Name: quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
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Vorremmo ringraziare William A. Eimer per l'assistenza tecnica di imaging. Quest'opera è stata sostenuta da fondo cura morbo di Alzheimer [per R.E.T], il National Institute of Health [R01AG014713 e R01MH60009 a R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 di A.L.] e la National Science Foundation [NSF1455613 a A.L.].

1. preparazione sperimentale
<ol><li>Preparare i seguenti reagenti: tampone fosfato di Dulbecco (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeide (PFA), diluita in 4% prima dell'uso; base di elastomero di silicone e dell'agente indurente; mezzo di montaggio Antifade (ad es., prolungare oro); e smalto per unghie.</li>
	<li>Preparare la seguente attrezzatura: microscopio di dissezione, due taglienti forcipe e un paio di forbici per microdissezione, un numero di pin per microdissezione...

<ol>
	<li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+mammalian+retina.">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li><li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+diversity+among+amacrine+cells:+implications+for+function.">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li><li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons.">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li><li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases.">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li><li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li><li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer's+disease.">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li><li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2.">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li><li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+through+Dishevelled,+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development.">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons.">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li><li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis.">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li><li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase/Furry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons.">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li><li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis.">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li><li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development.">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li><li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis.">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).</li><li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+reversal+of+Alzheimer's+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuriteTracer:+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth.">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li></ol>

Dendriti che innervano l'epidermide sono le regioni ingresso dei neuroni e loro morfologie determinano come informazioni viene ricevuti ed elaborati da singoli neuroni. Morfologia del dendrite di sviluppo riflette la modulazione genica dell'organizzazione di dendrite. Il Drosophila larvale da neurone del sistema nervoso periferico è un modello importante per studiare lo sviluppo di dendrite causa di: 1) la somiglianza funzionale con mammiferi11,12; 2) q...

Dendriti, che sono le proiezioni ramificate di un neurone, coprono il settore che comprende ingressi di neurone sensoriale sinaptica da altri neuroni1,2. Dendriti sono una componente importante della formazione della sinapsi e svolgono un ruolo critico nella integrazione sinaptici ingressi, così come la stimolazione elettrochimica in un neurone di moltiplicazione. Arborization dentritico (da) è un processo mediante il quale i neuroni formano nuovi alberi dendritiche e rami per creare nuove sinapsi. Lo sviluppo e la morfologia da, come la densità di ramo e modelli di raggruppamento, risultato di processi biologici multi-step e sono altamente correlati alla funzione di un neurone. L'obiettivo del presente protocollo è fornire un metodo per l'analisi quantitativa di complessità arborization neuronale dendritric in Drosophila.
La complessità dei dendrites determina i tipi di sinaptici, connettività e gli input dai neuroni di partner. Modelli di ramificazione e la densità dei dendriti sono coinvolti nell'elaborazione dei segnali che convergono sul campo dendritiche3,4. Dendriti hanno la flessibilità per la regolazione in fase di sviluppo. Per esempio, segnalazione sinaptica ha un effetto sull'organizzazione di dendrite nel neurone somatosensory durante la fase di sviluppo e nel sistema nervoso maturo5. L'istituzione di un neurone connettività si basa sulla morfogenesi e la maturazione dei dendrites. Malformazione dei dendriti è associato con alterata funzione di un neurone. Gli studi hanno indicato che l'anomalia della morfogenesi del neurone da potrebbe contribuire alle eziologie multiple malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer (annuncio), malattia di Parkinson (MDP), malattia di Huntington (HD), e morbo di Gehrig / Sclerosi laterale amiotrofica (ALS)6,7,8. Le alterazioni sinaptiche appaiono nella fase iniziale dell'annuncio, in concerto con il declino ed il danno del neurone funzione7,8. Tuttavia, le specifiche di come patologia dendrite contribuisce alla patogenesi di queste malattie neurodegenerative resta sfuggente.
Lo sviluppo dei dendriti è regolato da geni che codificano una complessa rete di autorità di regolamentazione, come la famiglia di Wnt di proteine9,10, fattori di trascrizione e ligandi su cellule recettori di superficie11,12 . Neuroni da Drosophila sono costituiti da quattro classi (classe I, II, III, IV), del quale classe IV da neuroni sono i più complessi modelli di ramificazioni e sono stati impiegati come un potente sistema sperimentale per migliore comprensione morfogenesi13, 14. Durante la morfogenesi precoce, overespressione o RNAi silenziamento di geni in neuroni di classe IV da provocare i cambiamenti nei modelli di ramificazione e dendrite potatura13. È importante sviluppare un metodo pratico per l'analisi quantitativa del arborization dentritico neuronale.
Precedentemente abbiamo indicato che il silenziamento dell'ortologo di Drosophila di SOX5, Sox102F, ha portato alla più brevi dendriti dei neuroni da e ridurre la complessità in classe IV da neuroni15. Qui, presentiamo la procedura di analisi quantitativa per la complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila. Questo protocollo, adattato dalla precedente metodologia descritta, fornisce un metodo breve per analizzare lo sviluppo dei neuroni sensoriali da. Illustra l'etichettatura immagine robusta e il neurone nel terzo instar larvale corpo muro16,17,18,19. È un protocollo prezioso per i ricercatori che desiderano studiare la NDAC e differenze inerenti allo sviluppo in vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Phosphate buffered saline(PBS)</td>
			<td style="width:223px;">Gibco Life Sciences</td>
			<td style="width:197px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:363px;">Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:197px;">15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:363px;">Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent</td>
			<td style="width:223px;">Dow Corning Corportation</td>
			<td style="width:197px;">3097366-0516;3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:363px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fingernail polish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">CVS</td>
			<td style="width:197px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri dish</td>
			<td style="width:223px;">Falcon</td>
			<td style="width:197px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Forceps</td>
			<td style="width:223px;">Dumont</td>
			<td style="width:197px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Insect Pins&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-6082-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:363px;">Microscope slides and cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">15-188-52</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila

Dendriti sono le proiezioni ramificate di un neurone e morfologia dentritica riflette l'organizzazione sinaptica durante lo sviluppo del sistema nervoso. Drosophila larvale arborization dentritico neuronale (da) è un modello ideale per studiare la morfogenesi di dendriti neurali e funzione del gene nello sviluppo del sistema nervoso. Ci sono quattro classi di neuroni da. Classe IV è la più complessa con un modello di ramificazione che copre quasi l'intera superficie della parete del corpo larvale. Precedentemente abbiamo caratterizzato l'effetto di mettere a tacere l'ortologo di Drosophila di SOX5 classe di complessità di un neurone arborization dentritico IV (NDAC) utilizzando quattro parametri: la lunghezza dei dendriti, l'area della superficie di copertura dendrite, il numero totale di rami e la struttura ad albero. Questo protocollo presenta il flusso di lavoro di analisi quantitativa NDAC, composto da dissezione larvale, microscopia confocale e procedure di analisi di immagine utilizzando il software ImageJ. Ulteriore comprensione da sviluppo neuronale e dei suoi meccanismi sottostanti migliorerà la comprensione della funzione di un neurone e fornire indizi circa le cause fondamentali di neurologici e disturbi dello sviluppo neurologico.

I dendriti dei neuroni da sono stati etichettati da co-overexpressing GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) da soma neurale e dendritiche pergole per analisi di imaging di fluorescenza di GFP. La morfologia dei dendriti del neurone da è stato ripreso da un microscopio confocale invertito (Figura 2).
I dendriti dei neuroni da sono stati rintracciati usando il software ImageJ Fiji. Il file è stato utilizzato per ...

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Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Questo protocollo è centrato sull'analisi quantitativa della complessità di un neurone arborization dentritico (NDAC) in Drosophila, che può essere utilizzato per gli studi della morfogenesi dendritica.

