Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00
Duration: 11 min 48 s
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यह काम घाट बीज कोष PIF-2015-46, BMBF अनुदान 05K16GUA और 05K12GU3 द्वारा समर्थित किया गया था, और ' हैंबर्ग सेंटर फॉर Ultrafast इमेजिंग – संरचना, गतिशीलता और मामले की परमाणु पैमाने पर नियंत्रण ड्यूश के उत्कृष्टता समूह ' Forschungsgemeinschaft (DFG) । मुक्त-इलेक्ट्रॉनक लेसर विज्ञान के लिए केंद्र से संबद्ध लेखकों का कार्य कार्यक्रम मूलक निधियों के माध्यम से Helmholtz संघ द्वारा वित्त पोषित किया गया. सिंक्रोट्रॉन एमएक्स डेटा beamline P14 में पेट्रा III भंडारण अंगूठी पर EMBL हैम्बर्ग द्वारा संचालित (DESY, हैम्बर्ग, जर्मनी) में एकत्र किया गया था.

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	<li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K.">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li><li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. 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लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

हम खिड़की सामग्री के रूप में सामग्री और polyimide पंनी भरने के रूप में epoxy राल patterning द्वारा सीटू एक्स-रे विवर्तन में के लिए microfluidic उपकरणों बनाना । हमारी प्रक्रिया पिछले एक्स-रे चिप डिजाइन16,21पर निर्माण की प्रक्रिया के विभिंन कदम अनुकूलित । हम खिड़की मोटाई कम है और इस तरह की पृष्ठभूमि तितर बितर जबकि भी कम प्रक्रिया कदम के रूप में निर्माण सहजता की आवश्यकता है । वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर सीटू में क्रिस्टलीकरण पर्याप्त लाभ है. यह कमरे के तापमान पर विवर्तन डेटा संग्रह की अनुमति देता है और इस तरह क्रायो संरक्षण, जो कुछ मामलों में प्रोटीन संरचना में कलाकृतियों शुरू करने का खतरा होता है की जरूरत शामिल नहीं है । इसके अलावा, क्रिस्टल शारीरिक तनाव के अधीन नहीं हैं, क्योंकि उनके पैतृक पर्यावरण से क्रिस्टल के हस्तांतरण से बचा जा सकता है । इस प्रक्रिया के माध्यम से, क्रिस्टल अपने उच्चतम गुणवत्ता बनाए रखने और किसी भी इलाज से पीड़ित नहीं है ।
हमारे अनुभव में, प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम क्रिस्टलीकरण प्रक्रिया को नियंत्रित करने के आसपास घूमती है । उचित आयामों के साथ एक्स-रे उपयुक्त क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए मापदंडों की पहचान की empirically की जरूरत है और वाष्प प्रसार प्रयोगों से सीधे नहीं लिया जा सकता है. प्रोटीन और precipitant के समान सांद्रता का प्रयोग हमेशा अलग चिप्स, या एक ही चिप के भीतर विभिंन कुओं में समय में क्रिस्टल में परिणाम नहीं था । यह इंगित करता है कि क्रिस्टल nucleation और विकास को प्रभावित करने वाले सभी कारकों को ध्यान से माना जाना चाहिए, जैसे मां शराब संरचना या क्रिस्टलीकरण कैनेटीक्स (वाष्पीकरण पथ के माध्यम से) । के रूप में बड़े क्रिस्टल उच्च संकल्प को diffract, उपयुक्त बड़े क्रिस्टल आदर्श हो रहे हैं । क्रिस्टल nucleation और विकास की प्रक्रिया DLS माप के साथ पालन किया जा सकता है । के अंदर लेजर ध्यान समायोजित ~ ५० µm चिप के पतले क्रिस्टलीकरण डिब्बों चुनौतीपूर्ण हो सकता है और सावधान मैनुअल संरेखण की आवश्यकता हो सकती है । १०० µm से अधिक गहरे कुओं का उपयोग करके, लेजर ऑटो संरेखण व्यवहार्य और विश्वसनीय था, ऐसी है कि कई कुओं स्वचालित अधिग्रहण योजनाओं के माध्यम से निगरानी की जा सकती है ।
