Name: quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

Vi vil gjerne takke William A. Eimer for bildebehandling kundestøtte. Dette arbeidet ble støttet av kur Alzheimers fondet [R.E.T], National Institute of Health [R01AG014713 og R01MH60009 å R.E.T; R03AR063271 og R15EB019704 til Al], og National Science Foundation [NSF1455613 til Al].

1. eksperimentelle forberedelse
<ol><li>Klargjør følgende reagenser: Dulbeccos fosfat bufret saltvann (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldehyde (PFA), utvannet til 4% før bruk; silikon drivverk og herding agent; Antifade montering medium (f.eksforlenge gull); og negl polsk.</li>
	<li>Klargjør følgende utstyr: disseksjon mikroskop, to skarpe tang og et par saks for microdissection, en antall pinner for microdissection, en Petriskål for å gjøre disseksjon parabol, obj...

<ol>
	<li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+mammalian+retina.">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li><li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+diversity+among+amacrine+cells:+implications+for+function.">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li><li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons.">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li><li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases.">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li><li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li><li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer's+disease.">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li><li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2.">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li><li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+through+Dishevelled,+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development.">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons.">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li><li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis.">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li><li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase/Furry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons.">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li><li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis.">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li><li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development.">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li><li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis.">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).</li><li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+reversal+of+Alzheimer's+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuriteTracer:+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth.">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li></ol>

Dendrites som innervate overhuden er input områdene av neurons, og deres morphologies bestemmer hvordan informasjon er mottatt og behandlet av individuelle neurons. Utvikling dendrite morfologi gjenspeiler genet modulering av dendrite organisasjon. Drosophila larver da Nevron av perifere nervesystemet er en viktig modell for å studere dendrite utvikling fordi: 1) den funksjonell likheten med pattedyr11,12; 2) fire klasseskille basert på dendrite struk...

Dendrites, som forgrenet anslagene av en Nevron, dekker feltet som omfatter nevrons sensoriske og synaptic innspill fra andre neurons1,2. Dendrites er en viktig komponent av synapse formasjon og spille en avgjørende rolle i integrere synaptic innganger, samt spre elektrokjemiske stimulering i en Nevron. Dendrittiske arborization (da) er en prosess som neurons danne nye dendrittiske trær og grener for å opprette nye synapser. Utvikling og morfologi av da, som grenen tetthet og gruppering mønstre, opprettes flere trinn biologiske prosesser og er sterkt korrelert til nevronale funksjon. Målet med denne protokollen er en metode for kvantitativ analyse av neuronal dendritric arborization kompleksitet i Drosophila.
Kompleksiteten i dendrites bestemmer synaptic typer, tilkobling og innspill fra partner neurons. Forgrening mønstre og tetthet av dendrites er involvert i behandler signalene som sammen på dendrittiske feltet3,4. Dendrites har muligheten for justering i utvikling. For eksempel har synaptic signalering en effekt på dendrite organisasjonen somatosensory Nevron under utviklingsfasen og modne nervesystemet5. Etableringen av neuronal tilkobling avhengig av morphogenesis og modning av dendrites. Misdannelse av dendrites er assosiert med svekket neuronal funksjon. Studier har vist at abnormiteten av da neuron morphogenesis kan bidra til etiologies av flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD), og Lou Gehrig sykdom / Amyotrofisk lateral sklerose (ALS)6,7,8. Synaptiske endringer vises i den tidlige fasen av Annonsen, sammen med nedgang og nedskrivning av Nevron funksjon7,8. Informasjon om hvordan dendrite patologi bidrar til patogenesen i disse nevrodegenerative sykdommer er imidlertid fortsatt flyktig.
Utviklingen av dendrites er regulert av gener som koder et kompleks nettverk av regulatorer, som Wnt familie proteiner9,10, transkripsjonsfaktorer og ligander på cellen overflate reseptorer11,12 . Drosophila da neurons består av fire klasser (Class I, II III, IV), av hvilken klasse IV da neurons har mest komplekse forgrening mønstre og har vært ansatt som en kraftig eksperimentelle system for bedre forståelse morphogenesis13, 14. Under tidlig morphogenesis, overuttrykte og/eller RNAi stanse gener i klasse IV da neurons medføre endringer i forgrening mønstre og dendrite beskjæring13. Det er viktig å utvikle en praktisk metode for kvantitativ analyse av neuronal dendrittiske arborization.
Vi har tidligere vist at stanse Drosophila ortholog av SOX5, Sox102F, førte til kortere dendrites av da neurons og redusert kompleksitet i klasse IV da neurons15. Her presenterer vi prosedyren kvantitativ analyse for neuronal dendrittiske arborization kompleksiteten (NDAC) i Drosophila. Denne protokollen, tilpasset fra tidligere beskrevet metodikken, gir en kort metode for å analysen utviklingen av da sensoriske neurons. Det illustrerer den robuste bildet merking og da Nevron i den tredje skikkelsen larver kroppen veggen16,17,18,19. Det er en verdifull protokoll for forskere som ønsker å undersøke NDAC og utviklingsmessige forskjeller i vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Phosphate buffered saline(PBS)</td>
			<td style="width:223px;">Gibco Life Sciences</td>
			<td style="width:197px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:363px;">Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:197px;">15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:363px;">Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent</td>
			<td style="width:223px;">Dow Corning Corportation</td>
			<td style="width:197px;">3097366-0516;3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:363px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fingernail polish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">CVS</td>
			<td style="width:197px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri dish</td>
			<td style="width:223px;">Falcon</td>
			<td style="width:197px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Forceps</td>
			<td style="width:223px;">Dumont</td>
			<td style="width:197px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Insect Pins&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-6082-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:363px;">Microscope slides and cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">15-188-52</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila

Dendrites er forgrenet anslagene av en Nevron dendrittiske morfologi gjenspeiler synaptic organisasjon under utvikling av nervesystemet. Drosophila larver neuronal dendrittiske arborization (da) er en ideell modell for å studere morphogenesis nevrale dendrites og gen funksjon i utviklingen av nervesystemet. Det er fire klasser av da neurons. Klasse IV er de mest komplekse med en forgrening mønster som dekker nesten hele området av larver kroppen veggen. Vi har tidligere preget effekten av silencing Drosophila ortholog av SOX5 i klasse IV neuronal dendrittiske arborization kompleksitet (NDAC) med fire parameterne: lengden på dendrites, areal dendrite dekning, den Totalt antall grener, og strukturen forgrening. Denne protokollen presenterer arbeidsflyten NDAC kvantitativ analyse larver disseksjon, AC confocal mikroskopi og bildet analyse prosedyrer bruker ImageJ programvare. Videre innsikt i da neuronal utvikling og dens underliggende mekanismer vil øke forståelsen av neuronal funksjon og gi hint om de grunnleggende årsakene til nevrologiske og neurodevelopmental lidelser.

Dendrites av da neurons var merket av co-overexpressing GFP (UAS-GFP, ppk-GAL4) i da nevrale soma og dendrittiske arbors til GFP fluorescens imaging analyse. Morfologi av da Nevron dendrites ble avbildet av en invertert AC confocal mikroskop (figur 2).
Dendrites av da neurons var spores ved hjelp av Fiji ImageJ programvare. Filen ble brukt til å beregne dendrite lengden (Figur ...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Denne protokollen fokuserer på kvantitativ analyse av neuronal dendrittiske arborization kompleksitet (NDAC) i Drosophila, som kan brukes for studier av dendrittiske morphogenesis.

Kvantitativ analyse av Neuronal dendrittiske Arborization kompleksitet i Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

