Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto dal fondo di seme PIER PIF-2015-46, BMBF concede a 05K16GUA, 05K12GU3 e il cluster di eccellenza 'Il centro di Amburgo per Imaging ultraveloce – struttura, dinamica e controllo della materia su scala atomica' della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Il lavoro degli autori affiliato con il centro per Free Electron Laser Science è stato finanziato dall'Associazione Helmholtz attraverso fondi del programma orientato. Il sincrotrone MX sono stati raccolti presso beamline P14 operati da EMBL Hamburg presso l'anello PETRA III (DESY, Amburgo, Germania).

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Noi fabbricare dispositivi microfluidici per in situ diffrazione dei raggi x di patterning resina epossidica come pellicola di polyimide e materiale come materiale della finestra di riempimento. La nostra procedura ottimizzato vari passaggi del processo di fabbricazione sul precedente raggi x chip disegni16,21. Abbiamo ridotto lo spessore della finestra e quindi lo sfondo dispersione mentre anche fabbricazione di interpolazione come meno passaggi di processo sono necessari. cristallizzazione in situ utilizzando il protocollo descritto ha notevoli benefici. Esso consente la raccolta dei dati di diffrazione a temperatura ambiente ed esclude pertanto la necessità della protezione di cryo, che in alcuni casi contiene il rischio di introdurre artefatti nella struttura della proteina. Inoltre, i cristalli non sono soggette a stress fisico, perché il trasferimento dei cristalli dal loro ambiente nativo può essere evitato. Attraverso questa procedura, i cristalli di mantengono la loro qualità più alta e non soffrono di alcun trattamento.
Nella nostra esperienza, le fasi più critiche all'interno del protocollo ruotano intorno a controllare il processo di cristallizzazione. I parametri per ottenere cristalli adatti ai raggi x con dimensioni appropriate devono essere identificati empiricamente e non possono essere preso direttamente da esperimenti di diffusione del vapore. Utilizzando identiche concentrazioni di proteina e precipitante non ha sempre provocato in cristalli in diversi chip, o a volte in diversi pozzi all'interno del chip stesso. Ciò indica che tutti i fattori che influenzano la crescita e la nucleazione del cristallo dovrebbero essere considerati con attenzione, come la cinetica di composizione o cristallizzazione dei liquori di madre (attraverso la traiettoria di evaporazione). Come più grandi cristalli diffrangono a risoluzione più alta, opportunamente grandi cristalli idealmente sono coltivate. Il processo di nucleazione del cristallo e crescita può essere seguito con misurazioni di liste di distribuzione. Regolare il fuoco del laser all'interno del µm ~ 50 scomparti sottile cristallizzazione del chip possono essere impegnativi e possono richiedere attento allineamento manuale. Utilizzando pozzi più profondi rispetto a 100 µm, auto-allineamento laser era fattibile e affidabile, tale che pozzi multipli possono essere monitorati attraverso sistemi di acquisizione automatica.
I chip di raggi x di polyimide basato producono solo un basso fondo e dimostriamo l'idoneità di questi dispositivi per la raccolta dei dati di diffrazione di raggi x di routine risolvendo strutture per tre proteine modello. La migliore risoluzione ottenuta nel chip ha differito, confrontato con risoluzioni precedentemente raggiunti, dalla raccolta di dati di raggi x convenzionale e significativamente più grandi cristalli della proteina. Questo potrebbe essere dovuto a diversi fattori e ulteriore ottimizzazione di condizione di cristallizzazione può migliorare ulteriormente la diffrazione. È stato possibile raccogliere dati di diffrazione in situ fino a 1,8 risoluzione Å applicando cristallo con dimensioni inferiori a 30 µm. L'analisi dettagliata dei dati di diffrazione taumatina fornito le comprensioni circa danno da radiazione. Per limitare il danno da radiazione di estendere, solo un singolo cristallo deve essere esposto per vano nel dispositivo microfluidico, come la diffusione dei radicali e in cristalli vicini può verificarsi. Per migliorare la velocità di raccolta dei dati, questo deve essere automatizzato in futuro.
A causa della morfologia del cristallo, in alcuni casi può verificarsi un orientamento preferito. Questo era per esempio il caso con il dataset di thioredoxin, dove i cristalli hanno avuto un orientamento decisamente da preferire rispetto le finestre di chip. Anche qui, abbiamo potuto raccogliere un set di dati di diffrazione completa. Se cristalli presentano un orientamento preferito nel chip e in particolare se il corrispondente gruppo di spazio ha anche una simmetria bassa, quindi la completezza del dataset deve essere monitorata durante la raccolta tale da essere sufficiente canna di reticoli di diffrazione raccolti.
Studi di tempo-risolta utilizzando questi chip sono direttamente possibili quando usando la luce indotto reazioni con un approccio di pompa-sonda. La trasmissione della luce pellicola di polyimide per il laser di pompa deve essere chiarita e in alternativa, otticamente chiaro polyimide o COC potrebbero essere utilizzati. Le geometrie di microfluidica corrente non consentono per miscelazione esperimenti dopo i cristalli sono cresciuti del substrato. Tuttavia, ci aspettiamo che il protocollo di fabbricazione dei chip di raggi x descritto anche essere adatto per tali disegni per entrambi diffrazione di raggi x risolta in tempo di miscelazione, nonché approcci19di scattering.

