrove, J. A., O'Farrell, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitric+oxide+contributes+to+behavioral,+cellular,+and+developmental+responses+to+low+oxygen+in+D.+melanogaster.">Nitric oxide contributes to behavioral, cellular, and developmental responses to low oxygen in D. melanogaster.</a> Cell. 98 (1), 105-114 (1999).</li><li>Zhang, L., Ward, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uninflatable+encodes+a+novel+ectodermal+apical+surface+protein+required+for+tracheal+inflation+in+D.+melanogaster.">Uninflatable encodes a novel ectodermal apical surface protein required for tracheal inflation in D. melanogaster.</a> Dev. Biol. 336 (2), 201-212 (2009).</li><li>Langlais, K. K., Stewart, J. A., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+characterization+of+two+atypical+soluble+guanylyl+cyclases+in+the+central+and+peripheral+nervous+system+of+D.+melanogaster+melanogaster.">Preliminary characterization of two atypical soluble guanylyl cyclases in the central and peripheral nervous system of D. melanogaster melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 207 (13), 2323-2338 (2004).</li><li>Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+responses+to+hypoxia+and+hyperoxia+in+D.+melanogaster+larvae.">Behavioral responses to hypoxia and hyperoxia in D. melanogaster larvae.</a> Fly. 5 (2), 119-125 (2011).</li><li>Brand, A., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Wieschaus, E., Nusslein-Volhard, C., Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+embryos.">Looking at embryos.</a> Drosophila: a practical approach. , 199-227 (1986).</li><li>Callier, V., Shingleton, A. W., Brent, C. S., Ghosh, S. M., Kim, J., Harrison, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+reduced+oxygen+in+the+developmental+physiology+of+growth+and+metamorphosis+initiation+in+D.+melanogaster.">The role of reduced oxygen in the developmental physiology of growth and metamorphosis initiation in D. melanogaster.</a> J. Expt. Biol. 216 (23), 4334-4340 (2013).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hif-+and+non-Hif-regulated+hypoxic+responses+require+the+estrogen-related+receptor+in+D.+melanogaster.">Hif- and non-Hif-regulated hypoxic responses require the estrogen-related receptor in D. melanogaster.</a> PLoS genetics. 9 (1), e1003230 (2013).</li><li>Grifoni, D., Sallazzo, M., Fontana, E., Froldi, F., Pession, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+strategies+of+oxygen+supply+in+Drosophila+malignancies+identify+tracheogenesis+as+a+novel+cancer+hallmark.">Multiple strategies of oxygen supply in Drosophila malignancies identify tracheogenesis as a novel cancer hallmark.</a> Scient. Rep. 5 (9061), (2015).</li></ol>