Det overordnede målet med denne prosedyren er å observere virkningen av SOX5-genet på kompleksiteten til dendrittiske arboriseringsnevronene under nevronal utvikling i Drosophila. Denne metoden kan bidra til å studere morfogenese av nevrodendritter, og genfunksjonen i utviklingen av nervesystemet, for å bedre forstå nevrodegenerative sykdomsgener. Til syvende og sist gir denne teknikken en kvantitativ analyse av dendrittkompleksiteter, som kan brukes i mange forskjellige typer nevrodektitter.Implikasjonene av denne teknikken strekker seg mot genetisk mekanisme for nevrodegenereringssykdom, fordi mutasjon har nøkkelen til å forstå genfunksjonen. Oppsettskryss av UAS-GFP;ppk-GAL4 med UAS-Sox102F-RNAi-stammefluer eller W118-kontroller. Kultur fluene under standardforhold ved 25 grader Celsius.På omtrent fem til seks dager, bruk tang til å nøye samle de tredje instar larver for disseksjon. Legg en larve i en disseksjonsrett laget av silisiumeastomerbase, og en vevskultur Petriskål. Plasser deretter parabolen under disseksjonsmikroskopet.Nå pin halen av larven for å utsette midtlinjen. Fest deretter larvens munnkroker slik at larvens dorsale side er oppe. Tilsett nå 200 mikroliter PBS i fatet for å senke larven i oppløsning.Deretter kutter halen og munnen av larve med små snitt. Klipp deretter larven åpen langs den dorsale midtlinjen og mellom de to tracheas, går fra caudal til rostral. Legg deretter en pinne på hvert av de fire hjørnene av kroppen slik at kroppen ligger flatt.Nå fikse larven kroppen veggen i fire prosent PFA i 25 minutter ved romtemperatur. Vask deretter larven med PBS tre ganger i fem minutter per vask. Etter vaskene fjerner du pinnene og overfører vevet til et glasssklie.Dypp deretter vevet i antifademonteringsmediet, og monter det med en dekselslipp. La det monterte vevet lufttørke i en time før du forsegler dekselet slip med neglelakk. Lagre disse lysbildene i mørket ved fire grader Celsius.Ta bilder i z-serien med et konfokalt mikroskop ved hjelp av et 20X-mål. Først setter du området for z-trinnene for å inkludere alle DA-nevronene i larvens kroppsvegg, og setter trinnstørrelsen til et halvt mikrometer. Lagre deretter bildene som TIF- eller ND2-filer for behandling.Deretter evaluerer du antall og morfologi av dendrittene på DA-nevronene. Begynn med å vurdere lengdene deres. Først, i Fiji ImageJ, dele bildene i separate kanaler om nødvendig.Bare GFP-kanalen må vurderes. Deretter lager du en z-projeksjon. I det nye vinduet velger du maks intensitet for projeksjonstype, og velger start- og stoppsnittene.Klikk deretter OK for å produsere et z-projeksjonsbilde med klare dendrittprojeksjoner. Spor nå neurites ved hjelp av plug-in-verktøyet. Først går du til soma av neuron av interesse og klikk hvor en dendritt kommer fra cellekroppen.Klikk deretter på spissen av denne dendritten. Hvis den blå linjen som forbinder de to punktene, kjører lengden på neurite, trykker du på Y for ja. Hvis denne linjen passer til hele banen til neurittet, klikker du fullstendig bane.Hvis linjen ikke passer banen, klikker du på punkter videre langs dette neurite for å bøye banen til flere linjesegmenter som passer lengden på neurittet. Deretter klikker du komplett bane og fortsetter med å markere banen for neste neurite. Når du har fullført alle sporingsbanene, velger du alternativet Analyse, Målbaner for å eksportere banene til en CSV-fil.Bruk disse dataene til å beregne og gjennomsnittlig verdi for banelengder for analyse. Deretter beregner du overflaten av nevronen. Velg først frihåndstegningsverktøyet fra Fiji ImageJ-vinduet.Deretter kobler du endepunktene til nevronen av interesse. Velg deretter Alternativet Mål fra Analyser-vinduet. Resultatet vises i en ny boks med verdien for området valgt.Kopier denne verdien til dataanalyseprogramvaren. Til slutt beregner du totalt antall grener ved hjelp av plugin-modulen Analyser skjelettbaner. Dendrittene til DA-nevroner ble merket ved å samtidig overuttrykke GFP i deres soma og dendritt arbors for GFP florescence imaging analyse.Morfologien til dendrittene ble avbildet ved hjelp av et omvendt konfokalt mikroskop. Dendrittene til DA-nevroner ble sporet som beskrevet. Filen ble brukt til å estimere dendrittlengden.Deaktivering av Sox102F i DA nevroner i tredje instar larve førte til en betydelig reduksjon i det totale antall dendritter med omtrent halvparten av grenslengden og med en enklere struktur, som viser bare halvparten av antall grener. Logisk førte dette til reduksjon i arbor overflateareal. Denne protokollen gir en rask metode for å vurdere utviklingen av DA sensoriske nevroner.Mens du prøver denne prosedyren, sørg for å ta et stort antall bilder av hver gruppe da nevroner for å få en god dekning. Etter denne prosedyren kan andre metoder som dendrittanalyse utføres for å svare på flere spørsmål om dendrittutvikling. Siden utviklingen har denne teknikken hjulpet forskere innen nevrovitenskap å gjøre slutninger til nevrodegenerativ sykdom som Alzheimers ved hjelp av modellsystemer.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic forstyrrelse av nevrale aktiviteten med Laser Illumination i Semi-intakt<em&gt; Drosophila</em&gt; Larver in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Fast Micro-iontoforese av glutamat og GABA: Et nyttig verktøy for å etterforske Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Vurdering av Dendritic arborization i Dentate Gyrus av hippocampus regionen i Mus

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Kvantitativ analyse av Klatring Defekter i en Drosophila Model nevrodegenerative lidelser

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analysere Dendritic Morfologi i kolonner og Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Vurdering av hippocampal dendritisk kompleksitet hos gamle mus ved bruk av Golgi-Cox-metoden

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Kvantitativ cellebiologi mentalt tilbakestående da i Drosophila gjennom objektiv analyse av Fluorescently merket proteiner med ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...