Name: microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography
Uploaded: 2018-04-24T13:00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Эта работа была поддержана Пирс семенной фонд PIF-2015-46, BMBF предоставляет 05K16GUA и 05K12GU3 и «Центр Гамбурга для сверхбыстрой Imaging – структуры, динамики и контроль вопрос на шкале атомного» передового опыта группы Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Работа авторов, связанных с центром на свободных электронах Лазерная наука финансируется Гельмгольца через программы ориентированные фонды. Синхротрона MX данные были собраны на излучение, эксплуатируемых P14 EMBL Гамбург на Петра III хранения кольцо (DESY, Гамбург, Германия).

<ol>
	<li>Rasmussen, B. F., Stock, A. M., Ringe, D., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystalline+ribonuclease+A+loses+function+below+the+dynamical+transition+at+220+K.">Crystalline ribonuclease A loses function below the dynamical transition at 220 K.</a> Nature. 357 (6377), 423-424 (1992).</li><li>Tilton, R. F. J. R., Dewan, J. C., Petsko, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+temperature+on+protein+structure+and+dynamics:+X-ray+crystallographic+studies+of+the+protein+ribonuclease-A+at+nine+different+temperatures+from+98+to+320+K.">Effects of temperature on protein structure and dynamics: X-ray crystallographic studies of the protein ribonuclease-A at nine different temperatures from 98 to 320 K.</a> Biochemistry. 31 (9), 2469-2481 (1992).</li><li>Fraser, J. S., Clarkson, M. W., Degnan, S. C., Erion, R., Kern, D., Alber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+alternative+structures+of+proline+isomerase+essential+for+catalysis.">Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis.</a> Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).</li><li>Juers, D. H., Matthews, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+solvent+transport+in+cryo-annealing+of+macromolecular+crystals.">The role of solvent transport in cryo-annealing of macromolecular crystals.</a> Acta Crystallogr. D. 60 (Pt 3), 412-421 (2004).</li><li>Huang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+meso+in+situ+serial+X-ray+crystallography+of+soluble+and+membrane+proteins.">In meso in situ serial X-ray crystallography of soluble and membrane proteins.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 6), 1238-1256 (2015).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structure+of+granulin+determined+from+native+nanocrystalline+granulovirus+using+an+X-ray+free-electron+laser.">Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 114 (9), 2247-2252 (2017).</li><li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation.">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 2), 87-94 (2014).</li><li>von Dreele, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multipattern+Rietveld+refinement+of+protein+powder+data.">Multipattern Rietveld refinement of protein powder data.</a> J. Appl. Crystallogr. 40 (1), 133-143 (2007).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+technologies+for+membrane+protein+structural+studies.">Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 21 (4), 559-566 (2011).</li><li>Gati, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Data processing and analysis in serial crystallography at advanced X-ray sources. , (2015).</li><li>Stellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+macromolecular+serial+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Room-temperature macromolecular serial crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (Pt 4), 204-212 (2014).</li><li>Botha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+at+synchrotron+X-ray+sources+using+slowly+flowing+free-standing+high-viscosity+microstreams.">Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams.</a> Acta Crystallogr. D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).</li><li>Nogly, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+serial+millisecond+crystallography+using+synchrotron+radiation.">Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 168-176 (2015).</li><li>Martin-Garcia, J. M., Conrad, C. E., Coe, J., Roy-Chowdhury, S., Fromme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+Serial+femtosecond+crystallography:+A+revolution+in+structural+biology.">Review: Serial femtosecond crystallography: A revolution in structural biology.</a> Arch. Biochem. Biophys. 602, 32-47 (2016).</li><li>White, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrystFEL:+A+software+suite+for+snapshot+serial+crystallography.">CrystFEL: A software suite for snapshot serial crystallography.</a> J Appl Crystallogr. 45 (2), 335-341 (2012).</li><li>Perry, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+approach+for+protein+structure+determination+at+room+temperature+via+on-chip+anomalous+diffraction.">A microfluidic approach for protein structure determination at room temperature via on-chip anomalous diffraction.</a> Lab Chip. 13 (16), 3183-3187 (2013).</li><li>Schlichting, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+femtosecond+crystallography:+the+first+five+years.">Serial femtosecond crystallography: the first five years.</a> IUCrJ. 2 (Pt 2), 246-255 (2015).</li><li>Sui, S., Perry, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics:+From+crystallization+to+serial+time-resolved+crystallography.">Microfluidics: From crystallization to serial time-resolved crystallography.</a> Struct. Dynam.-US. 4 (3), (2017).</li><li>Ghazal, A., Lafleur, J. P., Mortensen, K., Kutter, J. P., Arleth, L., Jensen, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+X-ray+compatible+microfluidics+for+applications+in+soft+materials+and+life+sciences.">Recent advances in X-ray compatible microfluidics for applications in soft materials and life sciences.</a> Lab Chip. 16 (22), 4263-4295 (2016).</li><li>Heymann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Room-temperature+serial+crystallography+using+a+kinetically+optimized+microfluidic+device+for+protein+crystallization+and+on-chip+X-ray+diffraction.">Room-temperature serial crystallography using a kinetically optimized microfluidic device for protein crystallization and on-chip X-ray diffraction.</a> IUCrJ. 1 (Pt 5), 349-360 (2014).</li><li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicrystal+diffraction+data-collection+approach+for+studying+structural+dynamics+with+millisecond+temporal+resolution.">A multicrystal diffraction data-collection approach for studying structural dynamics with millisecond temporal resolution.</a> IUCrJ. 3 (Pt 6), 393-401 (2016).