Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par le Fonds de semence PIER PIF-2015-46, le BMBF accorde 05K16GUA et 05K12GU3 et le cluster d’excellence « Le Centre de Hambourg pour imagerie ultrarapide – Structure, dynamique et contrôle de la matière à l’échelle atomique » de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Le travail des auteurs affiliés ainsi qu’avec le Centre pour la Science de Laser d’électrons libres a été financé par l’Association Helmholtz, par le biais de fonds destinés aux programmes orientés. Les données de MX de synchrotron ont été collectées au beamline P14 exploité par EMBL Hamburg à l’anneau de stockage de PETRA III (DESY, Hambourg, Allemagne).

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous fabriquons des dispositifs microfluidiques pour in situ la diffraction des rayons x par la structuration de la résine époxy comme matériau et polyimide aluminium comme matériau de fenêtre de remplissage. Notre procédure optimisée différentes étapes de la fabrication au cours de la précédente aux rayons x puce dessins16,21. Nous avons réduit l’épaisseur de la fenêtre et ainsi l’arrière-plan tout en facilitant également fabrication de diffusion comme moins d’étapes sont nécessaires. in situ la cristallisation en utilisant le protocole décrit a des avantages substantiels. Il permet la collecte de données de diffraction à température ambiante et exclut ainsi la nécessité de la protection de cryo, qui, dans certains cas, contient le risque d’introduire des objets dans la structure des protéines. Par ailleurs, les cristaux ne sont pas soumis à un stress physique, parce que le transfert des cristaux de leur environnement natif peut être évité. Par le biais de cette procédure, les cristaux de maintiennent leur qualité et ne souffrent d’aucun traitement.
Dans notre expérience, les étapes plus critiques au sein du protocole tournent autour de contrôler le processus de cristallisation. Les paramètres afin d’obtenir des cristaux adaptés aux rayons x aux dimensions appropriées doivent être déterminés de façon empirique et ne peuvent être prises directement depuis les expériences de diffusion de vapeur. En utilisant des concentrations de protéines et précipitant identiques n’a pas toujours abouti dans les cristaux dans différentes puces, ou parfois dans les différents puits au sein de la même puce. Ceci indique que tous les facteurs qui influencent la croissance et la nucléation des cristaux devraient être considérés avec précaution, comme la cinétique de composition ou de cristallisation de liqueur mère (à travers la trajectoire de l’évaporation). Comme cristaux plus grands diffracter à une résolution plus élevée, suffisamment gros cristaux est idéalement passées. Le processus de nucléation de cristal et de la croissance peut être suivi avec des mesures de DLS. Focaliser le laser à l’intérieur de la ~ 50 µm compartiments de cristallisation fine de la puce peuvent être difficiles et peuvent nécessiter un alignement manuel soigné. À l’aide de puits plus profonds que 100 µm, laser auto-alignement était faisable et fiable, tel que plusieurs puits pourraient être surveillés par des systèmes automatisés d’acquisition.
Les puces de rayons x de polyimide basé produisent seulement un faible bruit de fond et nous démontrer l’adéquation de ces dispositifs pour la routine de collecte de données de diffraction des rayons x en résolvant les structures de trois protéines de modèle. La meilleure résolution obtenue dans puce différente, comparée à celle des résolutions précédemment obtenues, significativement plus grands cristaux de protéines et de collecte de données de radiographie conventionnelle. Cela pourrait être dû à plusieurs facteurs et optimisation de condition de cristallisation peut améliorer encore davantage la diffraction. Il a été possible de recueillir sur place des données de diffraction jusqu'à une résolution 1,8 Å application crystal avec dimensions inférieure à 30 µm. L’analyse détaillée des données de diffraction thaumatine fourni des renseignements sur les dommages de rayonnement. Pour limiter l’extension des dommages de rayonnement, qu’un seul cristal unique devrait être exposé chaque compartiment dans le dispositif microfluidique, car la diffusion des radicaux à et dans les cristaux voisins peut se produire. Pour améliorer la vitesse de collecte de données, ceci devrait être automatisé à l’avenir.
