Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door het Fonds zaad PIER PIF-2015-46, de goedgekeurd verleent 05K16GUA en 05K12GU3, en de "The Hamburg Centrum voor ultrasnelle Imaging-structuur, dynamiek en controle van kwestie op de atoomschaal" excellentie cluster van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Het werk van auteurs verbonden met het centrum voor vrije-elektron Laser Science werd gefinancierd door de vereniging van de Helmholtz via gerichte programmamiddelen. De synchrotron MX gegevens zijn verzameld op beamline P14 geëxploiteerd door EMBL Hamburg op de ring van PETRA III opslag (DESY, Hamburg, Duitsland).

<ol>
	<li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K.">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li><li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+protein+structure+and+dynamics:+X-ray+crystallographic+studies+of+the+protein+ribonuclease-A+at+nine+different+temperatures+from+98+to+320+K.">Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K.</a> Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).</li><li>Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+alternative+structures+of+proline+isomerase+essential+for+catalysis.">Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis.</a> Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).</li><li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+solvent+transport+in+cryo-annealing+of+macromolecular+crystals.">The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals.</a> Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+in+situ+serial+X-ray+crystallography+of+soluble+and+membrane+proteins.">In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser.">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).</li><li>von Dreele, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipattern+Rietveld+refinement+of+protein+powder+data.">Multipattern Rietveld refinement of protein powder data.</a> J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies.">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li><li>Gati, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).</li><li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams.">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).</li><li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Serial+femtosecond+crystallography:+A+revolution+in+structural+biology.">Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li><li>White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystFEL:+A+software+suite+for+snapshot+serial+crystallography.">CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography.</a> J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).</li><li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+approach+for+protein+structure+determination+at+room+temperature+via+on-chip+anomalous+diffraction.">A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction.</a> Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).</li><li>Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+X-ray+compatible+microfluidics+for+applications+in+soft+materials+and+life+sciences.">Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences.</a> Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).</li><li>Heymann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+using+a+kinetically+optimized+microfluidic+device+for+protein+crystallization+and+on-chip+X-ray+diffraction.">Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction.</a> IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).</li><li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution.">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li><li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography.">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309 (2014).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li><li>Cohen, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goniometer-based+femtosecond+crystallography+with+X-ray+free+electron+lasers.">Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).</li><li>Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Pressure+Visible+Spectroscopy+of+Polyimide+Film.">High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film.</a> J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).</li><li>Tsai, C. -. L., Yen, H. -. J., Chen, W. -. C., Liou, G. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+solution-processable+optically+isotropic+colorless+polyimidothioethers-TiO2+hybrids+with+tunable+refractive+index.">Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index.</a> J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).</li><li>Destremaut, F., Salmon, J. -. B., Qi, L., Chapel, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements.">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li><li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles.">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li><li>Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Height+Precision+Alignment+With+Selectively+Developed+Alignment+Marks.">Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks.</a> J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).</li><li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliably+distinguishing+protein+nanocrystals+from+amorphous+precipitate+by+means+of+depolarized+dynamic+light+scattering.">Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering.</a> J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).</li><li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+(COC)+microfluidic+devices.">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , (2005).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).</li><li>Murshudov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+fast+detectors+to+enter+a+new+dimension+in+room-temperature+crystallography.">Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography.</a> Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic-Indexing+of+Rotation+Diffraction+Patterns.">Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns.</a> J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).</li><li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+on+a+chip.">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).</li><li>Boukellal, H., Selimovi&#263;, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li><li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+(COC)+microfluidic+devices.">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).</li><li>Shemesh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+nanoliter+droplet+array+with+a+substrate+of+choice+for+single+adherent/nonadherent+cell+incubation+and+analysis.">Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).</li><li>Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+static+droplet+arrays+with+tuneable+gradients+in+material+composition.">Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition.</a> Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).</li><li>Shim, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+measurement+of+the+phase+behavior+of+aqueous+solutions+using+microfluidics.">Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).</li><li>Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Protein+Dense+Liquid+Cluster+Evolution+during+Nucleation+in+Protein+Crystallization.">Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization.</a> Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij fabriceren microfluidic apparaten voor in situ röntgendiffractie door patronen van epoxyhars als vulling materiaal en polyimide folie als venster materiaal. Onze procedure geoptimaliseerd verschillende stappen van het fabricageproces over vorige X-ray chip ontwerpen16,21. Wij verminderd de venster dikte en daarmee de achtergrond verstrooiing terwijl ook versoepeling fabricage als minder processtappen zijn vereist. in situ kristallisatie via het protocol beschreven heeft aanzienlijke voordelen. Het verzamelen van de gegevens van de diffractie staat bij kamertemperatuur en daarmee sluit de noodzaak cryo bescherming, die in sommige gevallen het risico bevat van de invoering van artefacten in de eiwitstructuur. Bovendien, de kristallen gelden geen fysieke spanning, omdat de overdracht van de kristallen uit hun oorspronkelijke omgeving kan worden vermeden. Via deze procedure, de kristallen handhaven van de hoogste kwaliteit en lijdt niet aan elke behandeling.
In onze ervaring rond de belangrijkste stappen in het protocol beheersen de kristallisatie proces. De parameters voor het verkrijgen van X-ray geschikt kristallen met passende afmetingen moeten empirisch worden geïdentificeerd en rechtstreeks vanuit de damp diffusie experimenten kunnen worden genomen. Met behulp van identieke concentraties van eiwitten en neerslaande niet altijd leiden tot kristallen in verschillende chips, of soms in verschillende putten binnen dezelfde chip. Dit geeft aan dat alle factoren die beïnvloeden crystal nucleatie en groei moeten zorgvuldig worden, zoals moeder liquor samenstelling of kristallisatie kinetiek (via het traject van de verdamping). Als grotere kristallen met hogere resolutie diffract, worden voldoende grote kristallen ideaal gekweekt. Het proces van crystal nucleatie en groei kan worden gevolgd met DLS metingen. Aanpassing van de laser focus binnen de ~ 50 µm kunnen dunne kristallisatie compartimenten van de chip uitdagend en zorgvuldige handmatige aanpassing is mogelijk. Met behulp van putten dieper dan 100 µm, was laser auto-uitlijning haalbaar en betrouwbaar, zodat meerdere putten kunnen worden gecontroleerd door middel van geautomatiseerde overname regelingen.
De chips van polyimide gebaseerd X-ray produceren slechts een lage achtergrond en wij laten zien dat de geschiktheid van deze apparaten voor routine röntgendiffractie gegevensverzameling door het oplossen van de structuren voor drie model eiwitten. De beste resolutie verkregen in chip verschilden, vergeleken met de eerder bereikte resoluties, van aanzienlijk groter eiwit kristallen en conventionele röntgenfoto gegevensverzameling. Dit zou te wijten aan verschillende factoren en kristallisatie voorwaarde optimalisatie kan verder verbeterd de diffractie. Was het mogelijk om in situ diffractie gegevens tot 1,8 Å resolutie toepassen kristal met afmetingen kleiner dan 30 µm te verzamelen. De gedetailleerde analyse van Thaumatine diffractie gegevens geboden inzichten over schade door straling. Als u wilt beperken van de mate van schade door straling, slechts één enkel kristal dienen te worden blootgesteld plaatsen per compartiment in het microfluidic-apparaat, zoals de verspreiding van radicalen en in het naburige kristallen kan optreden. Ter verbetering van de snelheid van gegevensverzameling, moet dit worden geautomatiseerd in de toekomst.
Als gevolg van crystal morfologie, in sommige gevallen kan een voorkeur oriëntatie optreden. Dit was bijvoorbeeld het geval met de dataset thioredoxin, waar de kristallen had een sterk voorkeur oriëntatie ten opzichte van de Vensters van de chip. Zelfs hier, kunnen wij een volledige diffractie dataset verzamelen. Als kristallen een voorkeur oriëntatie in chip vertonen en in het bijzonder als de bijbehorende ruimtegroep ook een lage symmetrie heeft, vervolgens de volledigheid van de dataset moet worden gecontroleerd tijdens de collectie zodanig dat voldoende diffractie patronen riet verzameld.
Time-resolved studies met behulp van deze chips zijn direct mogelijk wanneer met behulp van licht reacties met een benadering van de pomp-sonde geïnduceerde. De polyimide folie lichttransmissie, zodat de laser van de pomp moet worden opgehelderd en anderzijds duidelijke optisch polyimide of COC kan worden gebruikt. De huidige microfluidic geometrieën toegestaan niet voor substraat mixen experimenten nadat de kristallen zijn gegroeid. We verwachten echter dat de beschreven X-ray chip fabricage protocol ook geschikt is voor dergelijke ontwerpen voor beide röntgendiffractie time-resolved mengen evenals verstrooiing benaderingen19.