Conoscere la struttura 3D di una proteina è essenziale per capire la sua funzionalità. Strutture di risoluzione vicino-atomica finora sono più comunemente ottenuti dalla cristallografia a raggi x. Questa tecnica espone cristalli della proteina di radiazione a raggi x e i modelli di diffrazione risultanti vengono poi analizzati per raffinatezza e determinazione della struttura. In cristallografia a raggi x tradizionali, un set di dati di diffrazione completa è registrata da un cristallo singolo, idealmente grande, alle temperature criogeniche. Tali cristalli, tuttavia, per lo più non sono banali a crescere, e per identificare condizioni di crioconservazione adatto può diventare impegnativo in sé e a volte anche causare deviazioni dalla struttura della proteina nativa5.
I recenti progressi tecnologici in laser a elettroni liberi a raggi x (FEL) e sincrotrone beamlines hanno permesso di risolvere strutture da cristalli più piccoli, come nuovo beamlines micro-messa a fuoco, brillantezza del fascio di raggi x aumentato e migliorati rivelatori di raggi x è diventato disponibili6,7. In genere, piccoli cristalli sono più facili a crescere più grande e gratuito cristalli8,9il difetto. Tuttavia, piccoli cristalli soffrono di danni di radiazione di raggi x molto più veloci di cristalli di grandi dimensioni. Questo perché rispetto ad un grande cristallo, una dose elevata di raggi x deve essere proiettata in un più piccolo volume di cristallo a diffrangono risoluzione paragonabile. Di conseguenza, anche criogenico protezione spesso non è sufficiente per registrare un set di dati di diffrazione completa da un singolo microcrystal.
Per superare questo ostacolo, cristallografia seriale è diventato il metodo di scelta per raccogliere e unire i pattern di diffrazione da molti microcristalli orientati casualmente per ottenere un set di dati completo. Radiazione sono ridotta a icona di cristallo indotto danni diffondendo la dose totale di raggi x utilizzati per risolvere una struttura proteica sopra un alto numero di cristalli5,10. In un ' diffrangono prima distruggere ' esperimento di FEL, ogni cristallo viene utilizzato solo per un'esposizione usando gli impulsi di raggi x di femto secondi. A sua volta, micro-focus beamlines presso sincrotroni di terza generazione in grado di eseguire seriale cristallografia con qualche millisecondo breve raggi x CVE11,12,13,14. Senza un cristallo oscillazione o rotazione durante la raccolta dati, tuttavia, possono essere registrati solo parziale riflessioni di Bragg e quindi decine di migliaia o più modelli di diffrazione sono in genere necessari per la determinazione di struttura15. Ad oggi, un insieme diversificato di metodi di consegna del campione è stato sviluppato per la cristallografia di seriale, come recentemente rivisto14,16,17,18,19. Tra quelli, diversi bersaglio fisso basato su strategie con successo sono state combinate con rotazione di cristallo durante le esposizioni ai raggi x tale che significativamente meno motivi di diffrazione possono fornire ugualmente completa di set di dati, anche consumando meno di consegna del campione campione rispetto alla classica seriale cristallografia esperimenti cui sono ancora le immagini registrate7,16,20,21,22,23 , 24.
Vi presentiamo un protocollo per fabbricare dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa dei raggi x. I dispositivi vengono campiti da colla a resina epossidica 5 min mediante litografia soft e sono adatti per gli esperimenti di diffrazione di raggi x in situ a temperatura ambiente che beneficiano di integrare la preparazione dei campioni direttamente in set-up di raggi x, come nel caso di risolta in tempo gli studi che seguono cinetica indotta da miscelazione18,19. Canali microfluidici sono con coperchio su entrambi i lati con un foglio di poliimmide polimerici, conseguente windows di raggi x con uno spessore combinato di circa 16 µm che consentono il basso imaging a raggi x sfondo. Tutti i materiali utilizzati offrono buona resistenza ai solvente. Questo metodo di fabbricazione è relativamente semplice e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico.
