Name: quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer William A. Eimer para assistência técnica de imagem. Este trabalho foi financiado pelo fundo a cura a doença de Alzheimer [a R.E.T], o Instituto Nacional de saúde [R01AG014713 e R01MH60009 para R.E.T; R03AR063271 e R15EB019704 para A.L.] e a National Science Foundation [NSF1455613 para A.L.].

1. preparação experimental
<ol><li>Preparem-se os seguintes reagentes: tampão fosfato de Dulbecco salino (PBS); Triton X-100; 0,2% PBST (PBS + 0,2% Triton X-100); 32% paraformaldeído (PFA), diluído em 4% antes do uso; base de elastômero de silicone e agente de cura; meio de montagem antidesgaste (por exemplo, prolongar a ouro); e unha polonês.</li>
	<li>Preparar os seguintes equipamentos: microscópio de dissecação, dois afiada fórceps e um par de tesouras para microdissection, um número de pinos pa...

<ol>
	<li>Wassle, H., Boycott, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+architecture+of+the+mammalian+retina.">Functional architecture of the mammalian retina.</a> Physiol Rev. 71 (2), 447-480 (1991).</li><li>MacNeil, M. A., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extreme+diversity+among+amacrine+cells:+implications+for+function.">Extreme diversity among amacrine cells: implications for function.</a> Neuron. 20 (5), 971-982 (1998).</li><li>Losonczy, A., Makara, J. K., Magee, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+dendritic+plasticity+and+input+feature+storage+in+neurons.">Compartmentalized dendritic plasticity and input feature storage in neurons.</a> Nature. 452 (7186), 436-441 (2008).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nat Rev Neurosci. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Jaworski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+microtubules+regulate+dendritic+spine+morphology+and+synaptic+plasticity.">Dynamic microtubules regulate dendritic spine morphology and synaptic plasticity.</a> Neuron. 61 (1), 85-100 (2009).</li><li>Kweon, J. H., Kim, S., Lee, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cellular+basis+of+dendrite+pathology+in+neurodegenerative+diseases.">The cellular basis of dendrite pathology in neurodegenerative diseases.</a> BMB Rep. 50 (1), 5-11 (2016).</li><li>Baloyannis, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+pathology+in+Alzheimer's+disease.">Dendritic pathology in Alzheimer's disease.</a> J Neurol Sci. 283 (1-2), 153-157 (2009).</li><li>Masliah, E., Terry, R. D., Alford, M., DeTeresa, R., Hansen, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+and+subcortical+patterns+of+synaptophysinlike+immunoreactivity+in+Alzheimer's+disease.">Cortical and subcortical patterns of synaptophysinlike immunoreactivity in Alzheimer's disease.</a> Am J Pathol. 138 (1), 235-246 (1991).</li><li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2.">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li><li>Rosso, S. B., Sussman, D., Wynshaw-Boris, A., Salinas, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+through+Dishevelled,+Rac+and+JNK+regulates+dendritic+development.">Wnt signaling through Dishevelled, Rac and JNK regulates dendritic development.</a> Nat Neurosci. 8 (1), 34-42 (2005).</li><li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+levels+of+the+homeodomain+protein+cut+regulate+distinct+dendrite+branching+patterns+of+Drosophila+multidendritic+neurons.">Different levels of the homeodomain protein cut regulate distinct dendrite branching patterns of Drosophila multidendritic neurons.</a> Cell. 112 (6), 805-818 (2003).</li><li>Sugimura, K., Satoh, D., Estes, P., Crews, S., Uemura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+morphological+diversity+of+dendrites+in+Drosophila+by+the+BTB-zinc+finger+protein+abrupt.">Development of morphological diversity of dendrites in Drosophila by the BTB-zinc finger protein abrupt.</a> Neuron. 43 (6), 809-822 (2004).</li><li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Branching+out:+mechanisms+of+dendritic+arborization.">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li><li>Sears, J. C., Broihier, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FoxO+regulates+microtubule+dynamics+and+polarity+to+promote+dendrite+branching+in+Drosophila+sensory+neurons.">FoxO regulates microtubule dynamics and polarity to promote dendrite branching in Drosophila sensory neurons.</a> Dev Biol. 418 (1), 40-54 (2016).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silencing+of+the+Drosophila+ortholog+of+SOX5+leads+to+abnormal+neuronal+development+and+behavioral+impairment.">Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 leads to abnormal neuronal development and behavioral impairment.</a> Hum Mol Genet. 26 (8), 1472-1482 (2017).</li><li>Misra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genome-Wide+Screen+for+Dendritically+Localized+RNAs+Identifies+Genes+Required+for+Dendrite+Morphogenesis.">A Genome-Wide Screen for Dendritically Localized RNAs Identifies Genes Required for Dendrite Morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 6 (8), 2397-2405 (2016).</li><li>Emoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+dendritic+branching+and+tiling+by+the+Tricornered-kinase/Furry+signaling+pathway+in+Drosophila+sensory+neurons.">Control of dendritic branching and tiling by the Tricornered-kinase/Furry signaling pathway in Drosophila sensory neurons.</a> Cell. 119 (2), 245-256 (2004).</li><li>Olesnicky, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+use+of+RNA-binding+proteins+in+Drosophila+sensory+neuron+dendrite+morphogenesis.">Extensive use of RNA-binding proteins in Drosophila sensory neuron dendrite morphogenesis.</a> G3 (Bethesda). 4 (2), 297-306 (2014).</li><li>Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+bantam+functions+in+epithelial+cells+to+regulate+scaling+growth+of+dendrite+arbors+in+drosophila+sensory+neurons.">The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in drosophila sensory neurons.</a> Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecules+and+mechanisms+of+dendrite+development+in+Drosophila.">Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila.</a> Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).</li><li>Jinushi-Nakao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knot/Collier+and+cut+control+different+aspects+of+dendrite+cytoskeleton+and+synergize+to+define+final+arbor+shape.">Knot/Collier and cut control different aspects of dendrite cytoskeleton and synergize to define final arbor shape.</a> Neuron. 56 (6), 963-978 (2007).</li><li>Crozatier, M., Vincent, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+multidendritic+neuron+differentiation+in+Drosophila:+the+role+of+Collier.">Control of multidendritic neuron differentiation in Drosophila: the role of Collier.</a> Dev Biol. 315 (1), 232-242 (2008).</li><li>Copf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+gene+dosage+in+controlling+dendritic+arbor+formation+during+development.">Importance of gene dosage in controlling dendritic arbor formation during development.</a> Eur J Neurosci. 42 (6), 2234-2249 (2015).</li><li>Rosso, S. B., Inestrosa, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=WNT+signaling+in+neuronal+maturation+and+synaptogenesis.">WNT signaling in neuronal maturation and synaptogenesis.</a> Front Cell Neurosci. 7, 103 (2013).</li><li>Engel, T., Hernandez, F., Avila, J., Lucas, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Full+reversal+of+Alzheimer's+disease-like+phenotype+in+a+mouse+model+with+conditional+overexpression+of+glycogen+synthase+kinase-3.">Full reversal of Alzheimer's disease-like phenotype in a mouse model with conditional overexpression of glycogen synthase kinase-3.</a> J Neurosci. 26 (19), 5083-5090 (2006).</li><li>Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+Neurite+Tracer:+open+source+software+for+reconstruction,+visualization+and+analysis+of+neuronal+processes.">Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes.</a> Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).</li><li>Pool, M., Thiemann, J., Bar-Or, A., Fournier, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuriteTracer:+a+novel+ImageJ+plugin+for+automated+quantification+of+neurite+outgrowth.">NeuriteTracer: a novel ImageJ plugin for automated quantification of neurite outgrowth.</a> J Neurosci Methods. 168 (1), 134-139 (2008).</li></ol>