Het kennen van de 3D structuur van een eiwit is essentieel om te begrijpen van de functionaliteit. In de buurt van de atomaire resolutie structuren zijn tot nu toe meestal verkregen door middel van röntgendiffractie. Deze techniek bloot eiwit kristallen aan Röntgen straling en de resulterende diffractie patronen worden vervolgens geanalyseerd voor structuurbepaling en verfijning. In traditionele röntgendiffractie, is een volledige diffractie dataset opgenomen van een enkele, ideaal groot, kristal bij cryogene temperaturen. Deze kristallen, zijn echter meestal niet triviaal om te groeien en te identificeren van geschikte cryo-behoud voorwaarden kan worden uitdagend op zichzelf en kan soms ook leiden tot afwijkingen van de inheemse proteïne structuur5.
Recente technologische vooruitgang in X-ray gratis-elektron laser (FEL) en synchrotron straallijnen hebben toegestaan om op te lossen structuren van kleinere kristallen, als nieuwe micro-focusing straallijnen, verhoogde X-ray beam schittering en verbeterde X-ray detectoren werd beschikbaar:6,7. Kleine kristallen zijn doorgaans gemakkelijker te groeien dan grote en defect gratis kristallen8,9. Echter lijden kleine kristallen X-ray stralingsschade veel sneller dan grote kristallen. Dit is omdat in vergelijking met een groot kristal, een hogere dosis van X-ray in een kleiner volume van het kristal te diffract naar vergelijkbare resolutie moet worden geprojecteerd. Zelfs cryogene bescherming is daarom vaak niet voldoende om vast te leggen van een volledige diffractie-gegevensset van een enkele microcrystal.
Om te overwinnen deze hindernis, seriële kristallografie uitgegroeid tot de methode van keuze te verzamelen en samenvoegen van diffractie patronen uit vele willekeurig georiënteerde microcrystals te verkrijgen van een volledige dataset. Straling geïnduceerde crystal schade wordt geminimaliseerd door het verspreiden van de totale dosis röntgenstraling gebruikt bij het oplossen van de eiwitstructuur van een over een groot aantal kristallen5,10. In een ' diffract voordat vernietigen ' FEL experimenteren, elk kristal wordt alleen gebruikt voor één blootstelling met behulp van femto-tweede X-ray pulsen. Micro-focus straallijnen op derde generatie synchrotron bronnen kunnen op hun beurt uitvoeren seriële kristallografie met een paar milliseconden korte X-ray blootstelling11,12,13,14. Zonder een kristal trilling of rotatie tijdens het verzamelen van gegevens, echter alleen gedeeltelijke Bragg reflecties kunnen worden opgenomen en dus tienduizenden of meer diffractie patronen zijn meestal nodig voor de structuur vastberadenheid15. Tot op heden, is een gevarieerde set van methoden voor het afleveren van monster ontwikkeld voor seriële kristallografie, als onlangs herziene14,16,17,18,19. Onder degenen, verschillende vaste-target gebaseerd monster levering strategieën werden met succes gecombineerd met crystal rotatie tijdens X-ray belichtingen zodanig dat aanzienlijk minder diffractie patronen ook volledige bestanden bieden kunnen terwijl het ook verbruiken minder monster in vergelijking tot klassieke seriële kristallografie experimenten waar stilstaande beelden zijn opgenomen7,16,20,21,22,23 , 24.
We presenteren een protocol om het fabriceren van microfluidic apparaten met lage X-ray achtergrond. De apparaten zijn patroon van 5-min epoxy lijm met behulp van zachte lithografie en zijn geschikt voor in-situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur, die profiteren van de integratie van de bereiding van de monsters rechtstreeks in de X-ray set-up, in voorkomend geval met time-resolved studies die mengen-geïnduceerde kinetiek18,19 volgen. Microfluidic kanalen zijn hardplastic aan beide zijden met polymere polyimide folie, resulterend in X-ray windows met een gecombineerde dikte van ongeveer 16 µm waarmee voor lage X-ray achtergrond imaging. Alle gebruikte materialen bieden goede oplosmiddel weerstand. Deze fabricage methode is relatief eenvoudig en goedkoop. Na de inkoop van een SU-8 meester wafer, kan alle fabricage worden uitgevoerd buiten een cleanroom in een typische onderzoek lab omgeving.