In un esempio di applicazione, descriviamo chip per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. In primo luogo, le considerazioni di progettazione e fabbricazione per l'utilizzo di valvole capillare a microfluidically dividere una reazione acquosa in un numero selezionato di nanolitro dimensioni goccioline sono discusse. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione dal canale morto-volume e spaccare facilmente può essere eseguita manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Tale isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica sono monitorati in situ mediante diffusione dinamica della luce (DLS) di controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Precedentemente è stato dimostrato che misure di liste di distribuzione possono essere eseguite in dispositivi microfluidici che consiste di una struttura di polidimetilsilossano (PDMS) legata a un vetro diapositiva25,26. Perché lo strato di polyimide ha un alta trasmissione per lunghezze d'onda più di 550 nm, l'approccio può essere esteso alle misurazioni in fiches trasparente ai raggi x, quando si utilizza un laser appropriato lunghezza d'onda27,28. Base ai risultati DLS, nucleazione iniziale può essere osservato, e ulteriore evaporazione goccia può essere fermato per ottenere cristalli della proteina di meno ma più grandi.
Dopo sufficiente cristalli vengono coltivati, set di dati completo diffrazione di raggi x può essere raccolto quindi utilizzando goniometro basato in situ fissata destinazione seriale cristallografia a raggi x a temperatura ambiente. I set di dati di diffrazione sono trattati con una suite di strumenti software e script personalizzati per risolvere la struttura di cristallo della proteina. Questa tecnica evita manufatti spesso indotti durante la crio-conservazione usati negli esperimenti di cristallografia convenzionale.
Mettiamo a confronto tre strutture di destinazione di proteine che sono stati risolti utilizzando circa 10-20 µm piccoli cristalli cresciuti nel chip migliore poi 2 risoluzione Å. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Questo protocollo può essere applicato per cristalli proteici che diffrangono ad alta risoluzione, nonché a bassa risoluzione (1.7 Å a 3.0 Å). Come quasi ogni cristallo può essere usato per la diffrazione, piccolo campione è sprecato, rendendo questo un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.
Questo protocollo fornisce una guida dettagliata su come preparare chip microfluidici trasparente ai raggi x in situ proteina cristallizzazione e diffrazione di raccolta dei dati. La procedura è stato attentamente progettata di beneficiare di microfluidica precisione senza richiedere sofisticate apparecchiature in laboratorio. Inoltre, raccolta di dati presso la beamline di sincrotrone può essere eseguita senza la necessità di un goniometro specializzato o un umidificatore per facilitare che riproducono i risultati da non esperti. La tecnica presentata può essere applicata per millisecondo seriale cristallografia raccolta di dati a temperatura ambiente mantenendo il danno da radiazione minima e senza introdurre lo stress ai cristalli dopo crescita gestendo cryo-protezione o cristallo. Quindi, il metodo descritto è adatto per qualsiasi progetto di cristallizzazione di proteine.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 Series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3000</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Plus Schnellfest 5 min</td>
			<td>Epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton foil</td>
			<td>Dupont/ American Durafilm</td>
			<td>HN grade, gauge 30 (7.5 &#956;m)</td>
			<td>polyimide foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440167</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Cytop fluoropolymer coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Cytop fluoro-solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fluorinated oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk Inc.</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>Uni-core 0.75 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo mask</td>
