Name: quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

हम इमेजिंग तकनीकी सहायता के लिए विलियम ए इयम् शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । यह काम चिकित्सा अल्जाइमर कोष द्वारा समर्थित किया गया था [to r. e. t], राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R01AG014713 और R01MH60009 को आर. ई. टी.; R03AR063271 और R15EB019704 को अल], और राष्ट्रीय विज्ञान फाउण्डेशन [NSF1455613 to अल] ।

1. प्रायोगिक तैयारी
<ol><li>निम्नलिखित रिएजेंट तैयार करें: Dulbecco के फास्फेट बफर खारा (पंजाब); ट्राइटन X-१००; ०.२% PBST (पंजाब + ०.२% ट्राइटन X-१००); ३२% paraformaldehyde (पीएफए), उपयोग करने से पहले 4% में पतला; सिलिकॉन elastomer बेस और इलाज एज?...

<ol>
	<li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+mammalian+retina.">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li><li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+diversity+among+amacrine+cells:+implications+for+function.">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li><li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons.">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li><li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases.">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li><li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li><li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer's+disease.">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li><li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2.">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li><li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+through+Dishevelled,+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development.">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons.">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li><li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis.">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li><li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase/Furry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons.">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li><li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis.">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li><li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development.">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li><li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis.">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).</li><li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+reversal+of+Alzheimer's+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuriteTracer:+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth.">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li></ol>

Dendrites कि अंदर आना एपिडर्मिस न्यूरॉन्स के इनपुट क्षेत्रों रहे हैं, और उनके morphologies कैसे जानकारी प्राप्त की है और व्यक्तिगत ंयूरॉंस द्वारा संसाधित है निर्धारित करते हैं । विकास dendrite आकृति विज्ञान dendrite संगठन के...