polyimide आधारित एक्स-रे चिप्स केवल एक कम पृष्ठभूमि का उत्पादन और हम तीन मॉडल प्रोटीन के लिए संरचनाओं को हल करके नियमित एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के लिए इन उपकरणों की उपयुक्तता का प्रदर्शन । सबसे अच्छा चिप में प्राप्त संकल्प अलग, पहले से हासिल संकल्प के साथ तुलना में, काफी बड़ा प्रोटीन क्रिस्टल और पारंपरिक एक्स-रे डेटा संग्रह से । यह कई कारकों के कारण हो सकता है और आगे क्रिस्टलीकरण हालत अनुकूलन आगे विवर्तन में सुधार हो सकता है । यह 30 µm से छोटे आयामों के साथ क्रिस्टल लागू करने १.८ Å संकल्प के लिए सीटू विवर्तन डेटा में इकट्ठा करने के लिए संभव था. thaumatin विवर्तन डेटा का विस्तृत विश्लेषण विकिरण क्षति के बारे में अंतर्दृष्टि प्रदान की है । विकिरण क्षति के विस्तार को सीमित करने के लिए, केवल एक एकल क्रिस्टल microfluidic डिवाइस में डिब्बे के प्रति उजागर किया जाना चाहिए, के रूप में और पड़ोसी क्रिस्टल में कण के प्रसार हो सकता है । डेटा संग्रह की गति में सुधार करने के लिए, यह भविष्य में स्वचालित होना चाहिए ।
क्रिस्टल आकृति विज्ञान के कारण, कुछ मामलों में एक पसंदीदा अभिविन्यास हो सकता है. इस उदाहरण के लिए thioredoxin डेटासेट, जहां क्रिस्टल एक जोरदार पसंदीदा चिप खिड़कियों के सापेक्ष अभिविंयास था के साथ मामला था । यहां भी, हम एक पूरा विवर्तन डेटासेट एकत्र सकता है । यदि क्रिस्टल चिप में एक पसंदीदा अभिविन्यास प्रदर्शन और विशेष रूप से अगर इसी अंतरिक्ष समूह भी एक कम समरूपता है, तो डेटासेट की संपूर्णता संग्रह के दौरान निगरानी की जानी चाहिए ऐसी है कि पर्याप्त विवर्तन पैटर्न बेंत हो एकत्र.
समय-हल इन चिप्स का उपयोग कर अध्ययन सीधे संभव है जब एक पंप जांच दृष्टिकोण के साथ प्रकाश प्रेरित प्रतिक्रियाओं का उपयोग कर रहे हैं । पंप लेजर के लिए polyimide पंनी प्रकाश संचरण का आविर्भाव और वैकल्पिक रूप से, ऑप्टिकली रूप से स्पष्ट polyimide या कॉक इस्तेमाल किया जा सकता है की जरूरत है । वर्तमान microfluidic geometries सब्सट्रेट मिश्रण के बाद क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं के लिए अनुमति नहीं देते. हालांकि, हम वर्णित एक्स-रे चिप निर्माण प्रोटोकॉल भी दोनों समय के लिए इस तरह के मिश्रण डिजाइन के लिए उपयुक्त हो-हल एक्स-रे विवर्तन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तितर बितर दृष्टिकोण19की उंमीद ।

एक प्रोटीन की 3d संरचना जानने के लिए अपनी कार्यक्षमता को समझने के लिए आवश्यक है । पास-परमाणु संकल्प संरचनाओं अब तक सबसे अधिक एक्स-रे क्रि द्वारा प्राप्त कर रहे हैं । इस तकनीक का एक्स-रे विकिरण के लिए प्रोटीन क्रिस्टल का पर्दाफाश और जिसके परिणामस्वरूप विवर्तन पैटर्न तो संरचना निर्धारण और शोधन के लिए विश्लेषण कर रहे हैं । पारंपरिक एक्स-रे क्रि में, एक पूर्ण विवर्तन डेटासेट एक एकल, आदर्श बड़े, क्रायोजेनिक तापमान पर क्रिस्टल से दर्ज किया गया है । इस तरह के क्रिस्टल, तथापि, ज्यादातर तुच्छ नहीं हो जाना, और उपयुक्त क्रायो-संरक्षण की स्थिति की पहचान के लिए अपने आप में चुनौतीपूर्ण हो सकता है और कई बार देशी प्रोटीन संरचना से भी विचलन का कारण हो सकता है5.