</li><li>Weierstall, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipidic+cubic+phase+injector+facilitates+membrane+protein+serial+femtosecond+crystallography.">Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography.</a> Nat. Commun. 5, 3309 (2014).</li><li>Conrad, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+inert+crystal+delivery+medium+for+serial+femtosecond+crystallography.">A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography.</a> IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).</li><li>Cohen, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goniometer-based+femtosecond+crystallography+with+X-ray+free+electron+lasers.">Goniometer-based femtosecond crystallography with X-ray free electron lasers.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (48), 17122-17127 (2014).</li><li>Erskine, D., YU, P. Y., Freilich, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Pressure+Visible+Spectroscopy+of+Polyimide+Film.">High-Pressure Visible Spectroscopy of Polyimide Film.</a> J. Polym. Sci. Pol. Lett. 26 (11), 465-468 (1988).</li><li>Tsai, C. -. L., Yen, H. -. J., Chen, W. -. C., Liou, G. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+solution-processable+optically+isotropic+colorless+polyimidothioethers-TiO2+hybrids+with+tunable+refractive+index.">Novel solution-processable optically isotropic colorless polyimidothioethers-TiO2 hybrids with tunable refractive index.</a> J. Mater. Chem. 22 (33), 17236-17244 (2012).</li><li>Destremaut, F., Salmon, J. -. B., Qi, L., Chapel, J. -. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+with+on-line+dynamic+light+scattering+for+size+measurements.">Microfluidics with on-line dynamic light scattering for size measurements.</a> Lab Chip. 9 (22), 3289-3296 (2009).</li><li>Chastek, T. Q., Iida, K., Amis, E. J., Fasolka, M. J., Beers, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+platform+for+integrated+synthesis+and+dynamic+light+scattering+measurement+of+block+copolymer+micelles.">A microfluidic platform for integrated synthesis and dynamic light scattering measurement of block copolymer micelles.</a> Lab Chip. 8 (6), 950-957 (2008).</li><li>Heymann, M., Fraden, S., Kim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Height+Precision+Alignment+With+Selectively+Developed+Alignment+Marks.">Multi-Height Precision Alignment With Selectively Developed Alignment Marks.</a> J. Microelectromech. S. 23 (2), 424-427 (2014).</li><li>Schubert, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliably+distinguishing+protein+nanocrystals+from+amorphous+precipitate+by+means+of+depolarized+dynamic+light+scattering.">Reliably distinguishing protein nanocrystals from amorphous precipitate by means of depolarized dynamic light scattering.</a> J Appl Crystallogr. 48 (5), 1476-1484 (2015).</li><li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+(COC)+microfluidic+devices.">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sensor Actuat. B-Chem. 247, 940-949 (2017).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Proteomics Protocols Handbook. , (2005).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=XDS.">XDS.</a> Acta Crystallogr D. 66 (Pt 2), 125-132 (2010).</li><li>Vagin, A., Teplyakov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+replacement+with+MOLREP.">Molecular replacement with MOLREP.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 1), 22-25 (2010).</li><li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments.">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Crystallogr. D. 67, 235-242 (2011).</li><li>Murshudov, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REFMAC5+for+the+refinement+of+macromolecular+crystal+structures.">REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures.</a> Acta Crystallogr. D. 67 (Pt 4), 355-367 (2011).</li><li>Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Features+and+development+of+Coot.">Features and development of Coot.</a> Acta Crystallogr. D. 66 (Pt 4), 486-501 (2010).</li><li>Owen, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploiting+fast+detectors+to+enter+a+new+dimension+in+room-temperature+crystallography.">Exploiting fast detectors to enter a new dimension in room-temperature crystallography.</a> Acta Crystallogr. D. 70 (Pt 5), 1248-1256 (2014).</li><li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automatic-Indexing+of+Rotation+Diffraction+Patterns.">Automatic-Indexing of Rotation Diffraction Patterns.</a> J. Appl. Crystallogr. 21, 67-71 (1988).</li><li>Zarrine-Afsar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallography+on+a+chip.">Crystallography on a chip.</a> Acta Crystallogr. D. 68 (Pt 3), 321-323 (2012).</li><li>Boukellal, H., Selimovi&#263;, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+robust+storage+of+drops+and+fluids+in+a+microfluidic+device.">Simple, robust storage of drops and fluids in a microfluidic device.</a> Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).</li><li>Aghvami, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+prototyping+of+cyclic+olefin+copolymer+(COC)+microfluidic+devices.">Rapid prototyping of cyclic olefin copolymer (COC) microfluidic devices.</a> Sens. Actuator B Chem. 247, 940-949 (2017).</li><li>Shemesh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stationary+nanoliter+droplet+array+with+a+substrate+of+choice+for+single+adherent/nonadherent+cell+incubation+and+analysis.">Stationary nanoliter droplet array with a substrate of choice for single adherent/nonadherent cell incubation and analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (31), 11293-11298 (2014).</li><li>Sun, M., Bithi, S. S., Vanapalli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+static+droplet+arrays+with+tuneable+gradients+in+material+composition.">Microfluidic static droplet arrays with tuneable gradients in material composition.</a> Lab Chip. 11 (23), 3949-3952 (2011).</li><li>Shim, J. -. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+and+measurement+of+the+phase+behavior+of+aqueous+solutions+using+microfluidics.">Control and measurement of the phase behavior of aqueous solutions using microfluidics.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (28), 8825-8835 (2007).</li><li>Schubert, R., Meyer, A., Baitan, D., Dierks, K., Perbandt, M., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+Observation+of+Protein+Dense+Liquid+Cluster+Evolution+during+Nucleation+in+Protein+Crystallization.">Real-Time Observation of Protein Dense Liquid Cluster Evolution during Nucleation in Protein Crystallization.</a> Cryst. Growth Des. 17 (6), 3579 (2017).</li></ol>