En raison de la morphologie des cristaux, dans certains cas une orientation préférentielle peut se produire. Par exemple, c’était le cas avec le dataset thiorédoxine, où les cristaux ont une orientation fortement privilégiée par rapport à des fenêtres de la puce. Même ici, nous pourrions recueillir un ensemble de données complet de diffraction. Si les cristaux présentent une orientation préférentielle dans la puce, et en particulier si le groupe d’espace correspondant a aussi une symétrie faible, puis l’intégralité de l’objet dataset doit être surveillée lors de la collecte que soit suffisamment canne de motifs de diffraction recueillies.
Études de résolution temporelle à l’aide de ces puces sont directement possibles quand utilisant la lumière induit des réactions avec une approche de la pompe-sonde. La transmission lumineuse de polyimide clinquant pour le laser de pompe doit être élucidé et alternativement, optiquement clair polyimide ou COC pourrait être utilisé. Les géométries de microfluidique actuelle ne permettent pas de mixage expériences après que les cristaux croissent de substrat. Toutefois, nous espérons que le protocole de fabrication de puce aux rayons x décrit également convenir pour ces dessins pour les deux diffraction des rayons x résolue dans le temps de mélange ainsi que diffusion des approches19.

Il est essentiel de comprendre sa fonctionnalité de connaître la structure 3D d’une protéine. Résolution atomique près de structures sont jusqu'à présent plus souvent obtenues par cristallographie aux rayons x. Cette technique expose des cristaux de protéine à rayons x et les patrons de diffraction qui en résultent sont ensuite analysées pour le raffinement et la détermination de la structure. En diffraction traditionnel, un ensemble de données complet de diffraction est rapporté d’un cristal unique, idéalement large, à des températures cryogéniques. Ces cristaux, cependant, n’est généralement pas trivial de croître, et les conditions de la cryo-préservation appropriée peut devenir difficile en soi et peut parfois également provoquer des déviations par rapport à la structure de la protéine native5.
Laser à électrons libres aux rayons x (FEL) et les faisceaux de rayonnement synchrotron, les progrès technologiques récents ont permis de résoudre les structures des cristaux plus petits, comme nouveaux faisceaux micro-focalisation, accrue aux rayons x des rondins brilliance et amélioration des détecteurs de rayons x est devenu disponible6,7. En général, les petits cristaux est plus faciles à poussent plus grandes et défauts des cristaux libres8,9. Cependant, les petits cristaux souffre de radiolésions radiographie beaucoup plus rapide que de grands cristaux. C’est parce que par rapport à un gros cristal, une plus forte dose de rayons x doit être projetée dans un plus petit volume de cristal à diffracter à résolution comparable. Par conséquent, protection même cryogénique n’est souvent pas suffisante pour enregistrer un ensemble de données complet de diffraction d’un nom unique.
Pour surmonter cet obstacle, cristallographie de la série est devenue la méthode de choix pour collecter et fusionner des patrons de diffraction de nombreux microcristaux orientés au hasard pour obtenir un ensemble de données complet. Les rayons des dommages induits crystal sont minimisé en répartissant la dose totale de rayons x utilisés pour résoudre une structure protéique au cours d’un grand nombre de cristaux5,10. Dans un ' diffracter auparavant détruire ' FEL expérimenter, chaque cristal est utilisé uniquement pour une exposition à l’aide d’impulsions de rayons x de femto-seconde. Micro-focus faisceaux à des sources de rayonnement synchrotron troisième génération à son tour peut effectuer cristallographie série avec quelques millisecondes court13,de12,de11,avec des rayons x d’expositions14. Sans une oscillation de cristal ou de rotation au cours de la collecte de données, cependant, seulement des réflexions de Bragg partielles peuvent être enregistrées et donc des dizaines de milliers ou plusieurs patrons de diffraction sont normalement exigées pour la détermination de structure15. A ce jour, un éventail de méthodes de livraison des échantillons a été développé pour la série cristallographie, comme récemment révisé14,16,17,18,19. Parmi ceux, plusieurs cibles fixes basée livraison d’échantillon stratégies ont été combinées avec succès avec rotation de cristal au cours d’expositions aux rayons x telle que significativement moins patrons de diffraction peuvent fournir également des ensembles de données complets tout en également consommer moins échantillon par rapport à la cristallographie série classique expériences où les images fixes sont enregistrement7,16,20,21,22,23 , 24.