एक्स-रे मुक्त इलेक्ट्रॉन लेजर (FEL) और सिंक्रोट्रॉन beamlines में हाल ही में तकनीकी विकास के छोटे क्रिस्टल से संरचनाओं को हल करने की अनुमति दी है, के रूप में नए सूक्ष्म beamlines ध्यान केंद्रित, एक्स-रे बीम प्रतिभा में वृद्धि हुई है, और बेहतर एक्स-रे डिटेक्टरों बन गया उपलब्ध6,7. आमतौर पर, छोटे क्रिस्टल बड़े और दोष मुक्त क्रिस्टल8,9से बढ़ने के लिए आसान कर रहे हैं । हालांकि, छोटे क्रिस्टल बहुत तेजी से बड़े क्रिस्टल से एक्स-रे विकिरण नुकसान से ग्रस्त हैं । यह है क्योंकि एक बड़े क्रिस्टल की तुलना में, एक उच्च एक्स-रे खुराक एक छोटे क्रिस्टल मात्रा में पेश किया जाना चाहिए तुलनीय संकल्प को diffract. इसलिए, भी क्रायोजेनिक सुरक्षा अक्सर एक पूर्ण विवर्तन डेटा एक एकल microcrystal से सेट रिकॉर्ड करने के लिए पर्याप्त नहीं है ।
इस बाधा को दूर करने के लिए, सीरियल क्रि एक पूर्ण डेटासेट प्राप्त करने के लिए कई बेतरतीब ढंग से उन्मुख microcrystals से विवर्तन पैटर्न इकट्ठा करने और विलय करने के लिए विकल्प की विधि बन गया है. विकिरण प्रेरित क्रिस्टल क्षति कुल एक्स-रे के लिए क्रिस्टल की एक उच्च संख्या में एक प्रोटीन संरचना को हल करने के लिए इस्तेमाल किया खुराक5,10फैलाने से कम है । FEL प्रयोग को नष्ट करने से पहले एक ' diffract में, प्रत्येक क्रिस्टल केवल femto-दूसरा एक्स-रे दालों का उपयोग कर एक जोखिम के लिए प्रयोग किया जाता है । माइक्रो-फोकस beamlines में तीसरी पीढ़ी सिंक्रोट्रॉन सूत्रों के बदले में कुछ मिलीसेकंड लघु एक्स-रे जोखिम11,12,13,14के साथ धारावाहिक क्रि प्रदर्शन कर सकते हैं । एक क्रिस्टल दोलन या डेटा संग्रह के दौरान रोटेशन के बिना, तथापि, केवल आंशिक डींग प्रतिबिंब और दर्ज किया जा सकता है इसलिए हजारों या अधिक विवर्तन पैटर्न के दसियों आम तौर पर संरचना निर्धारण15के लिए आवश्यक हैं । तारीख करने के लिए, नमूना वितरण विधियों के एक विविध सेट सीरियल क्रि के लिए विकसित किया गया है, के रूप में हाल ही में14,16,17,18,19की समीक्षा की । उन लोगों के बीच में, कई निश्चित-लक्ष्य आधारित नमूना वितरण रणनीतियों सफलतापूर्वक एक्स के दौरान क्रिस्टल रोटेशन के साथ संयुक्त-रे जोखिम इस तरह के काफी कम विवर्तन पैटर्न समान रूप से पूरा डेटासेट प्रदान कर सकते हैं, जबकि भी कम खपत नमूना शास्त्रीय धारावाहिक क्रि प्रयोगों की तुलना में जहां अभी भी छवियों दर्ज कर रहे हैं7,16,20,21,22,23 , 24.