Авторы не имеют ничего сообщать.

Мы производим microfluidic приборы для в situ рентгеновской дифракции, кучность эпоксидной смолы в качестве наполнителя материал и полиимидные пленки в качестве окна материал. Наша процедура оптимизирован различные этапы процесса изготовления над предыдущей рентгеновского чип конструкции16,21. Мы сократили толщина окна и тем самым фон рассеяния, а также ослабление изготовление меньшее количество процесса требуются шаги. в situ кристаллизации с использованием описанных протокола имеет значительные преимущества. Это позволяет дифракции сбора данных при комнатной температуре и тем самым исключает необходимость защиты крио, которая в некоторых случаях содержит риск введения артефакты в структуре белка. Кроме того кристаллы не распространяются, физический стресс, потому что можно избежать передачи кристаллы от их родной среде. Через эту процедуру кристаллы поддерживать их высокое качество и не страдают от любого лечения.
По нашему опыту наиболее важные шаги в рамках протокола вращаются вокруг контроля процесса кристаллизации. Параметры для получения рентгеновского подходит кристаллы с надлежащие размеры необходимо определить эмпирически и не могут быть взяты непосредственно из экспериментов диффузии паров. Использование идентичных концентрации белков и осадителя не всегда приводит к кристаллов различных фишек, или время от времени в различных скважин в пределах той же микросхеме. Это означает, что все факторы, влияющие на кристалл зарождения и роста следует тщательно изучить, как мать ликер композиции или кристаллизации кинетика (через испарение траектории). Как более крупные кристаллы излучению для более высоким разрешением, достаточно крупные кристаллы выращивают идеально. Процесс кристалл зарождения и роста может следовать с DLS измерения. Настройка лазерный фокус внутри ~ 50 мкм тонкий кристаллизации отсеков чипа может быть сложным и может потребовать тщательной ручной выравнивание. С помощью скважин глубиной более 100 мкм, лазерный авто выравнивание было осуществимо и надежной, таким образом, что несколько скважин может контролироваться путем автоматического приобретения схем.
На основе полиимидных рентгеновского чипов производят только низких фоновых и мы продемонстрировать пригодность этих устройств для процедуры сбора данных рентгеновской дифракции, решая структур для трех моделей белков. Самое лучшее разрешение, полученные в чип отличались, по сравнению с ранее достигнутых резолюций, от обычного сбора данных рентгеновского и значительно более крупные кристаллы белка. Это может быть вызвано несколькими факторами и кристаллизации условие оптимизации может далее совершенствовать дифракции. Это было невозможно собрать в situ дифракции данных до 1.8 резолюции Å, применяя кристалл с размеры меньше, чем 30 мкм. Детальный анализ данных дифракции тауматина представила идеи о радиационных повреждений. Ограничить расширение радиационного повреждения, только один монокристаллов должны быть предоставлены в отсек в microfluidic устройство, как может произойти распространение радикалов и в соседние кристаллы. Чтобы улучшить скорость сбора данных, это должны быть автоматизированы в будущем.
Благодаря Кристалл морфологии в некоторых случаях может возникнуть предпочтительным ориентации. Это было, например в случае с thioredoxin dataset, где кристаллы были сильно предпочтительным ориентации по отношению к чип windows. Даже здесь мы могли бы собрать набор полный дифракции. Если кристаллы демонстрируют предпочтительного ориентации в чип и в частности если соответствующего пространства группа также имеет низкий симметрии, то полноты набора данных должны быть проверены во время сбора таким образом, чтобы быть достаточно тростника модели дифракции сбор.
Время решен исследования с использованием этих чипов непосредственно возможны, когда с помощью света индуцированной реакции с подходом насоса зонд. Светопропускание полиимида фольги для лазерной насоса необходимо быть выяснены и в качестве альтернативы, оптически ясно водоплавающих или могут быть использованы COC. Текущей геометрии microfluidic не позволяют для смешивания эксперименты, после того, как кристаллы выращивают субстрата. Однако мы ожидаем описанных рентгеновского чип изготовление протокол также пригодны для такого перемешивания образцов для обоих время решена рентгеновской дифракции, а также рассеяние подходы19.