Nous présentons un protocole visant à fabriquer des dispositifs microfluidiques avec faible bruit de fond des rayons x. Les dispositifs sont inspire de la colle époxy 5 min à l’aide de lithographie douce et conviennent pour des expériences de diffraction des rayons x in situ à la température ambiante qui profitent de l’intégration de la préparation des échantillons directement dans la mise en place des rayons x, selon le cas avec résolution temporelle des études qui suivent cinétique induite par le mélange18,19. Canaux microfluidiques est balconnet sur les deux côtés avec une feuille de polymère polyimide, résultant dans windows x-ray avec une épaisseur combinée d’environ 16 µm qui permettent pour l’imagerie de fond faible aux rayons x. Tous les matériaux utilisés fournissent la bonne résistance aux solvant. Cette méthode de fabrication est relativement simple et peu coûteuse. Après l’approvisionnement d’une plaquette de maître SU-8, tous de fabrication peut être complétée à l’extérieur de la salle blanche dans un laboratoire recherche typique.
Dans un exemple d’application, nous décrivons puces pour goniomètre basé cible fixe série cristallographie. Tout d’abord, les considérations de conception et fabrication pour l’utilisation de valves capillaire à microfluidically diviser une réaction aqueuse dans un certain nombre de gouttelettes nanolitres de taille sont discutées. Ce mécanisme de chargement permet d’éviter la perte d’échantillon de morts-volume du canal et fractionnement peut facilement être effectué manuellement sans l’aide de pompes ou autres équipements pour actionnement fluide. Ces gouttes isolées nanolitres taille de solution protéique sont surveillés in situ à l’aide de diffusion dynamique de la lumière (DLS) contrôle protéine crystal nucléation et croissance. Il a été précédemment démontré que DLS mesures peuvent être réalisées dans les dispositifs microfluidiques consistant en une structure de polydiméthylsiloxane (PDMS) collée sur un verre diapositive25,26. Parce que la couche de polyimide a une forte transmission de longueurs d’onde plus de 550 nm, l’approche peut être étendue aux Mensurations en jetons transparents de radiographie ainsi, lorsque vous utilisez un de27,de longueur d’onde laser approprié28. Basé sur les résultats DLS, nucléation initiale peut être observée, et autre évaporation goutte peut être arrêtée pour obtenir des cristaux de protéines moins nombreux mais plus gros.
Après que suffisamment de cristaux est cultivés, ensembles de données complets de diffraction des rayons x peuvent ensuite être collectées à l’aide de goniomètre basé sur place fixée cible série diffraction à température ambiante. Ensembles de données de diffraction sont traitées à l’aide d’une suite d’outils logiciels et des scripts personnalisés pour résoudre la structure cristalline de protéine. Cette technique évite les objets souvent induites au cours de la cryo-préservation utilisée dans des expériences de diffraction conventionnelle.
Nous comparons trois structures de protéine cible qui ont été résolus en utilisant environ 10 à 20 µm petits cristaux cultivés dans la puce au mieux puis 2 résolution Å. Par cristallisation et diffractant in situ, manipulation et donc mécanique des perturbations des cristaux fragiles est réduit au minimum. Ce protocole peut être appliqué pour des cristaux de protéines qui diffracter à haute résolution ainsi que la faible résolution (1,7 Å à 3,0 Å). Comme presque chaque cristal peut être utilisé pour la diffraction, petit échantillon est gaspillée, ce qui en fait une méthode de livraison de cristal très efficace.