Författarna förklarar de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Här har vi presenterat en enkel analys för att upptäcka hypoxi i D. melanogaster larver. Diagnosen bygger på minskad grävande i mat högar i larval uppväxt och avsaknad av underskikt tunneling sent i larval livet. Larval trängsel kan orsaka för tidig migrering från en näringskälla och således en kritisk aspekt av analysen är att ett litet antal larver är analyseras i närvaro av ett stort överskott mat. Införlivandet av de fungicid metyl-p hydroxyl bensoat (Nipagen) i agarplattor är också viktigt att förhindra mögeltillväxt under analysen.
Vi tycker att agarplattor kan vara en källa till variation i analysen. Larver av samma genotyp, från olika partier av föräldrar eller från olika samlingar av larver, visar vanligtvis, relativt begränsad variant i deras beteende i analysen. Däremot agarplattor gjort på olika dagar eller med olika partier av agar kan ge skillnader i tunnel. En bestämmelse är därför att kontrollen och experimentella larver ska alla testas med agarplattor från samma batch förberedelse. Agar från olika tillverkare eller även leveranser från samma tillverkning kan variera i deras gelbildande styrka, och så kan det vara nödvändigt att justera agar koncentrationen uppåt från den 2,2% används här för att uppnå en optimal gel. Vi har funnit att vildtyp larver kan lätt håla genom 3% agar geler.
För att påvisa värdet av denna analys, vi har använt det för att undersöka potentiella hypoxi i larver med undertryckta funktion av uninflatable i luftstrupar. Våra resultat ger starkt stöd för hypotesen att förlust av luftrör uttryck för denna gen kan producera hypoxi: btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver visade underlåtenhet att håla till livsmedels- och total avsaknad av underskikt tunnel under den tredje instar. I våra tidigare studier av andra genotyper har vi observerat att hypoxi-inducerad förlust av mat grävande inte är så fullständig som förlust av underskikt tunnlar och den btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver studerat här betedde sig på samma sätt. Den misslyckade tunneling komponenten i denna analys ger därför den starkaste indikationen av hypoxi.
Även om den btl-Gal4 > uif RNAi larver visade beteendemässiga egenskaper diagnostik av hypoxi, den skär(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi inte uppvisar dessa abnormiteter. Den btl och skär(ue), Gal4 drivkrafter uttrycks i olika skeden och i olika mönster, inom de larval luftstrupar. Den btl-Gal4 driver uttrycks i hela luftrör systemet start från dess utveckling i embryogenes och fortsätter genom larval liv. I kontrast, Gal4 uttryck från den skära(ue)-Gal4 driver bara börjar i slutet av embryonala liv, efter morfogenes av luftstrupar, och är begränsad till de extrema bakre delarna av dorsala stammarna, stora longitudinella fartyg trakeal systemet. UIF knockdown med denna Gal4 kan därför inte minska uif uttryck tillräckligt tidigt eller brett nog för att ge vissa tröskelnivå för hypoxi som krävs för att utlösa beteenden mätt i denna analys.
En tidigare studie fann att tredje instar larverna utsätts för låga (10%) oxygen nivåer visar minskad tillväxt och fördröjd debut av pupariation 14. Den btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver studerat här utvecklats till den tredje instar men effekterna på deras tillväxt och förpuppningen priser var mer uttalade: de var betydligt mindre än kontroller med mycket lite fettvävnaden under den försökte pupariation epidermis (figur 3) och endast en mindre del (~ 10%). Dessa skillnader tyder på btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver upplevt en ökad grad av hypoxi, eftersom uif knockdown i luftstrupar fanns runtom hela larval livet eller eftersom det produceras mer svår syrebrist i tredje instar. Hur uif funktionsförlust i luftstrupar kan hindra syretransporten är oklart i nuläget. Luftstrupar av den btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver var synlig genom nagelbanden (figur 3), en indikation att de innehöll luft och skadades inte till den punkt att vätska posten äventyras funktionen. Det är därför formellt möjligt att luftrör skadan skapad av förlust av uif funktion inte framkalla hypoxi men hellre några andra fel som hämmar tunneling. För de genotyper som studerat tidigare, vi fast beslutna att underlåtenhet att tunnel är förknippad med förhöjda nivåer av LDH mRNA7, den kanoniska indikatorn på glykolys och hypoxi i sena tredje instar larver 15. Således, slutlig bekräftelse av hypoxi för den btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver (och i larver granskas i framtiden utnyttja denna analys) skulle innebära RT-PCR för att bedöma LDH mRNA nivåer eller användning av ett kommersiellt tillgängliga indikatorn för att mäta intracellulära syrenivåer (till exempel se 16).

