Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00
Duration: 11 min 48 s
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Diese Arbeit wurde unterstützt vom PIER Seed Fonds PIF-2015-46, das BMBF gewährt, 05K16GUA und 05K12GU3 und des Exzellenzclusters "The Hamburg Zentrum für ultraschnelle Imaging – Struktur, Dynamik und Kontrolle der Materie auf atomarer Skala" der deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG). Die Arbeit der Autoren verbunden mit dem Center for Free-Electron Laser Science wurde von der Helmholtz-Gemeinschaft durch orientierte Fördermittel finanziert. Die Synchrotron MX Daten wurden am Strahlrohr P14 betrieben von EMBL Hamburg bei PETRA III-Speicherring (DESY, Hamburg, Deutschland).

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir fertigen mikrofluidischen Geräten für in Situ Röntgenbeugung von Epoxidharz als Füllung Material und Polyimid-Folie als Fenstermaterial Musterung. Unser Verfahren optimiert verschiedene Schritte von der Fertigung über früheren Röntgen-Chip-Designs16,21. Wir reduziert die Fensterdicke und damit gleichzeitig auch Herstellung Streuung Hintergrund so weniger Prozessschritte erforderlich sind. in Situ Kristallisation über das beschriebene Protokoll hat erhebliche Vorteile. Es ermöglicht die Beugung Datenerhebung bei Raumtemperatur und damit schließt die Notwendigkeit der Cryo-Schutz, die in einigen Fällen das Risiko der Einschleppung von Artefakten in der Proteinstruktur enthält. Darüber hinaus unterliegen die Kristalle nicht körperliche Belastung, weil die Übertragung der Kristalle aus ihrer natürlichen Umgebung vermieden werden kann. Durch dieses Verfahren die Kristalle behalten ihre höchste Qualität und eine Behandlung nicht leiden.
Nach unserer Erfahrung umkreisen die kritischsten Schritte innerhalb des Protokolls der Kristallisation zu kontrollieren. Die Parameter x-ray geeignet Kristalle mit entsprechenden Dimensionen zu erhalten müssen empirisch ermittelt werden und können nicht auf einer Dampf-Diffusion-Experimente direkt entnommen werden. Mit identischen Konzentrationen des Proteins und Fällungsmittel ergaben nicht immer Kristalle in verschiedenen Chips, oder zeitweise in verschiedenen Brunnen innerhalb der gleichen Chip. Dies bedeutet, dass alle Faktoren, die die Kristall Keimbildung und Wachstum sorgfältig, wie Mutter Alkohol Zusammensetzung oder Kristallisation Kinetik (durch die Verdunstung Flugbahn) berücksichtigt werden sollte. Da größere Kristalle zu höheren Auflösung beugen, sind entsprechend große Kristalle im Idealfall gewachsen. Der Prozess der Kristall Kernbildung und Wachstum kann mit DLS Messungen folgen. Anpassung der Laserfokus innerhalb der ~ 50 µm dünnen Kristallisation Fächer des Chips können eine Herausforderung sein und erfordern sorgfältige manuelle Ausrichtung. Mithilfe von Brunnen tiefer als 100 µm war Laserausrichtung Auto machbar und verlässlich, so dass mehrere Brunnen durch automatisierte Übernahme Systeme überwacht werden können.
Polyimid-basierte x-ray Chips produzieren nur einen geringe Hintergrund und wir zeigen die Eignung dieser Geräte für Routine-x-ray Diffraction Datenerhebung durch das Lösen von Strukturen für drei Modell-Proteine. Die beste Auflösung erzielt in Chip unterschieden, im Vergleich zu vorher erreichten Auflösungen von deutlich größeren Proteinkristallen und konventionelle Röntgen-Datenerfassung. Dies kann durch mehrere Faktoren bedingt sein und weitere Kristallisation Zustand Optimierung kann weiter verbessern die Beugung. Es war möglich, Daten in Situ Beugung bis zu 1,8 Å Auflösung Anwendung Kristall mit Abmessungen kleiner als 30 µm. Die detaillierte Analyse der Thaumatin Beugung Daten lieferte Einblicke über Strahlenschäden. Um das Ausmaß der Schäden zu begrenzen, sollte nur ein einziger Kristall pro Fach in das Gerät mikrofluidischen ausgesetzt werden, da die Diffusion von radikalen und in benachbarten Kristalle auftreten kann. Um die Geschwindigkeit der Datenerfassung zu verbessern, sollte dies in Zukunft automatisiert werden.
Kristall-Morphologie kann in einigen Fällen eine bevorzugte Ausrichtung auftreten. Dies war z. B. der Fall mit dem Dataset Thioredoxin wo hatte die Kristalle eine stark bevorzugte Ausrichtung bezogen auf die Chip-Fenster. Auch hier konnten wir eine vollständige Beugung Dataset sammeln. Wenn Kristalle eine bevorzugte Orientierung im Chip weisen und vor allem wenn die entsprechende Raumgruppe auch eine niedrige Symmetrie hat, dann die Vollständigkeit des Datasets werden während der Sammlung überwacht sollten so dass genügend Beugung Muster Zuckerrohr gesammelt.
Zeitaufgelöste Untersuchungen mit diesen Chips sind direkt möglich, wenn mit Hilfe von Licht Reaktionen mit einem Pumpe-Sonde-Ansatz induzierten. Polyimid-Folie-Lichtdurchlässigkeit für die Pumpe Laser muss aufgeklärt werden und alternativ optisch klar Polyimid oder COC genutzt werden. Die aktuellen mikrofluidischen Geometrien erlauben keine Substrat mischen Experimente, nachdem die Kristalle gewachsen sind. Wir erwarten jedoch, dass die beschriebenen Röntgen Chip Herstellung Protokoll auch für solche Entwürfe für beide Zeitaufgelöste Röntgenbeugung mischen sowie Streuung Ansätze19geeignet.