Ce protocole prévoit un guide détaillé sur comment préparer les puces microfluidiques transparent aux rayons x en situ protéine cristallisation et diffraction de collecte de données. La procédure a été soigneusement conçue pour bénéficier de microfluidique précision sans nécessiter des équipements sophistiqués dans le laboratoire. En outre, la collecte de données à la source de rayonnement synchrotron peut être effectuée sans nécessiter un goniomètre spécialisé ou un humidificateur pour faciliter la reproduction des résultats par des non-spécialistes. La technique présentée peut être appliquée milliseconde série cristallographie collecte de données à température ambiante tout en gardant les radiolésions minime et sans introduire de stress aux cristaux après une croissance de manutention cryo-protection ou cristal. Par conséquent, la méthode décrite est adaptée pour tout projet de cristallisation de protéines.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 Series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3000</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Plus Schnellfest 5 min</td>
			<td>Epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton foil</td>
			<td>Dupont/ American Durafilm</td>
			<td>HN grade, gauge 30 (7.5 &#956;m)</td>
			<td>polyimide foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440167</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Cytop fluoropolymer coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Cytop fluoro-solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fluorinated oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk Inc.</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>Uni-core 0.75 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo mask</td>
			<td>JD Photo Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma machine</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Isomerase</td>
			<td>Hamton Research</td>
			<td>HR7-102</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tartrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106664</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763.2</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1064060250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CSS-389</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroLight600</td>
			<td>XtalConcepts</td>
			<td></td>
			<td>DLS Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td>
			<td>Bioblock/05</td>
			<td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1ml Luer-Lock Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>Terumo Agani Needle</td>
			<td>AN*2716R1</td>
			<td>27Gx5/8&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Ce protocole décrit la fabrication des dispositifs microfluidiques avec faible bruit de fond des rayons x optimisé pour goniomètre basé cible fixe série cristallographie. Les dispositifs sont inspire de la colle époxy à l’aide de lithographie douce et conviennent pour des expériences in situ de diffraction des rayons x à température ambiante. Les puits d’échantillon sont balconnet sur deux côtés avec fenêtres de feuille polymérique polyimide qui permettent la collecte de données de diffraction avec faible bruit de fond des rayons x. Cette méthode de fabrication est peu exigeant et peu coûteux. Après l’approvisionnement d’une plaquette de maître SU-8, tous de fabrication peut être complétée à l’extérieur de la salle blanche dans un environnement de laboratoire de recherche typique. Le protocole de conception et fabrication de puce utiliser robinetterie capillaire à microfluidically diviser une réaction aqueuse définie nanolitres taille goutelettes. Ce mécanisme de chargement permet d’éviter la perte d’échantillon de morts-volume du canal et peut facilement être effectué manuellement sans l’aide de pompes ou autres équipements pour actionnement fluide. Nous décrivons comment isolé nanolitres taille gouttes d’une solution protéique peut être contrôlée in situ de la dynamique de la lumière diffusion contrôle protéine crystal nucléation et croissance. Après que cristaux adaptés est cultivés, diffraction des rayons x complet des ensembles de données peuvent être collectées à l’aide de goniomètre basé sur place fixée cible série diffraction à température ambiante. Le protocole prévoit des scripts personnalisés pour traiter des ensembles de données de diffraction en utilisant une suite d’outils logiciels de résoudre et d’affiner la structure cristalline de protéine. Cette approche évite les objets éventuellement induites lors de cryoconservation ou manuel à cristaux de manutention dans les expériences de diffraction conventionnelle. Nous présentons et comparer trois structures de protéines qui ont été résolus à l’aide de petits cristaux avec des dimensions d’environ 10 à 20 µm, cultivé dans la puce. Par cristallisation et diffractant in situ, manipulation et donc mécanique des perturbations des cristaux fragiles est réduit au minimum. Le protocole détaille comment fabriquer une puce de microfluidique transparent aux rayons x personnalisée adaptée aux in situ série cristallographie. Comme presque chaque cristal peut être utilisé pour la collecte de données de diffraction, ces puces microfluidiques sont une méthode de livraison de cristal très efficace.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Ce protocole décrit en détail comment fabriquer et utiliser des dispositifs microfluidiques pour la collecte de données de diffraction des rayons x à la température ambiante. En outre, il décrit comment contrôler la cristallisation de protéines en diffusion dynamique de la lumière et comment traiter et analyser des données de diffraction a obtenu.

Puces microfluidiques pour diffusion de lumière dynamique Diffraction de rayons x de cristaux In Situ et In Situ pour série cristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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