Dendrites, जो एक ंयूरॉन के शाखाई अनुमानों रहे हैं, क्षेत्र है कि ंयूरॉन संवेदी और अंय ंयूरॉंस से synaptic जानकारी शामिल कवर1,2। Dendrites synapse गठन के एक महत्वपूर्ण घटक है और synaptic आदानों को एकीकृत करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, साथ ही साथ एक ंयूरॉन में विद्युत उत्तेजना का प्रचार । वृक्ष arborization (da) एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा न्यूरॉन्स नए वृक्ष पेड़ और शाखाओं के रूप में नए synapses बनाने के लिए फार्म. इस तरह के शाखा घनत्व और समूहीकरण पैटर्न के रूप में दा, के विकास और आकृति विज्ञान, बहु कदम जैविक प्रक्रियाओं से परिणाम और उच्च ंयूरॉन समारोह के लिए संबंधित हैं । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य Drosophila में न्यूरॉन dendritric arborization जटिलता के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक विधि प्रदान करना है .
dendrites की जटिलता synaptic प्रकार, कनेक्टिविटी, और भागीदार ंयूरॉंस से आदानों निर्धारित करता है । पैटर्न शाखाकरण और dendrites के घनत्व संकेत है कि वृक्ष क्षेत्र3,4पर एकाग्र प्रसंस्करण में शामिल हैं । Dendrites विकास में समायोजन के लिए लचीलापन है । उदाहरण के लिए, synaptic संकेतन विकासात्मक चरण के दौरान और परिपक्व तंत्रिका प्रणाली5में somatosensory ंयूरॉन में dendrite संगठन पर एक प्रभाव है । न्यूरॉन कनेक्टिविटी की स्थापना morphogenesis और dendrites की परिपक्वता पर निर्भर करता है । dendrites की कुरूपता बिगड़ा ंयूरॉन समारोह के साथ जुड़ा हुआ है । अध्ययनों से पता चला है कि दा न्यूरॉन morphogenesis की विषमता कई neurodegenerative रोगों के etiologies में योगदान दे सकती है, जिनमें अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington की बीमारी (एचडी), और लो Gehrig की बीमारी/ पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS)६,७,८. Synaptic परिवर्तन विज्ञापन के प्रारंभिक चरण में दिखाई देते हैं, संगीत समारोह में गिरावट और हानि के साथ ंयूरॉन7,8। हालांकि, इन neurodegenerative रोगों में रोगजनन के लिए कैसे dendrite विकृति योगदान के विशिष्ट मायावी रहता है ।
dendrites के विकास के जीन है कि नियामकों के एक जटिल नेटवर्क में सांकेतिक शब्दों में बदलना,9प्रोटीन के Wnt परिवार के रूप में,10, प्रतिलेखन कारकों, और सेल सतह रिसेप्टर्स11,12 पर लाइगैंडों द्वारा विनियमित है . Drosophila दा न्यूरॉन्स चार वर्गों (वर्ग मैं, द्वितीय III, iv) से मिलकर बनता है, जो कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स सबसे जटिल बंटी पैटर्न है और बेहतर समझ के लिए एक शक्तिशाली प्रयोगात्मक प्रणाली के रूप में नियोजित किया गया है13morphogenesis, 14. प्रारंभिक morphogenesis के दौरान, कम से कम और/या RNAi मुंह बंद करने वर्ग चतुर्थ दा न्यूरॉन्स में जीन का परिणाम शाखाओं में बंटी पैटर्न में परिवर्तन और dendrite13छंटाई. यह ंयूरॉन वृक्ष arborization के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक व्यावहारिक विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
हम पहले से पता चला है कि मुंह बंद करने के Drosophila ortholog के SOX5, Sox102F, कम से कम dendrites के नेतृत्व में डा न्यूरॉन्स और कक्षा चतुर्थ दा न्यूरॉन्स में कमी जटिलता15. यहां, हम Drosophilaमें ंयूरॉन वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) के लिए मात्रात्मक विश्लेषण की प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं । इस प्रोटोकॉल, पिछले वर्णित पद्धति से अनुकूलित, एक संक्षिप्त विधि प्रदान करता है परख के विकास के लिए संवेदी ंयूरॉंस । यह मजबूत छवि लेबलिंग और तीसरी instar लार्वा शरीर की दीवार16,17,18,19में दा ंयूरॉन दिखाता है । वीवो मेंNDAC और विकासात्मक मतभेदों की जांच की चाहत रखने वाले शोधकर्ताओं के लिए यह एक बहुमूल्य प्रोटोकॉल है ।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Phosphate buffered saline(PBS)</td>
			<td style="width:223px;">Gibco Life Sciences</td>
			<td style="width:197px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:363px;">Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:197px;">15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:363px;">Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent</td>
			<td style="width:223px;">Dow Corning Corportation</td>
			<td style="width:197px;">3097366-0516;3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:363px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fingernail polish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">CVS</td>
			<td style="width:197px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri dish</td>
			<td style="width:223px;">Falcon</td>
			<td style="width:197px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Forceps</td>
			<td style="width:223px;">Dumont</td>
			<td style="width:197px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Insect Pins&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-6082-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:363px;">Microscope slides and cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">15-188-52</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila

Dendrites एक ंयूरॉन के शाखाई अनुमानों हैं, और वृक्ष आकृति विज्ञान तंत्रिका तंत्र के विकास के दौरान synaptic संगठन को दर्शाता है । Drosophila लार्वा न्यूरॉन वृक्ष arborization (डीए) तंत्रिका तंत्र के विकास में तंत्रिका morphogenesis और जीन समारोह के dendrites अध्ययन के लिए एक आदर्श मॉडल है. डीए न्यूरॉन्स की चार कक्षाएं हैं । चतुर्थ श्रेणी के एक शाखाकरण पैटर्न है कि लार्वा शरीर की दीवार के लगभग पूरे क्षेत्र को कवर के साथ सबसे जटिल है । हम पहले के प्रभाव की विशेषता है मुंह बंद करने के Drosophila ortholog पर SOX5 की कक्षा चतुर्थ न्यूरॉनी वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) का उपयोग कर चार पैरामीटर: dendrites की लंबाई, dendrite कवरेज की सतह क्षेत्र, शाखाओं की कुल संख्या, और शाखाकरण संरचना । इस प्रोटोकॉल NDAC मात्रात्मक विश्लेषण के कार्यप्रवाह प्रस्तुत करता है, लार्वा विच्छेदन, फोकल माइक्रोस्कोपी से मिलकर, और छवि विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर प्रक्रियाओं । इसके अलावा दा ंयूरॉन विकास और उसके अंतर्निहित तंत्र में अंतर्दृष्टि और न्यूरॉन्स की समझ में सुधार होगा कार्य और स्नायविक और neurodevelopmental विकारों के बुनियादी कारणों के बारे में सुराग प्रदान करते हैं ।

दा न्यूरॉन्स के dendrites को सह-एक्सप्रेस GFP (यूएएस-GFP; ppk-GAL4) में दा तंत्रिका सोमा और वृक्ष arbors फॉर GFP प्रतिदीप्ति इमेजिंग एनालिसिस के लेबल थे. दा ंयूरॉन dendrites की आकृति विज्ञान एक औंधा फोकल माइक्रोस्कोप (<st...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

यह प्रोटोकॉल Drosophilaमें न्यूरॉन वृक्ष arborization जटिलता (NDAC) के मात्रात्मक विश्लेषण पर केंद्रित है, जिसका इस्तेमाल वृक्ष morphogenesis के अध्ययन के लिए किया जा सकता है ।