Zu wissen, die 3D-Struktur eines Proteins ist wichtig zu verstehen, seine Funktionalität. In der Nähe von atomarer Auflösung Strukturen ergeben sich bisher am häufigsten durch Röntgen-Kristallographie. Diese Technik setzt Proteinkristallen, Röntgenstrahlung und die daraus resultierende Beugungsmuster werden dann für die Strukturaufklärung und Verfeinerung analysiert. In herkömmlichen Röntgen-Kristallographie wird eine vollständige Beugung Dataset aus einem einzigen, im Idealfall großen Kristall bei kryogenen Temperaturen aufgezeichnet. Solche Kristalle sind jedoch meist nicht trivial zu wachsen, und geeignete Kryokonservierung Bedingungen identifizieren zu können werden selbst anspruchsvolle und kann manchmal auch dazu führen, dass Abweichungen von der native Protein-Struktur-5.
Jüngsten technologischen Fortschritte in der Röntgen-freie-Elektronen-Laser (FEL) und Synchrotron Beamlines konnten Strukturen aus kleinere Kristalle zu lösen, als neue Mikro-Fokussierung Beamlines, erhöhte Röntgen Strahlen Brillanz und verbesserte Röntgendetektoren wurde verfügbar6,7. Kleine Kristalle sind in der Regel einfacher zu wachsen als große und freie Kristalle8,9defekt. Allerdings leiden kleine Kristalle von x-ray Strahlenschäden viel schneller als große Kristalle. Dies liegt daran, im Vergleich zu einem großen Kristall, eine höhere Strahlendosis muss in ein kleineres Kristall-Volumen zu beugen, vergleichbare Auflösung projiziert werden. Deshalb sogar kryogenen Schutz oft nicht ausreichend, um eine vollständige Beugung Datensatz aus einem einzigen weiteren aufnehmen.
Um diese Hürde zu überwinden, ist die serielle Kristallographie geworden die Methode der Wahl zum Sammeln und Zusammenführen von Beugungsmuster aus vielen zufällig orientierte Mikrokristalle, ein komplettes Dataset zu erhalten. Strahlung induzierte Kristall Schaden minimiert wird durch die Verbreitung der gesamten Strahlendosis verwendet, um eine Protein-Struktur über eine hohe Anzahl von Kristallen5,10zu lösen. In einem "beugen zuvor zerstören" FEL experimentieren, jeder Kristall wird nur für eine Belichtung mit Femto-Sekunden-röntgenpulse verwendet. Mikro-Fokus Beamlines an Dritte Generation Synchrotron Quellen können wiederum serielle Kristallographie mit ein paar Millisekunden kurzen Röntgen Aufnahmen11,12,13,14durchführen. Ohne eine Kristall-Oszillation oder Drehung während der Datenerfassung, jedoch nur teilweise Bragg Reflexionen können aufgezeichnet werden und damit Zehntausende oder mehr Beugungsmuster sind in der Regel für die Bestimmung der Struktur15erforderlich. Bisher wurde für serielle Kristallographie, eine vielfältige Reihe von Beispielmethoden Lieferung als vor kurzem überprüft14,16,17,18,19. Unter denen Basis mehrere feste Ziel musterlieferung, die Strategien erfolgreich mit Kristall Drehung während der Röntgen-Aufnahmen kombiniert wurden, so dass deutlich weniger Beugungsmuster ebenso komplette Datensätze bereitstellen können, und auch verbrauchen weniger Probe im Vergleich zu klassischen seriellen Kristallographie aufgezeichnet Experimente wo Standbilder sind7,16,20,21,22,23 , 24.
Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll zur mikrofluidischen Geräte mit niedrigen röntgenhintergrund fabrizieren. Die Geräte sind aus 5-min Epoxy-Kleber mit weichen Lithographie gemustert und eignen sich für in-Situ- Röntgenbeugung Experimente bei Raumtemperatur, die von der Integration der Probenvorbereitung direkt in die Röntgen-Einrichtung, wie des Fall mit profitieren Zeitaufgelöste Untersuchungen, die mischen-induzierte Kinetik18,19folgen. Mikrofluidische Kanäle sind auf beiden Seiten mit Polymeren Polyimid-Folie, was x-ray Windows mit einer kombinierten Dicke von etwa 16 µm, die niedrige Röntgenbildgebung Hintergrund ermöglichen Lidern. Alle verwendete Materialien bieten gute Lösemittelbeständigkeit. Dieses Herstellungsverfahren ist vergleichsweise einfach und kostengünstig. Nach der Beschaffung von SU-8 master Wafer kann alle Herstellung außerhalb ein Reinraum Labor inmitten der typischen Forschung abgeschlossen werden.