Analisi quantitativa di un neurone Arborization dentritico complessità in Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di osservare l'impatto del gene SOX5 sulla complessità dei neuroni di arborizzazione dendritica durante lo sviluppo neuronale in Drosophila. Questo metodo può aiutare a studiare la morfogenesi dei neuro-dendriti e la funzione genica nello sviluppo del sistema nervoso, per comprendere meglio i geni delle malattie neurodegenerative. In definitiva questa tecnica fornisce un'analisi quantitativa della complessità dei dendriti, che può essere utilizzata in molti tipi diversi di neuro-dendriti.Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso il meccanismo genetico della malattia neurodegenerativa, perché la mutazione detiene la chiave per comprendere la funzione genica. Croci di configurazione di UAS-GFP;ppk-GAL4 con i moscerini di deformazione UAS-Sox102F-RNAi o i controlli W118. Cultura le mosche in condizioni standard a 25 gradi Celsius.In circa cinque o sei giorni, utilizzare le forcep per raccogliere attentamente le terze larve instar per la dissezione. Metti una larva in una piastra di dissezione fatta di base di elastomero di silicio e una piastra di Petri per la coltura tissutale. Quindi posizionare il piatto al microscopio a dissezione.Ora inchiodare la coda della larva per esporre la linea mediana. Quindi pin la larva ganci bocca in modo che il lato dorsale della larva è in su. Ora aggiungi 200 microlitri di PBS al piatto per immergere la larva in soluzione.Successivamente, tagliare la coda e la bocca della larva con piccole incisioni. Quindi tagliare la larva aperta lungo la linea mediana dorsale e tra le due trachee, andando dal caudale al rostrale. Quindi posizionare un perno in ciascuno dei quattro angoli del corpo in modo che il corpo giace piatto.Ora fissare la parete corporea della larva in PFA al quattro% per 25 minuti a temperatura ambiente. Quindi lavare la larva con PBS tre volte per cinque minuti per lavaggio. Dopo i lavaggi, rimuovere i perni e trasferire il tessuto su uno scivolo di vetro.Quindi immergere il tessuto nel mezzo di montaggio antifade e montarlo con uno scivolo di copertura. Lasciare asciugare ad aria il tessuto montato per un'ora prima di sigillare sul coperchio scivolare con smalto per unghie. Conservare queste diapositive al buio a quattro gradi Celsius.Cattura immagini della serie Z con un microscopio confocale usando un obiettivo 20X. In primo luogo, impostare l'intervallo dei passaggi z per includere tutti i neuroni DA nella parete del corpo della larva e impostare la dimensione del passo su un mezzo micrometro. Quindi archiviare le immagini come file TIF o ND2 per l'elaborazione.Quindi, valutare il numero e la morfologia dei dendriti sui neuroni DA. Inizia con la valutazione delle loro lunghezze. In primo luogo, in Fiji ImageJ, dividere le immagini in canali separati, se necessario.Solo il canale GFP deve essere valutato. Quindi, fai una proiezione z. Nella nuova finestra selezionare intensità massima per il tipo di proiezione e scegliere le sezioni iniziale e di arresto.Quindi fare clic su OK per produrre un'immagine di proiezione Z con proiezioni di dendrite chiare. Ora traccia i neuriti usando lo strumento plug-in. Per prima cosa, vai al soma del neurone di interesse e fai clic dove emerge una dendrite dal corpo cellulare.Quindi fare clic sulla punta di questa dendrite. Se la linea blu che collega i due punti corre la lunghezza della neurite, premere Y per sì. Quindi, se questa linea si adatta al percorso completo della neurite, fare clic su percorso completo.Se la linea non si adatta al tracciato, fate clic su punti più avanti lungo questa neurite per piegare il tracciato in più segmenti di linea che si adatteranno alla lunghezza della neurite. Quindi, fare clic su percorso completo e procedere con la marcatura del percorso per la neurite successiva. Dopo aver completato tutti i percorsi di tracciatura, selezionare l'opzione Analisi, Misura percorsi per esportare i percorsi in un file CSV.Utilizzare questi dati per calcolare e il valore medio delle lunghezze dei tracciati per l'analisi. Quindi, calcola l'area di superficie del neurone. Per prima cosa, selezionare lo strumento di disegno a mano libera dalla finestra Fiji ImageJ.Quindi, collegare i punti finali del neurone di interesse. Selezionare quindi l'opzione Misura dalla finestra Analizza. Il risultato viene visualizzato in una nuova casella con il valore dell'area selezionata.Copiare questo valore nel software di analisi dei dati. Infine, calcola il numero totale di rami utilizzando il plug-in Analizza percorsi scheletrati. I dendriti dei neuroni DA sono stati etichettati da GFP co-sovraespressiva nei loro pergolati soma e dendrite per l'analisi dell'imaging di florescence GFP.La morfologia dei dendriti è stata immagine usando un microscopio confocale invertito. I dendriti dei neuroni DA sono stati rintracciati come descritto. Il file è stato utilizzato per stimare la lunghezza della dendrite.Il silenziamento di Sox102F nei neuroni DA nella terza larva instar ha portato a una significativa riduzione del numero totale di dendriti con circa la metà della lunghezza del ramo e con una struttura più semplice, mostrando solo la metà del numero di rami. Logicamente, ciò ha portato a una riduzione della superficie del pergolato. Questo protocollo fornisce un metodo rapido per valutare lo sviluppo dei neuroni sensoriali DA.Durante il tentativo di questa procedura, assicurati di prendere un ampio numero di immagini di ogni gruppo di neuroni DA per ottenere una buona copertura. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'analisi della dendrite per rispondere a ulteriori domande sullo sviluppo della dendrite. Fin dal suo sviluppo, questa tecnica ha aiutato i ricercatori nel campo delle neuroscienze a fare deduzioni in malattie neurodegenerative come l'Alzheimer usando sistemi modello.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Ricerca

Neuroscienze

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

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Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
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L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

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Optogenetic Perturbazione di attività neurale con illuminazione laser in semi-intatte<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

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Valutazione della complessità dendritica ippocampale nei topi invecchiati utilizzando il metodo Golgi-Cox

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Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

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Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

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