Det sofistikerade utbudet av molekylära genetiska verktyg tillgängliga i D. melanogaster gör det en värdefull organism för att studera evolutionärt bevarade biologiska processer. Viktiga molekylära Svaren till syre tillgänglighet har visat sig vara bevarad över evolution och tidigare studier i D. melanogaster har genererat insikter i de universella komponenterna av dessa signalering vägar 1,2, 3,4,5,6.
Som en del av en studie som syftar till att dissekera sensoriska neuron funktion i D. melanogaster larver, identifierade vi två beteendemässiga svar som visade sig bli aktiverat vid hypoxi på normala syre nivåer 7. En av dessa, underlåtenhet att burrow i mat, är starkt relaterat till låga syrenivåer som rapporterats av Wingrove och O'Farrell 8svar. Det andra beteendet, misslyckande till tunnel i en mjuk underskikt under den sena tredje instar vandrande fas, hade inte tidigare identifierats som hypoxi-relaterade. Vi fast beslutna att utsätta vildtyp vandrande larver till låga syrenivåer också hämmar underskikt tunneling 7, således upprättande att båda dessa beteenden kommer från hypoxi - antingen inducerad av vävnadsskada eller av låga syrenivåer intag. Här beskriver vi ett test som vi utvecklat för att kvantifiera dessa två hypoxi-inducerad beteenden, som börjar med observationer omedelbart efter larver kläckning.
Hypoxisk Svaren larval tidigt inte har granskats tidigare och därför utföra en analys hela larval liv är en värdefull del av vår analys. De flesta av de uppenbara manifestationerna av hypoxi – långsam utveckling, dålig tillväxt och rörelseapparaten tröghet – överlappar larval fenotyper produceras av många mutationer. Men vi har funnit att endast tredje instar larver med hypoxi visar ett fullständigt misslyckande till tunnel 7. Således är vi fast beslutna att även larver mer äventyras när det gäller tillväxt och locomotion än våra hypoxisk larver, fortfarande utförs vissa tunnel, medan hypoxisk larver aldrig tunneled 7. Ett annat värdefullt inslag i denna analys är således att det ger ett sätt att fastställa när hypoxi är källan till en viss uppsättning pleiotropiska fenotyper, i motsats till vissa andra stress eller metaboliska fel. Som en demonstration av analysen, här beskriver vi dess användning i kännetecknar Svaren av larver med reducerad luftrör uttryck för uninflatable, en gen som fungerar i larval airways 9.
Vi tänker oss att denna analys kommer att vara av värde för forskare bedriver kännetecknar larval fenotyper som inkluderar dålig tillväxt och trög beteende. Som ett resultat av nya gener som påverkar den distribution, användning eller svar till, kunde syre i hela kroppen identifieras. Ytterligare, införliva denna analys i en mutant som screening protokoll skulle ge en direktlinje till identifiera mutationer som producerar hypoxi. Denna analys kommer också vara värdefulla i att analysera de kretsar som framkallar de hypoxi-inducerad medfödda beteenden som beskrivs här. Neurala nätverksanalys av denna typ är ett fokus på mycket aktuell forskning och enkel nervsystemet av D. melanogaster larven är ett värdefullt system för dissekera ut automatiserade beteenden. Sensoriska nervceller inblandade i larval syre perception har redan identifierats, tillhandahåller ett första steg mot att definiera den kompletta kretsen för hypoxi-inducerad Svaren 10,11. Med vår analys i kombination med selektiv neurala knockdown via de GAL4-UAS system12 är en tydlig väg för avgränsar ytterligare komponenter av neurala nätverk.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="890">
	
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">REAGENTS</td>
			<td style="width:223px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dehydrated yeast&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frozen grape juice concentrate</td>
			<td>Welch&#39;s</td>
			<td></td>
			<td>&#160;Available at most large supermarkets</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glacial acetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drosophila agar</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>66-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-para-hydroxybenzoate</td>
			<td>Apex Bioresearch Products</td>
			<td>20-658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EQUIPMENT</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ml polypropylene beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6.0 cm disposable Petri dishes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>08757100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 cm disposable plastic Petri dishes</td>
			<td>E+K Scientific</td>
			<td>EK-24104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic microspatulas</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bent teasing needle</td>
			<td>Nasco</td>
			<td>S08848MH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissecting microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Any microscope with 10-30X magnification</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a burrowing/tunneling assay for detection of hypoxia in drosophila melanogaster larvae

Syrebrist hos djur kan resultera från exponering för lågt atmosfäriskt syrenivåer eller intern vävnadsskador som stör syre distribution. Det är också möjligt att avvikande beteende av syre-sensing nervceller kunde framkalla hypoxi-liknande beteende i närvaro av normala syrehalten. I D. melanogaster, utveckling på låga syrenivåer resulterar i hämning av tillväxt och trög beteende under larval faser. Dessa etablerade manifestationer av syrebrist överlappar dock avsevärt på fenotyperna av många mutationer som reglerar tillväxt, stressreaktioner eller locomotion. Som resultat finns det för närvarande inga tillgängliga för att identifiera i) cellulär hypoxi orsakas av en mutation eller ii) hypoxi-liknande beteende när induceras av onormalt neuronala beteende analys.
Vi har nyligen identifierat två distinkta beteenden i D. melanogaster larver som inträffar vid normala syrehalten i svar till interna upptäckt av hypoxi. Först, i alla skeden undvika sådana larver gräva in mat, ofta herrelösa långt bort från en näringskälla. Det andra avskaffas tunnel in i en mjuk underskikt som normalt inträffar under vandrande tredje instar scenen helt om larverna är hypoxisk. Den analysmetod som beskrivs här är utformad för att upptäcka och kvantifiera dessa beteenden och därmed ge ett sätt att upptäcka hypoxi som induceras av inre skador i stället för låg extern syre. Assay plattor med en agar underskikt och en centrala pluggen av jäst pasta används för att stödja djur genom larval livet. Positioner och delstaten larverna spåras dagligen när de går vidare från första till tredje instar. Omfattningen av tunneling in den agar underskikt under vandrande fasen är quantitated efter förpuppningen använder NIH ImageJ. Analysen kommer att vara av värde för att avgöra när hypoxi är en komponent av en mutant fenotyp och därmed ge inblick i möjliga platser för åtgärd av genen i fråga.