Ein Anwendungsbeispiel beschreibt Chips für Goniometer feste Vorgabe serielle Kristallographie basiert. Erstens sind die Konstruktion und Fertigung Überlegungen für die Verwendung von Kapillar Ventiltechnik, Microfluidically aufteilen eine wässrige Reaktion in eine ausgewählte Anzahl von Nanoliter große Tröpfchen diskutiert. Diese Lademechanismus vermeidet Probenverlust von Toten-Lautstärke des Kanals und Aufteilung kann leicht manuell durchgeführt werden ohne Verwendung von Pumpen oder andere Ausrüstung für flüssige Betätigung. Solche isolierten Nanoliter Größe Tropfen Proteinlösung sind überwachte in Situ mit dynamische Lichtstreuung (DLS) zur Kontrolle Protein Crystal Kernbildung und Wachstum. Es wurde bereits nachgewiesen, dass in mikrofluidischen Geräte bestehend aus einem Polydimethylsiloxan (PDMS) Struktur gebunden an ein Glas Folie25,26DLS Messungen durchgeführt werden können. Denn die polyimidschicht eine hohe Transmission für Wellenlängen mehr als 550 hat nm, der Ansatz kann auf verlängert werden Messungen in x-ray transparente Chips als auch bei der Verwendung einer geeigneten Laser Wellenlänge27,28. Basierend auf den Ergebnissen der DLS, anfängliche Keimbildung kann beobachtet werden, und weitere Tropfen verdampfen kann gestoppt werden, um weniger, aber größeren Proteinkristallen zu erhalten.
Nachdem genügend Kristalle gezüchtet werden, können komplette x-ray Diffraction Datasets dann mit Goniometer basiert in Situ korrigiert Ziel serielle Röntgenkristallographie bei Raumtemperatur gesammelt werden. Beugung Datasets werden mit einer Suite von Software-Tools und Skripte um zu lösen die Proteinstruktur Kristall verarbeitet. Diese Technik vermeidet Artefakte oft induzierte während der Kryokonservierung in konventionellen Kristallographie Experimente verwendet.
Wir vergleichen drei Protein Zielstrukturen, die gelöst wurden mit etwa 10-20 µm kleinen Kristalle im Chip besser als 2 Å Auflösung gewachsen. Durch Kristallisation und interferenzgitters in Situ, Handling und somit mechanische Störungen des fragilen Kristalle wird minimiert. Dieses Protokoll kann für Proteinkristallen die beugen auf hoher Auflösung als auch niedriger Auflösung (1.7 Å bis 3.0 Å) angewendet werden. Wie fast jeder Kristall für Beugung verwendet werden kann, wird wenig Probe verschwendet, so dass dies eine sehr effiziente Kristall Übermittlungsmethode.
Dieses Protokoll enthält eine detaillierte Anleitung zum Röntgen transparent mikrofluidischen Chips für in Situ Protein Kristallisation und Beugung Datenerfassung vorbereiten. Das Verfahren wurde sorgfältig von mikrofluidischen Präzision profitieren ohne hoch entwickelte Ausrüstung im Labor entwickelt. Auch kann Datenerhebung auf das Synchrotron-Strahlrohr durchgeführt werden ohne spezielle Goniometer oder Luftbefeuchter zu erleichtern, die Ergebnisse zu reproduzieren von nicht-Experten. Die vorgestellte Technik kann serielle Millisekunde Kristallographie Datenerhebung bei Raumtemperatur unter Beibehaltung der Strahlenschäden minimal und ohne Stress zu den Kristallen nach Wachstum Cryo-Schutz oder Kristall Behandlung beantragt werden. Daher eignet sich das beschriebene Verfahren für jedes Protein-Kristallisation-Projekt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 Series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3000</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Plus Schnellfest 5 min</td>
			<td>Epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton foil</td>
			<td>Dupont/ American Durafilm</td>
			<td>HN grade, gauge 30 (7.5 &#956;m)</td>
			<td>polyimide foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440167</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Cytop fluoropolymer coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Cytop fluoro-solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fluorinated oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk Inc.</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>Uni-core 0.75 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo mask</td>
			<td>JD Photo Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma machine</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Isomerase</td>