In een toepassing bijvoorbeeld beschrijven we chips voor goniometer vaste doelstelling seriële kristallografie gebaseerde. Ten eerste, het ontwerp en de fabricage overwegingen voor het gebruik van de capillaire kleppen te splitsen een waterige reactie in een geselecteerd aantal nanoliter formaat druppels microfluidically worden besproken. Dit mechanisme laden vermijdt het verlies van de steekproef van kanaal doden-volume en splitsen kan gemakkelijk uitgevoerd worden handmatig zonder gebruik te maken van pompen of andere apparatuur voor vloeiende bediening. Deze geïsoleerde nanoliter formaat druppels eiwit oplossing zijn gecontroleerde in situ met behulp van Dynamische lichtverstrooiing (DLS &AMP;) controle eiwit crystal nucleatie en groei. Eerder is gebleken dat DLS in microfluidic apparaten die bestaat uit een structuur van de Polydimethylsiloxaan (PDMS metingenmogen) gebonden aan een glas dia25,26. Omdat de polyimide laag een hoge transmissie voor golflengtes langer dan 550 heeft nm, de aanpak kan worden uitgebreid naar maten in X-ray transparante chips, bij gebruik van een passende laser golflengte27,28. Gebaseerd op de resultaten van Distributielijsten, eerste nucleatie kan worden waargenomen, en verdere druppel verdamping kan worden gestopt met het oog op minder, maar grotere eiwit kristallen.
Na voldoende kristallen geteeld worden, kan volledige röntgendiffractie datasets dan worden verzameld met behulp van goniometer gebaseerd in situ vaste doelstelling seriële röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Diffractie datasets worden verwerkt met behulp van een reeks softwarehulpmiddelen en aangepaste scripts op te lossen de kristalstructuur van eiwit. Deze techniek vermijdt artefacten vaak geïnduceerde tijdens cryo-behoud gebruikt in conventionele kristallografie experimenten.
We vergelijken drie eiwit doel structuren die werden opgelost met behulp van over 10-20 µm kleine kristallen gegroeid in chip beter dan 2 Å resolutie. Door het kristalliseren en buigingsinrichting in situ, overslag en vandaar mechanische storingen van fragiele kristallen wordt geminimaliseerd. Dit protocol kan worden toegepast voor eiwit kristallen die diffract op hoge resolutie, evenals lage resolutie (1.7 Å naar 3.0 Å). Zoals bijna elke crystal worden voor diffractie gebruikt kan, wordt kleine monster verspild, waardoor dit een zeer efficiënte crystal leveringsmethode.
Dit protocol biedt een gedetailleerde gids over hoe voor te bereiden X-ray transparante microfluidic chips in situ eiwit kristallisatie en diffractie gegevensverzameling. De procedure is zorgvuldig ontworpen om te profiteren van de microfluidic precisie zonder geavanceerde apparatuur in het lab. Verzamelen van de gegevens op de synchrotron beamline, kan ook door niet-deskundigen zonder een gespecialiseerde goniometer of luchtbevochtiger te gemakkelijk reproduceren de resultaten te worden uitgevoerd. De gepresenteerde techniek kan worden toegepast voor seriële milliseconde kristallografie gegevensverzameling bij kamertemperatuur terwijl de stralingsschade minimaal en zonder invoering van stress aan de kristallen na groei door cryo-bescherming of crystal behandeling. Vandaar dat de beschreven methode is geschikt voor elk eiwit kristallisatie project.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 Series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3000</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Plus Schnellfest 5 min</td>
			<td>Epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton foil</td>
			<td>Dupont/ American Durafilm</td>
			<td>HN grade, gauge 30 (7.5 &#956;m)</td>
			<td>polyimide foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440167</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Cytop fluoropolymer coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Cytop fluoro-solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fluorinated oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk Inc.</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>Uni-core 0.75 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo mask</td>
			<td>JD Photo Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma machine</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Isomerase</td>
			<td>Hamton Research</td>
			<td>HR7-102</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tartrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106664</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763.2</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1064060250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CSS-389</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroLight600</td>
			<td>XtalConcepts</td>
			<td></td>
			<td>DLS Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td>
			<td>Bioblock/05</td>
			<td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1ml Luer-Lock Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>Terumo Agani Needle</td>