			<td>JD Photo Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma machine</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Isomerase</td>
			<td>Hamton Research</td>
			<td>HR7-102</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tartrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106664</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763.2</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1064060250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CSS-389</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroLight600</td>
			<td>XtalConcepts</td>
			<td></td>
			<td>DLS Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td>
			<td>Bioblock/05</td>
			<td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1ml Luer-Lock Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>Terumo Agani Needle</td>
			<td>AN*2716R1</td>
			<td>27Gx5/8&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Questo protocollo descrive la fabbricazione di dispositivi microfluidici con bassa priorità bassa di raggi x ottimizzato per goniometro basati su bersaglio fisso seriale cristallografia. I dispositivi vengono campiti da colla epossidica mediante litografia soft e sono adatti per in situ esperimenti di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. I pozzetti sono con coperchio su entrambi i lati con finestre di lamina polimerica polyimide che consentono la raccolta di dati di diffrazione con bassa priorità bassa dei raggi x. Questo metodo di fabbricazione è poco impegnativo e poco costoso. Dopo l'origine di un wafer master SU-8, tutti di fabbricazione può essere completato di fuori di una camera bianca in un ambiente di laboratorio di ricerca tipico. Il protocollo di progettazione e fabbricazione di chip utilizzano valvole capillare per dividere una reazione acquosa in goccioline nanolitro definite dimensioni microfluidically. Questo meccanismo di caricamento evita la perdita di campione da morti-volume del canale e può facilmente essere eseguito manualmente senza l'utilizzo di pompe o altre apparecchiature per azionamento fluido. Descriviamo come isolato nanolitro dimensioni gocce di soluzione proteica può essere monitorati in situ di luce dinamica scattering controllo proteine cristallo nucleazione e crescita. Dopo cristalli adatti sono sviluppati, diffrazione di raggi x completo set di dati possono essere raccolti tramite goniometro basato in situ fissata destinazione cristallografia a raggi x seriale a temperatura ambiente. Il protocollo fornisce script personalizzati per elaborare diffrazione DataSet utilizzando una suite di strumenti software per risolvere e perfezionare la struttura di cristallo della proteina. Questo approccio evita i manufatti possibilmente indotti durante la crioconservazione o cristallo manuale gestione in esperimenti di cristallografia convenzionale. Presentiamo e confrontare tre strutture di proteine che sono stati risolti utilizzando piccoli cristalli con dimensioni di circa 10-20 µm cresciuti nel chip. Da cristallizzazione e diffracting in situ, maneggevolezza e quindi meccanica è ridotto al minimo le dispersioni di cristalli fragili. Il protocollo dettaglia come fabbricare un chip microfluidico trasparente raggi x custom adatto per in situ seriale cristallografia. Come quasi ogni cristallo può essere utilizzato per la raccolta di dati di diffrazione, questi chip microfluidici sono un metodo di consegna di cristallo molto efficiente.

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Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Questo protocollo descrive dettagliatamente come fabbricare e gestire dispositivi microfluidici per la raccolta di dati di diffrazione di raggi x a temperatura ambiente. Inoltre, viene descritto come monitorare la cristallizzazione della proteina di dispersione della luce dinamica e come elaborare e analizzare dati di diffrazione ottenuti.

Chip microfluidici per dispersione della luce dinamica In Situ diffrazione di raggi x di cristallo ed In Situ per la cristallografia seriale

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

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Chemistry

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