Drosophila में न्यूरॉनी वृक्ष Arborization जटिलता का मात्रात्मक विश्लेषण

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

इस प्रक्रिया का समग्र लक्ष्य ड्रोसोफिला में न्यूरोनल विकास के दौरान डेंड्रिटिक आर्बोराइजेशन न्यूरॉन्स की जटिलता पर SOX5 जीन के प्रभाव का पालन करना है। इस विधि न्यूरो-dendrites के morphogenesis अध्ययन में मदद कर सकते हैं, और तंत्रिका तंत्र के विकास में जीन समारोह, बेहतर न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग जीन को समझने के लिए । अंततः यह तकनीक डेंड्राइट्स जटिलता का मात्रात्मक विश्लेषण प्रदान करती है, जिसका उपयोग कई अलग-अलग प्रकार के न्यूरो-डेन्ड्रिट्स में किया जा सकता है।इस तकनीक के निहितार्थ न्यूरो अपक्षयी रोग के आनुवंशिक तंत्र की ओर विस्तार, क्योंकि उत्परिवर्तन जीन समारोह को समझने के लिए महत्वपूर्ण रखती है । यूएएस-जीएफपी;पीपीके-GAL4 के सेट-अप क्रॉस यूएएस-Sox102F-RNAi तनाव मक्खियों या W118 नियंत्रण के साथ। संस्कृति 25 डिग्री सेल्सियस पर मानक परिस्थितियों में मक्खियों।लगभग पांच से छह दिनों में, विच्छेदन के लिए तीसरे इंस्टार लार्वा को ध्यान से इकट्ठा करने के लिए संदंश का उपयोग करें। सिलिकॉन इलास्टोमर बेस से बने विच्छेदन पकवान में एक लार्वा रखें, और एक ऊतक-संस्कृति पेट्री डिश। इसके बाद डिश को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।अब मिडलाइन को बेनकाब करने के लिए लार्वा की पूंछ को पिन करें। फिर लार्वा मुंह हुक पिन करें ताकि लार्वा का पृष्ठीय पक्ष ऊपर हो। अब घोल में लार्वा विसर्जित करने के लिए डिश में पीबीएस के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।इसके बाद, छोटे चीरों के साथ लार्वा की पूंछ और मुंह काटें। फिर पृष्ठीय मिडलाइन के साथ और दो श्वासनली के बीच, कौडल से रोस्ट्रल तक जाने वाले लार्वा को काट लें। फिर शरीर के चार कोनों में से प्रत्येक पर एक पिन रखें ताकि शरीर सपाट हो जाए।अब कमरे के तापमान पर 25 मिनट के लिए चार प्रतिशत पीएफए में लार्वा शरीर की दीवार को ठीक करें। फिर प्रति धोने पांच मिनट के लिए तीन बार पीबीएस के साथ लार्वा धोएं। वॉश के बाद, पिन निकालें और ऊतक को ग्लास स्लाइड पर स्थानांतरित करें।फिर ऊतक को एंटीफैड बढ़ते माध्यम में विसर्जित करें, और इसे कवर स्लिप के साथ माउंट करें। नाखूनों की पॉलिश के साथ कवर स्लिप पर सील करने से पहले घुड़सवार ऊतक को एक घंटे के लिए सूखी हवा में जाने दें। इन स्लाइड्स को चार डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।20X उद्देश्य का उपयोग करके एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के साथ जेड-सीरीज छवियों को कैप्चर करें। सबसे पहले, लार्वा शरीर की दीवार में डीए न्यूरॉन्स के सभी शामिल करने के लिए जेड-स्टेप्स की सीमा निर्धारित करें, और चरण का आकार आधा माइक्रोमीटर सेट करें। फिर प्रसंस्करण के लिए टीआईएफ या ND2 फाइलों के रूप में छवियों को स्टोर करें।इसके बाद, डीए न्यूरॉन्स पर डेंड्राइट्स की संख्या और आकृति विज्ञान का मूल्यांकन करें। उनकी लंबाई का आकलन करने के साथ शुरू करो। सबसे पहले, फिजी इमेजजे में, यदि आवश्यक हो तो छवियों को अलग चैनलों में विभाजित करें।केवल जीएफपी चैनल का आकलन करने की जरूरत है। इसके बाद, एक जेड-प्रोजेक्शन करें। नई विंडो में, प्रक्षेपण प्रकार के लिए अधिकतम तीव्रता का चयन करें, और स्टार्ट और स्टॉप स्लाइस चुनें।फिर स्पष्ट डेंड्राइट अनुमानों के साथ जेड-प्रोजेक्शन इमेज का उत्पादन करने के लिए ओके पर क्लिक करें। अब प्लग-इन टूल का उपयोग करके न्यूराइट्स का पता लगाएं। सबसे पहले, रुचि के न्यूरॉन के सोमा के पास जाएं और क्लिक करें जहां कोशिका शरीर से एक डेंड्राइट निकलता है।इसके बाद इस डेंड्राइट की नोक पर क्लिक करें। यदि दो अंकों को जोड़ने वाली नीली रेखा न्यूराइट की लंबाई चलाती है, तो हां के लिए वाई दबाएं। इसके बाद अगर यह लाइन न्यूट्रिशन का पूरा रास्ता फिट बैठती है तो पूरा रास्ता क्लिक करें।यदि रेखा पथ में फिट नहीं होती है, तो पथ को कई लाइन खंडों में मोड़ने के लिए इस न्यूराइट के साथ आगे के बिंदुओं पर क्लिक करें जो न्यूराइट की लंबाई में फिट होंगे। फिर, पूरा रास्ता क्लिक करें और अगले न्यूराइट के लिए पथ चिह्नित करने के साथ आगे बढ़ें। सभी ट्रेसिंग पथों को पूरा करने के बाद, विश्लेषण का चयन करें, सीएसवी फ़ाइल को रास्तों को निर्यात करने के लिए पथ विकल्प को मापें।विश्लेषण के लिए पथ की लंबाई की गणना और औसत मूल्य के लिए इस डेटा का उपयोग करें। इसके बाद, न्यूरॉन के सतह क्षेत्र की गणना करें। सबसे पहले, फिजी इमेजजे विंडो से फ्री हैंड ड्राइंग टूल का चयन करें।फिर, ब्याज के न्यूरॉन के अंत बिंदुओं को जोड़ें। फिर, विश्लेषण विंडो से उपाय विकल्प का चयन करें। परिणाम चयनित क्षेत्र के लिए मूल्य के साथ एक नए बॉक्स में दिखाई देता है।इस मूल्य को डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में कॉपी करें। अंत में, विश्लेषण कंकाल पथ प्लगइन का उपयोग करके शाखाओं की कुल संख्या की गणना करें। डीए न्यूरॉन्स के dendrites सह द्वारा लेबल थे उनके सोमा में जीएफपी overexpressing और जीएफपी फ्लोरेसेंस इमेजिंग विश्लेषण के लिए dendrite arbors ।डेंड्राइट्स की आकृति को उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इमेज किया गया था। बताया गया कि दा न्यूरॉन्स के डेंजरों का पता लगाया गया । फाइल का इस्तेमाल डेंड्राइट लेंथ का अनुमान लगाने के लिए किया गया था।तीसरे इंस्टार लार्वा में डीए न्यूरॉन्स में Sox102F के मुंह से बाहर होने से शाखा की लंबाई के लगभग आधे और एक सरल संरचना के साथ डेंड्राइट्स की कुल संख्या में उल्लेखनीय कमी आई, जिसमें शाखाओं की केवल आधी संख्या दिखाई गई। तार्किक रूप से, इससे आर्बर सतह क्षेत्र में कमी आई। यह प्रोटोकॉल डीए संवेदी न्यूरॉन्स के विकास का आकलन करने के लिए एक त्वरित विधि प्रदान करता है।इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय, एक अच्छा कवरेज प्राप्त करने के लिए डीए न्यूरॉन्स के प्रत्येक समूह की छवियों की एक पर्याप्त संख्या में लेने के लिए सुनिश्चित हो । इस प्रक्रिया के बाद, डेंड्राइट विश्लेषण जैसे अन्य तरीकों को डेंड्राइट विकास के बारे में अतिरिक्त सवालों के जवाब देने के लिए किया जा सकता है। चूंकि यह विकास है, इस तकनीक ने न्यूरोसाइंस के क्षेत्र में शोधकर्ताओं को अल्जाइमर मॉडल सिस्टम का उपयोग करके न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में अनुमान लगाने में मदद की है।