हम कम एक्स-रे पृष्ठभूमि के साथ microfluidic उपकरणों के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । उपकरणों 5-ंयूनतम epoxy गोंद से नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर नमूनों रहे है और के लिए उपयुक्त है -सीटू एक्स-रे कमरे के तापमान पर विवर्तन प्रयोगों है कि सीधे एक्स-रे सेट अप में नमूना तैयारी को एकीकृत करने से लाभ, के रूप में मामले के साथ समय-हल अध्ययन है कि मिश्रण प्रेरित कैनेटीक्स18,19का पालन करें । Microfluidic चैनल के बारे में 16 µm कि कम एक्स-रे पृष्ठभूमि इमेजिंग के लिए अनुमति के एक संयुक्त मोटाई के साथ एक्स-रे खिड़कियों में जिसके परिणामस्वरूप, बहुलक polyimide पंनी के साथ दोनों पक्षों पर lidded हैं । सभी प्रयुक्त सामग्री अच्छा विलायक प्रतिरोध प्रदान करते हैं । इस निर्माण विधि तुलनात्मक सरल और सस्ती है । एक एसयू-8 मास्टर वेफर की सोर्सिंग के बाद, सभी निर्माण एक ठेठ अनुसंधान प्रयोगशाला की स्थापना में एक cleanroom के बाहर पूरा किया जा सकता है ।
एक आवेदन उदाहरण में, हम goniometer आधारित निश्चित लक्ष्य धारावाहिक क्रि के लिए चिप्स का वर्णन । सबसे पहले, nanoliter आकार की बूंदों की एक चयनित संख्या में एक जलीय प्रतिक्रिया विभाजित microfluidically करने के लिए केशिका valving का उपयोग करने के लिए डिजाइन और निर्माण विचार चर्चा की जाती है । इस लदान तंत्र चैनल मृत से नमूना हानि से बचा जाता है मात्रा और विभाजन आसानी से मैंयुअल रूप से पंप या द्रव actuation के लिए अंय उपकरणों का उपयोग कर के बिना किया जा सकता है । प्रोटीन सॉल्यूशन की ऐसी पृथक nanoliter आकार की बूंदों को प्रोटीन क्रिस्टल nucleation और विकास को नियंत्रित करने के लिए डायनामिक लाइट कैटरिंग (DLS) का उपयोग करते हुए सीटू में मॉनिटर कर रहे हैं । यह पहले से प्रदर्शित किया गया है कि DLS माप microfluidic उपकरणों में एक polydimethylsiloxane (PDMS) एक गिलास स्लाइड25,26के लिए बंधुआ संरचना से मिलकर किया जा सकता है । polyimide परत ५५० एनएम से अधिक तरंग दैर्ध्य के लिए एक उच्च संचरण है क्योंकि, दृष्टिकोण एक उपयुक्त लेजर तरंग दैर्ध्य27,28का उपयोग करते समय के रूप में अच्छी तरह से, एक्स-रे पारदर्शी चिप्स में माप करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । DLS परिणामों के आधार पर, प्रारंभिक nucleation मनाया जा सकता है, और आगे छोटी बूंद वाष्पीकरण कम लेकिन बड़ा प्रोटीन क्रिस्टल प्राप्त करने के लिए रोका जा सकता है ।
पर्याप्त क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं के बाद, पूरा एक्स-रे विवर्तन डेटासेट तो कमरे के तापमान पर सीटू तय लक्ष्य सीरियल एक्स-रे क्रि में आधारित goniometer का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है. विवर्तन डेटासेट प्रोटीन क्रिस्टल संरचना को हल करने के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण और कस्टम लिपियों के एक सुइट का उपयोग कर संसाधित कर रहे हैं । इस तकनीक अक्सर क्रायो-पारंपरिक क्रि प्रयोगों में इस्तेमाल संरक्षण के दौरान प्रेरित कलाकृतियों से बचा जाता है ।