			<td>Hamton Research</td>
			<td>HR7-102</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tartrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106664</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763.2</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1064060250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CSS-389</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroLight600</td>
			<td>XtalConcepts</td>
			<td></td>
			<td>DLS Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td>
			<td>Bioblock/05</td>
			<td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1ml Luer-Lock Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>Terumo Agani Needle</td>
			<td>AN*2716R1</td>
			<td>27Gx5/8&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Dieses Protokoll beschreibt Herstellung mikrofluidischen Geräte mit niedrigen röntgenhintergrund optimiert für Goniometer feste Vorgabe serielle Kristallographie basiert. Die Geräte sind aus Epoxy-Kleber mit weichen Lithographie gemustert und eignen sich für in Situ Röntgenbeugung Experimente bei Raumtemperatur. Die Probe-Brunnen sind auf beiden Seiten mit Polymeren Polyimid-Folie Windows Lidern, die Beugung Datenerfassung mit niedrigen röntgenhintergrund ermöglichen. Dieses Herstellungsverfahren ist anspruchslos und preiswert. Nach der Beschaffung eines SU-8 master Wafers kann alle außerhalb ein Reinraum in einer typischen Research Lab-Umgebung abgeschlossen werden. Das Chip-Design und Fertigung-Protokoll nutzen Kapillare Ventiltechnik, Microfluidically eine wässrige Reaktion in definierten Nanoliter große Tröpfchen aufgeteilt. Diese Lademechanismus vermeidet Probenverlust aus Kanal tot-Volumen und kann leicht manuell ohne Verwendung von Pumpen oder andere Ausrüstung für flüssige Betätigung durchgeführt werden. Wir beschreiben, wie isolierte Nanoliter Größe Tropfen Proteinlösung überwachten in Situ durch dynamisches Licht Kontrolle Protein Crystal Kernbildung und Wachstum Streuung kann. Nach geeigneten Kristalle gezüchtet werden, können komplette x-ray Diffraction Datasets mit Goniometer basiert in Situ korrigiert Ziel serielle Röntgenkristallographie bei Raumtemperatur gesammelt werden. Das Protokoll enthält benutzerdefinierte Skripts um Beugung Datasets mit einer Suite von Software-Tools zu lösen und verfeinern die Proteinstruktur Kristall zu verarbeiten. Dieser Ansatz vermeidet die Artefakte, die möglicherweise während der Kryokonservierung oder manuelle Handhabung in konventionellen Kristallographie Experimente Kristall induziert. Wir zeigen und vergleichen Sie drei Proteinstrukturen, die gelöst wurden mit kleinen Kristallen mit Abmessungen von ca. 10-20 µm in Chip gewachsen. Durch Kristallisation und interferenzgitters in Situ, Handling und somit mechanische Störungen des fragilen Kristalle wird minimiert. Das Protokoll beschreibt, wie Sie einen benutzerdefinierten Röntgen transparent mikrofluidischen Chip geeignet für in Situ serielle Kristallographie zu fabrizieren. Da fast jeder Kristall zur Beugung Datenerfassung eingesetzt werden kann, sind diese mikrofluidischen Chips eine sehr effiziente Kristall Übermittlungsmethode.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Dieses Protokoll beschreibt im Detail wie fabrizieren und mikrofluidischen Geräte zur Röntgenbeugung Datenerfassung bei Raumtemperatur betrieben. Darüber hinaus beschreibt die Kristallisation von Proteinen durch dynamische Lichtstreuung zu überwachen und Informationen zum Verarbeiten und analysieren erhalten Beugung Daten.

Mikrofluidische Chips für In Situ Crystal-Röntgenbeugung und In Situ dynamische Lichtstreuung für serielle Kristallographie

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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Vorbereitung adhärenter Zellen für die Röntgenfluoreszenzbildgebung durch chemische Fixierung

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

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Chemie

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