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

एकाधिक लीब्रा डिजीटल Neuronal आकृति विज्ञान के स्वचालित Sholl विश्लेषण

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

संवर्धित सीएनएस न्यूरॉन्स में वृक्ष के समान रीढ़ आकृति विज्ञान के विश्लेषण

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotypic टुकड़ा संस्कृतियों में Purkinje सेल वृक्ष के समान आकृति विज्ञान के विश्लेषण

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

अर्ध अक्षुण्ण में लेजर रोशनी के साथ तंत्रिका गतिविधि के optogenetic गड़बड़ी<em&gt; ड्रोसोफिला</emप्रस्ताव में&gt; लार्वा

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

ग्लूटामेट और गाबा की फास्ट माइक्रो योणोगिनेसिस: Synaptic एकता की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

चूहे में hippocampal क्षेत्र के दांतेदार गाइरस में वृक्ष के समान द्रुमायण का आकलन

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Neurodegenerative विकारों की एक ड्रोसोफिला मॉडल में घुस दोष के मात्रात्मक विश्लेषण

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

कॉलम और परतों में वृक्ष के समान आकृति विज्ञान का विश्लेषण

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

गोल्गी-कॉक्स विधि का उपयोग करते हुए वृद्ध चूहों में हिप्पोकैम्पल वृक्ष वृत्तीय जटिलता का आकलन

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

मात्रात्मक सेल Neurodegeneration की Drosophila में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन ImageJ का उपयोग कर के निष्पक्ष विश्लेषण के माध्यम से जीवविज्ञान

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...