हम तीन प्रोटीन लक्ष्य संरचनाओं कि के बारे में 10-20 µm छोटे चिप में विकसित करने के लिए बेहतर तो 2 Å संकल्प क्रिस्टल का उपयोग कर हल थे तुलना करें । सीटू मेंसघन और diffracting द्वारा, हैंडलिंग और इसलिए नाजुक क्रिस्टल के यांत्रिक गड़बड़ी कम है । इस प्रोटोकॉल प्रोटीन क्रिस्टल जो उच्च संकल्प के साथ ही कम संकल्प (१.७ å करने के लिए ३.० å) diffract के लिए लागू किया जा सकता है । के रूप में लगभग हर क्रिस्टल विवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, थोड़ा नमूना व्यर्थ है, यह एक बहुत ही कुशल क्रिस्टल वितरण विधि बना ।
यह प्रोटोकॉल कैसे सीटू प्रोटीन क्रिस्टलीकरण और विवर्तन डेटा संग्रह में के लिए एक्स-रे पारदर्शी microfluidic चिप्स तैयार करने के लिए पर एक विस्तृत गाइड प्रदान करता है । प्रक्रिया ध्यान से प्रयोगशाला में परिष्कृत उपकरणों की आवश्यकता के बिना microfluidic परिशुद्धता से लाभ के लिए डिज़ाइन किया गया था । इसके अलावा, सिंक्रोट्रॉन beamline पर डेटा संग्रह एक विशेष goniometer या humidifier गैर विशेषज्ञों द्वारा परिणाम reproducing आसानी के लिए आवश्यकता के बिना किया जा सकता है । प्रस्तुत तकनीक के कमरे में धारावाहिक मिलीसेकंड क्रि डेटा संग्रह के लिए लागू किया जा सकता है, जबकि विकिरण नुकसान कम रखते हुए और क्रायो-सुरक्षा या क्रिस्टल हैंडलिंग द्वारा विकास के बाद क्रिस्टल को तनाव शुरू करने के बिना तापमान । इसलिए, वर्णित विधि किसी भी प्रोटीन क्रिस्टलीकरण परियोजना के लिए उपयुक्त है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 Series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3000</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Plus Schnellfest 5 min</td>
			<td>Epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton foil</td>
			<td>Dupont/ American Durafilm</td>
			<td>HN grade, gauge 30 (7.5 &#956;m)</td>
			<td>polyimide foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440167</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Cytop fluoropolymer coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Cytop fluoro-solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fluorinated oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk Inc.</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>Uni-core 0.75 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo mask</td>
			<td>JD Photo Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma machine</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Isomerase</td>
			<td>Hamton Research</td>
			<td>HR7-102</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tartrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106664</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763.2</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1064060250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CSS-389</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroLight600</td>
			<td>XtalConcepts</td>
			<td></td>
			<td>DLS Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td>
			<td>Bioblock/05</td>
			<td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1ml Luer-Lock Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>Terumo Agani Needle</td>
			<td>AN*2716R1</td>