Зная 3D структура белка имеет важное значение для понимания его функциональность. До настоящего времени вблизи атомных резолюции структуры наиболее часто получаются рентгеноструктурного анализа. Этот метод предоставляет белковых кристаллов для рентгеновского излучения и результате дифракционные текстуры затем анализируются для определения структуры и изысканности. В традиционных рентгеноструктурного анализа полный дифракции dataset записывается из одного, в идеале большие, кристалла при криогенных температурах. Такие кристаллы, однако, главным образом не являются тривиальными расти, и для выявления подходящих крио сохранение условий может стать сложной задачей само по себе и иногда также может вызвать отклонения от в родном протеине структуры5.
Последние технологические достижения в рентгеновский лазер на свободных электронах (ГСМ) и Синхротронное излучение позволили решить структур от мелких кристаллов, как новый микро упором излучение, увеличение рентгеновского пучка блеск, и стал более детекторы рентгеновского излучения доступно6,7. Как правило легче расти чем большим и дефект бесплатно кристаллов8,9, маленькие кристаллы. Однако небольшие кристаллы страдают от рентгеновского излучения ущерб гораздо быстрее, чем крупные кристаллы. Это потому, что по сравнению с большой кристалл, более высокие дозы рентгеновского должны проецироваться в меньший объем кристалл к излучению сопоставимых резолюции. Таким образом даже криогенных защиты недостаточно часто для записи набора данных полный дифракции от одного микрокристаллита.
Чтобы преодолеть этот барьер, серийный кристаллографии стал методом выбора для сбора и объединения дифракционные текстуры из многих произвольно ориентированный микрокристаллов для получения полного набора данных. Индуцированная кристалл повреждения сводится к минимуму путем распространения общей дозы рентгеновского излучения используется для решения структуры белков через большое количество кристаллов5,10. В ' преломлять перед уничтожать ' FEL эксперимент, каждый кристалл используется только для одной экспозиции, используя импульсы рентгеновского Фемто второй. В свою очередь излучение микро фокус на третьего поколения источников синхротронного можно выполнить последовательный кристаллографии с несколько миллисекунд короткие рентгеновского облучения11,12,13,14. Без колебаний кристалл или вращение во время сбора данных, однако, лишь частично Брэгг размышления могут быть записаны и следовательно десятки тысяч или больше дифракционные текстуры обычно требуются для определения структуры15. На сегодняшний день, разнообразный набор методов доставки образца был разработан для последовательного кристаллографии, как недавно рассмотрели14,16,,1718,19. Среди тех несколько фиксированной цели на основе поставки образца, которую стратегии успешно сочетались с кристалл вращение во время рентгеновского облучения, таким образом, что значительно меньше дифракционные текстуры может обеспечить не менее полные наборы данных также потребляя меньше Пример по сравнению классической серийный кристаллографии эксперименты, где неподвижных изображений, записанных7,16,20,21,,2223 , 24.
Мы представляем протокол для изготовления microfluidic приборы с низкой рентгеновского фона. Узорные от 5-мин эпоксидный клей с помощью мягкой литографии и подходят для in situ дифракции рентгеновских лучей экспериментов при комнатной температуре, что выгоды от интеграции подготовки пробы непосредственно в рентгеновской установки, как в случае с устройства время решен исследования, которые следуют смешивания индуцированной кинетики18,19. Microfluidic каналы находятся бочки с обеих сторон полимерные полиимида фольгой, привело рентгеновского windows с комбинированной толщиной около 16 мкм, которые позволяют для низких рентгенография фон. Все используемые материалы обеспечивают хорошую растворителей сопротивления. Этот метод изготовления является сравнительно простым и недорогим. После поиска Су-8 мастер пластин, все изготовления может быть завершена за пределами чистых помещений в лабораторных условиях типичной исследований.
В пример приложения мы описываем чипы для угломер на основе фиксированной цели серийный кристаллографии. Во-первых дизайн и изготовление вопросы использования капиллярного запорной арматуры для microfluidically разделить водный реакции в выбранное количество капель nanoliter размера, обсуждаются. Этот механизм загрузки позволяет избежать потери образца от мертвых громкость канала и расщепление может легко выполняться вручную без использования насосов и другого оборудования для жидкости срабатывания. Такие изолированные nanoliter размера капель раствора белка являются мониторинг на местах с использованием динамического рассеяния света (DLS) для управления белка кристалл зарождения и роста. Ранее было продемонстрировано, что DLS измерения могут быть выполнены в microfluidic приборы, состоящий из полидиметилсилоксан (PDMS) структуры, приклеенная к25,стекла в слайд26. Потому что слой полиимида высоких передач для длин волн более 550 Нм, подход может быть расширен для измерения рентгеновского прозрачный фишки также, при использовании соответствующей лазера длина волны27,28. Основываясь на результатах DLS, первоначальный нуклеации может наблюдаться, и дальнейшее испарение капли могут быть остановлены получить меньше, но больше белковых кристаллов.
После того, как достаточно кристаллы выращивают, то полный рентгеновской дифракции наборов данных, затем могут быть собраны с помощью гониометра основанные на месте фиксированной целевой серийный рентгеноструктурного анализа при комнатной температуре. Дифракция наборы данных обрабатываются с использованием набор программных инструментов и пользовательских сценариев для решения Кристаллическая структура белка. Этот метод позволяет избежать артефактов, часто индуцированных течение крио сохранение используется в обычных кристаллографии экспериментов.