			<td>AN*2716R1</td>
			<td>27Gx5/8&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Dit protocol beschrijft om microfluidic apparaten met lage X-ray achtergrond geoptimaliseerd voor goniometer vaste doelstelling seriële kristallografie gebaseerde. De apparaten zijn patroon van epoxy lijm met behulp van zachte lithografie en zijn geschikt voor in situ röntgendiffractie experimenten bij kamertemperatuur. De monster-putten zijn hardplastic aan beide zijden bekleed met polymere polyimide folie windows waarmee diffractie gegevensverzameling met lage X-ray achtergrond. Deze fabricage methode is undemanding en goedkoop. Na de inkoop van een SU-8 meester wafer, kan alle fabricage worden uitgevoerd buiten een cleanroom in een typische onderzoeksomgeving lab. Het protocol voor ontwerp en fabricage van chip gebruiken capillaire kleppen te splitsen een waterige reactie in gedefinieerde nanoliter formaat druppeltjes microfluidically. Dit mechanisme laden vermijdt het verlies van de steekproef van dode-volume kanaal en kan gemakkelijk handmatig worden uitgevoerd zonder gebruik te maken van pompen of andere apparatuur voor vloeiende bediening. We beschrijven hoe geïsoleerd nanoliter formaat druppels eiwit oplossing kan worden gecontroleerd in situ door dynamische licht verstrooiing controle eiwit crystal nucleatie en groei. Nadat geschikt kristallen geteeld worden, kan volledige röntgendiffractie datasets worden verzameld met behulp van goniometer gebaseerd in situ vaste doelstelling seriële röntgendiffractie bij kamertemperatuur. Het protocol biedt aangepaste scripts voor het verwerken van diffractie datasets met behulp van een suite van softwaretools op te lossen en verfijnen van de eiwit-kristalstructuur. Deze aanpak voorkomt de artefacten die eventueel veroorzaakte tijdens cryo-behoud of handmatige crystal behandeling in conventionele kristallografie experimenten. We presenteren en vergelijk drie eiwit structuren die werden opgelost met behulp van kleine kristallen met afmetingen van ongeveer 10-20 µm gegroeid in chip. Door het kristalliseren en buigingsinrichting in situ, overslag en vandaar mechanische storingen van fragiele kristallen wordt geminimaliseerd. Het protocol detailleert hoe te fabriceren van een aangepaste X-ray transparante microfluidic chip geschikt voor in situ seriële kristallografie. Zoals bijna elke crystal kan worden gebruikt voor het verzamelen van de gegevens van diffractie, zijn deze microfluidic chips een zeer efficiënt crystal leveringsmethode.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Dit protocol beschrijft in detail hoe te fabriceren en te exploiteren van microfluidic apparaten voor röntgendiffractie gegevensverzameling bij kamertemperatuur. Bovendien, het beschrijft hoe eiwitten kristallisatie controleren door Dynamische lichtverstrooiing en hoe om te verwerken en analyseren diffractie gegevens verkregen.

Microfluidic Chips voor In Situ Crystal röntgendiffractie en In Situ Dynamische lichtverstrooiing voor seriële kristallografie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Het voorbereiden hechtende cellen voor X-stralen fluorescentie beeldvorming door Chemical Fixatie

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

X-ray poederdiffractie in Conservation Science: Towards Routine kristalstructuurbepaling van Corrosie Producten over Heritage Kunstobjecten

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

High Pressure Single Crystal diffractie bij PX ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Meting van de deeltjesgrootteverdeling in Troebele Solutions van Dynamic Light Scattering Microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Kwantificeren van Röntgen fluorescentie gegevens met behulp van MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

DNA-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Snelle nanosonde signaal versterking door In Situ gouden Nanoparticle synthese

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Elemental-gevoelige detectie van de chemie in batterijen door zachte X-ray Absorptie spectroscopie en Resonant inelastisch X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Verbetering van de extrusie van de hoge viscositeit van Microcrystals voor Time-resolved seriële femtoseconde kristallografie aan X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Toepassing van spanning in dynamic light scattering particle size analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...