			<td>27Gx5/8&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

इस प्रोटोकॉल कम एक्स-रे पृष्ठभूमि के साथ microfluidic उपकरणों के निर्माण का वर्णन goniometer के लिए अनुकूलित निर्धारित लक्ष्य धारावाहिक क्रि आधारित है । उपकरणों के नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर epoxy गोंद से नमूनों और कमरे के तापमान पर सीटू एक्स-रे विवर्तन प्रयोगों में के लिए उपयुक्त हैं । नमूना कुओं बहुलक polyimide पंनी खिड़कियां है कि कम एक्स-रे पृष्ठभूमि के साथ विवर्तन डेटा संग्रह की अनुमति के साथ दोनों पक्षों पर lidded हैं । इस निर्माण विधि इनपर और सस्ती है । एक एसयू-8 मास्टर वेफर की सोर्सिंग के बाद, सभी निर्माण एक ठेठ अनुसंधान प्रयोगशाला वातावरण में एक cleanroom के बाहर पूरा किया जा सकता है । चिप डिजाइन और निर्माण प्रोटोकॉल केशिका valving का उपयोग करने के लिए परिभाषित nanoliter आकार बूंदों में एक जलीय प्रतिक्रिया विभाजित microfluidically । इस लोडिंग तंत्र चैनल मृत मात्रा से नमूना नुकसान से बचा जाता है और आसानी से पंप या द्रव actuation के लिए अंय उपकरणों का उपयोग कर के बिना मैंयुअल रूप से किया जा सकता है । हम वर्णन कैसे पृथक nanoliter प्रोटीन समाधान के आकार बूंदों सीटू में गतिशील प्रकाश कैटरिंग द्वारा प्रोटीन क्रिस्टल nucleation और विकास को नियंत्रित करने के लिए निगरानी की जा सकती है । उपयुक्त क्रिस्टल बड़े हो रहे हैं के बाद, पूरा एक्स-रे विवर्तन डेटासेट कमरे के तापमान पर सीटू तय लक्ष्य सीरियल एक्स-रे क्रि में आधारित goniometer का उपयोग कर एकत्र किया जा सकता है. प्रोटोकॉल को हल करने और प्रोटीन क्रिस्टल संरचना को परिष्कृत करने के लिए सॉफ्टवेयर उपकरण का एक सूट का उपयोग विवर्तन डेटासेट प्रक्रिया करने के लिए कस्टम लिपियों प्रदान करता है । इस दृष्टिकोण संभवतः क्रायो के दौरान प्रेरित कलाकृतियों संरक्षण या मैनुअल पारंपरिक क्रि प्रयोगों में क्रिस्टल हैंडलिंग से बचा जाता है । हम वर्तमान और तीन प्रोटीन संरचनाओं कि लगभग 10-20 चिप में उगाया µm के आयामों के साथ छोटे क्रिस्टल का उपयोग कर हल कर रहे थे तुलना करें । सीटू मेंसघन और diffracting द्वारा, हैंडलिंग और इसलिए नाजुक क्रिस्टल के यांत्रिक गड़बड़ी कम है । प्रोटोकॉल विवरण कैसे एक कस्टम एक्स-रे पारदर्शी microfluidic चिप के लिए उपयुक्त बनाना करने के लिए सीटू धारावाहिक क्रि में । के रूप में लगभग हर क्रिस्टल विवर्तन डेटा संग्रह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, इन microfluidic चिप्स एक बहुत ही कुशल क्रिस्टल वितरण पद्धति हैं ।

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

इस प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन कैसे बनाना है और कमरे के तापमान पर एक्स-रे विवर्तन डेटा संग्रह के लिए microfluidic उपकरणों का संचालन । इसके अतिरिक्त, यह गतिशील प्रकाश बिखरने और कैसे प्रक्रिया और विश्लेषण प्राप्त विवर्तन डेटा द्वारा प्रोटीन क्रिस्टलीकरण की निगरानी करने के लिए कैसे का वर्णन करता है ।

सीटू के क्रिस्टल एक्स-रे विवर्तन में और सीरियल क्रि के लिए सीटू डायनामिक लाइट कैटरिंग में Microfluidic चिप्स

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

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