Мы сравниваем три целевых структур белков, которые были решены с помощью о 10-20 мкм маленькие кристаллы, выращенных в чип лучше, чем 2 Е резолюции. Кристаллизации и Дифрагирующая в situ, обработка и следовательно механические нарушения хрупкие кристаллы сводится к минимуму. Этот протокол может применяться для кристаллов белков, которые преломлять высокого разрешения, а также низким разрешением (1.7 Å 3.0 Å). Как почти каждый кристалл может быть использован для дифракции, маленький образец впустую, что делает этот метод доставки очень эффективный кристалл.
Этот протокол обеспечивает подробное руководство о том, как подготовить рентгеновского прозрачный microfluidic фишки в situ белка кристаллизации и дифракции сбора данных. Процедура была тщательно разработана для выгоды от microfluidic точности без необходимости сложного оборудования в лаборатории. Кроме того сбор данных на Синхротронное излучение может осуществляться без необходимости специализированного гониометр или увлажнитель для облегчения воспроизведения результаты не эксперты. Представленный метод может быть применен для последовательного миллисекунды кристаллографии сбора данных при комнатной температуре при сохранении радиационных повреждений минимальной и без введения стресс после роста кристаллов крио защиты или кристалл обработки. Следовательно описан метод подходит для любого проекта кристаллизации белка.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SU-8 3000 Series</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>SU-8 3000</td>
			<td>Photoresist</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PGMEA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>484431</td>
			<td>Developer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropyl alcohol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epoxy glue</td>
			<td>UHU</td>
			<td>Plus Schnellfest 5 min</td>
			<td>Epoxy glue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184</td>
			<td>Silicone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kapton foil</td>
			<td>Dupont/ American Durafilm</td>
			<td>HN grade, gauge 30 (7.5 &#956;m)</td>
			<td>polyimide foil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440140</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GPTS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>440167</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>Cytop CTX-109AE</td>
			<td>Cytop fluoropolymer coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Asahi Glass Co. Ltd</td>
			<td>CT-Solv 100E</td>
			<td>Cytop fluoro-solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HFE-7500</td>
			<td>3M</td>
			<td>Novec 7500</td>
			<td>Fluorinated oil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>AutoDesk Inc.</td>
			<td>AutoCAD</td>
			<td>CAD Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy Punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>Uni-core 0.75 mm</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo mask</td>
			<td>JD Photo Data</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 inch wafer</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td></td>
			<td>Silicon wafer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mask aligner</td>
			<td>S&#220;SS MicroTec</td>
			<td>MJB4</td>
			<td>Mask aligner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS mixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma machine</td>
			<td>Diener electronic</td>
			<td>Zepto</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T7638</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose Isomerase</td>
			<td>Hamton Research</td>
			<td>HR7-102</td>
			<td>Protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bis-Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B9754</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Tartrate</td>
			<td>Merck</td>
			<td>106664</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>10812846001</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6763.2</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>208337</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Sulfate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4418</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E6758</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>1064060250</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG1500</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD2-100-6</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPG buffer</td>
			<td>Jena Bioscience</td>
			<td>CSS-389</td>
			<td>Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectroLight600</td>
			<td>XtalConcepts</td>
			<td></td>
			<td>DLS Instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zentrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultimaker2</td>
			<td>Ultimaker</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form2</td>
			<td>Formlabs</td>
			<td></td>
			<td>3D printer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Filter</td>
			<td>Sartorius Stedim</td>
			<td></td>
			<td>0.2 &#181;m filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing</td>
			<td>Adtech Polymer Engineering Ltd</td>
			<td>Bioblock/05</td>
			<td>PTFE tubing 0.3 mm Inner Diameter x 0.76 mm Outer Diameter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes&#160;</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td>1ml Luer-Lock Tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle&#160;</td>
			<td>Terumo Agani Needle</td>
			<td>AN*2716R1</td>
			<td>27Gx5/8&#34;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography

Этот протокол описывает изготовления microfluidic приборы с низкой рентгеновского фона, оптимизирован для угломер на основе фиксированной цели серийный кристаллографии. Устройства узором из эпоксидного клея с помощью мягкой литографии и подходят для в situ эксперименты рентгеновской дифракции при комнатной температуре. Образец скважины находятся бочки с обеих сторон полимерные полиимида фольги windows, которые позволяют сбора данных дифракции с низкой рентгеновского фона. Этот метод изготовления неприхотливые и недорогой. После поиска Су-8 мастер пластин, все изготовления может быть завершена за пределами чистых помещений в типичной исследовательской лабораторной среде. Чип дизайн и изготовление протокол использовать, капиллярной запорной арматуры для microfluidically разделить водный реакции на определенные nanoliter размера капли. Этот механизм загрузки позволяет избежать потери образца от мертвых громкость канала и легко может быть выполнена вручную без использования насосов и другого оборудования для жидкости срабатывания. Мы описываем, как изолированные nanoliter размера капель раствора белка может контроль на местах , динамический свет рассеяния для управления белка кристалл зарождения и роста. После того, как подходящие кристаллы выращивают, полный рентгеновской дифракции наборы данных могут быть собраны с помощью гониометра основанные на месте фиксированной целевой серийный рентгеноструктурного анализа при комнатной температуре. Протокол обеспечивает пользовательские сценарии для обработки дифракции наборы данных с помощью набора программных средств для решения и уточнения Кристаллическая структура белка. Этот подход позволяет избежать артефактов, индуцированного возможно во время крио сохранение или ручной кристалл, обработка в обычных кристаллографии экспериментов. Мы представляем и сравнить три белковых структур, которые были решены с помощью мелких кристаллов с размерами примерно 10-20 мкм, выращенных в чипе. Кристаллизации и Дифрагирующая в situ, обработка и следовательно механические нарушения хрупкие кристаллы сводится к минимуму. Протокол описывает изготовить пользовательских подходит для в situ серийный кристаллографии рентгеновского чип прозрачный microfluidic. Как почти каждый кристалл может использоваться для сбора данных дифракции, эти чипы microfluidic являются очень эффективный кристалл метод доставки.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography at JoVE.com