Som en demonstration av värdet av denna analys har vi använt det för att undersöka potentiella hypoxi i larver med nedsatt av genen uninflatable (uif) i luftstrupar. UIF kodar ett stort transmembrane protein som uttrycks starkt på apikala ytan av larval luftrör cellerna. Mutanter av uif noterades tidigare uppvisar avvikande beteende som kan tyda på hypoxi på grund av luftrör fel 9. Vi undertryckta specifikt uif uttryck i larval luftstrupen med hjälp av Gal4-UAS-systemet. Två Gal4 linjerna användes: i) andfådd (btl)-Gal4, som uttrycks starkt i luftstrupar från början av sin embryonal utveckling och ii) skär(ue)-Gal4, som börjar uttryck i en liten bakre region i de dorsala huvudstammen luftstrupar slutet av embryogenes och fortsätter starkt uttryck i denna region under hela larval liv 7. Ett UAS -uif RNAi linje erhölls från Wien Drosophila Research Center (VDRC ID #1050).
Som beskrivs i protokollet ovan, replikera fem plattor av nykläckta första instar larver sattes upp för var och en av fyra korsar följande.
Experiment 1 (1) kontroll 1 - skär(ue)-Gal4 x Canton-S (+) (2) experimentell 1 - skär(ue)-Gal4 x UAS-uif RNAi
Experiment 2 (3) kontroll 2 - btl-Gal4 x Canton-S (+) (4) experimentell 2 - btl-Gal4 x UAS-uif RNAi
Beteendet hos den skära(ue)-Gal4 > UAS -uif RNAi larver av Experiment 1 var jämförbar med den kontroll skära(ue)-Gal4 > + djur i form av grävande, tunnel och överlevnad till förpuppningen, (figur 1 och figur 2). Down-reglerande uif uttryck i hela hela luftrör systemet från tidigt i utvecklingen (Experiment 2) produceras däremot markant olika svar. Den btl-Gal4 > UAS -uif RNAi larver visas både beteendemässiga manifestationer av hypoxi – minskat mat grävande och en total avsaknad av underskikt tunneling senare i larval livet (figur 1 och figur 2 ). Experimentell larverna var också märkbart mindre, tunnare och trögare än kontroller (figur 3), och visade en hög dödligheten under analysen. Som diskuterats ovan, är minskad tillväxt, tröghet och organismers död kända symtom på larval hypoxi. Dessutom instar de flesta av experimentella larverna misslyckades att försöka förpuppningen och förblev så tredje larver lång efter kontroll larver hade pupated. Vissa larver överlevde mer än 15 dagar innan de så småningom dör utan pupating (figur 1A). Några av experimentella larverna försökte förpuppas men i alla fall onormala puppor bildades som inte generera livskraftiga vuxna.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig1.jpg"> Figur 1. Kvantitering av mat hålhäckande och larver utveckling. (A) procentandelen levande larver utanför den mat högar för de fyra genotyper som studerats här. Medelvärden för de fem assay plattorna används för varje genotyp visas. Dag 3 efter kläckningen, ~ 70% av den btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver var utanför maten, medan inga larver upptäcktes utanför maten eller på agar ytan för de andra tre genotyperna. Den btl-Gal4 > UAS uif RNAi larverna dö långsamt mellan 4-20, dagar med ~ 15% av dem lever fortfarande 15 dagar efter kläckningen. Den svarta pilen längs x-axeln anger här och i (B) den dagen som alla larver av de tre andra genotyperna hade pupated. (B) andelen döda larver synlig utanför mat för de fyra genotyperna. Medelvärden för de fem assay plattorna för varje genotyp visas. Döda btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver ackumuleras över tiden med de flesta döende utanför maten. De andra genotyper som alla överleva att förpuppningen (C) procent överlevnad att förpuppningen för de fyra genotyperna studerade. Medelvärden för de fem assay plattorna för varje genotyp visas. Ingen normal puppor av den btl-Gal4 > UAS uif RNAi genotyp producerades. Felstaplar i hela figuren representerar SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig2.jpg"> Figur 2. Kvantitering av larval tunneling. (A) exempel på assay plattorna för alla fyra genotyper studerade efter förberedelse för tunneling kvantifieringsmetoden. Observera total avsaknad av tunneling i btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver. Assay plattorna är 10 cm Petri plattor. (B) tunneling kvantitering härrör från bild J för de fyra genotyperna. Genomsnittliga pixelvärden för fem assay plattorna för varje genotyp. Ingen tunneling observerades för den btl-Gal4 > UAS uif RNAi larver. Felstaplar = SEMs. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57131/57131fig3.jpg"> Figur 3. Jämförelse av btl-Gal4 > UAS uif RNAi och btl-Gal4 > + larver Larver av liknande ålder (dag 6 efter kläckning) för den btl-Gal4 > UAS uif RNAi (A) och btl-Gal4 > + b genotyper. Röda pilarna pekar på de dorsala stammen luftstrupar. Såväl larver som avbildas på samma förstoring. Skalstapeln = 0,5 mm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57131/57131fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae at JoVE.com