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Этот протокол описывает подробно в изготовлении и эксплуатации microfluidic приборы для сбора данных рентгеновской дифракции при комнатной температуре. Кроме того он описывает, как контролировать кристаллизации белка путем динамического рассеяния света, и как обрабатывать и анализировать полученные данные дифракции.

Microfluidic чипы для In Situ кристалл рентгеновской дифракции и на месте Динамическое рассеяние света для последовательного кристаллографии

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Подготовка прилипшие клетки для рентгеновской флуоресценции изображений по химической фиксации

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

Рентгеновская дифракция в порошок по сохранению науки: На пути к Обычной кристаллической структуры Определение продуктов коррозии на наследие предметов искусства

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

High Pressure Single Crystal Diffraction at PX^2

Высокое давление монокристалл дифракция при РХ ^ 2

In this report we describe detailed procedures for carrying out single crystal X-ray diffraction experiments with a diamond anvil cell (DAC) at the ...

Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Измерение Распределение частиц по размерам в мутных растворах с помощью динамического рассеяния света микроскопии

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

Количественная оценка рентгеновской флуоресценции данных с использованием карты

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

ДНК-магнитопорошковый обязательного анализа динамических и электрофоретической рассеяние света

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Быстрый Nanoprobe сигнала повышение синтеза наночастиц золота в Situ

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Элементаль чувствительных обнаружение химии в батареи через мягкие рентгеновской спектроскопии поглощения и резонансных неупругого рентгеновского рассеяния

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

Улучшение экструзии высокой вязкости микрокристаллов для времени решены серийный Фемтосекундный кристаллографии в рентгеновских лазеров

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Применение напряжения в анализе динамического рассеяния света

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...