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

Protokollet beskrivs ett enkelt test för att identifiera Drosophila melanogaster larver som upplever hypoxi under normala atmosfäriskt syrenivåer. Detta protokoll tillåter hypoxisk larverna skiljas från andra mutanter som visar överlappande fenotyper som tröghet eller långsam tillväxt.

En grävande/Tunneling analys för detektion av hypoxi i Drosophila melanogaster larver

Oxygen deprivation in animals can result from exposure to low atmospheric oxygen levels or from internal tissue damage that interferes with oxygen ...

Research

JoVE Journal

Behavior

A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

A Method to Test the Effect of Environmental Cues on Mating Behavior in Drosophila melanogaster

En metod för att testa effekten av miljökanaler på parningsbeteende i<em&gt; Drosophila melanogaster</em

An individual's sexual drive is influenced by genotype, experience and environmental conditions. How these factors interact to modulate sexual behaviors ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Automatisk snabb iterativ negativa Geotaxis test för analysera vuxen klättring beteende i Drosophila modell för Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

High-Throughput Method for Measuring Alcohol Sedation Time of Individual Drosophila melanogaster

Hög genomströmning metod för mätning av alkohol Sedering Tid för enskilda Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster provides an excellent model to study the genetic underpinnings of alcohol sensitivity. In contrast to studies in human ...

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

An Improved Assay and Tools for Measuring Mechanical Nociception in Drosophila Larvae

En förbättrad analys och verktyg för att mäta mekanisk nociception i Drosophila Larver

Published assays for mechanical nociception in Drosophila have led to variable assessments of behavior. Here, we fabricated, for use with Drosophila ...

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

A High Throughput Microplate Feeder Assay for Quantification of Consumption in Drosophila

En hög genomströmnings microplate feeder analys för kvantifiering av konsumtion i Drosophila

Quantifying food intake in Drosophila is used to study the genetic and physiological underpinnings of consumption-associated traits, their environmental ...

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Storskalig gravitaxanalys av Caenorhabditis Dauer larver

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

A Simple Technique to Assay Locomotor Activity in Drosophila

En enkel teknik för att analysera lokomotorisk aktivitet i Drosophila

Drosophila melanogaster is an ideal model organism for studying various diseases due to its abundance of advanced genetic manipulation techniques and ...

Advancing Sleep Disorder Treatments: A Drosophila-Based Screening Approach

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System (Video) | JoVE

Storskalig småmolekylär läkemedelsscreening för åldersrelaterade sömnstörningar med hjälp av Drosophila melanogaster

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Analysis of Sugar-Induced Foraging Behavior in Drosophila

Tracking Sugar-Elicited Local Searching Behavior in Drosophila

Author Spotlight: Exploring Behavioral Pathways Through Cross-Species Insights in Foraging and Communication

Foraging behavior is essential for the survival of organisms as it enables them to locate and acquire essential food resources. In Drosophila, hunger ...

Cognitive Improvement in Chronic Hypoxia Mice with Acupuncture

Acupuncture Treatment in a Mouse Model of Chronic Hypoxia-Induced Cognitive Dysfunction

Author Spotlight: Improving Anesthesia Protocols for Enhanced Mouse Acupuncture Research

The treatment of central nervous disorders has consistently posed significant challenges to the medical field. Acupuncture, a non-pharmacological practice ...