Dendritos que inervam a epiderme são as regiões de entrada dos neurônios, e suas morfologias determinam como a informação é recebida e processada pelos neurônios individuais. Morfologia do dendrito de desenvolvimento reflete a modulação de gene da organização dendrito. Larval da drosófila neurônio do sistema nervoso periférico é um modelo importante para estudar o desenvolvimento dendrito por causa de: 1) a similaridade funcional com mamíferos11,<sup class="xref...

Dendrites, que são as projeções ramificadas de um neurônio, cobrem o campo que engloba do neurônio sensorial e sináptica insumos de outros neurônios1,2. Dendritos são um componente importante da formação de sinapse e desempenham um papel fundamental na integração de entradas synaptic, bem como a propagação do estímulo eletroquímico em um neurônio. Arborização dendrítica (da) é um processo pelo qual os neurônios formam novas árvores dendríticas e galhos para criar novas sinapses. O desenvolvimento e a morfologia da da, tais como a densidade de ramo e padrões de agrupamento, resultam de processos biológicos de várias etapas e estão altamente correlacionados com a função neuronal. O objetivo do presente protocolo é fornecer um método de análise quantitativa de complexidade de arborização dendritric neuronal em drosófila.
A complexidade dos dendritos determina os tipos sinápticos, conectividade e entradas de neurônios do parceiro. Padrões de ramificação e a densidade dos dendritos estão envolvidos no processamento dos sinais que convergem para o campo dendríticas3,4. Dendrites têm a flexibilidade para o ajuste no desenvolvimento. Por exemplo, sinalização sináptica tem um efeito sobre a organização do dendrito no neurônio somatossensorial durante a fase de desenvolvimento e no sistema nervoso maduro5. O estabelecimento de conectividade neuronal baseia-se na morfogênese e maturação dos dendritos. Malformação de dendrites está associada com compromisso da função neuronal. Estudos têm mostrado que a anormalidade da morfogênese de neurônio da pode contribuir para as etiologias de várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Alzheimer (AD), a doença de Parkinson (PD), a doença de Huntington (HD) e doença de Gehrig / Esclerose lateral amiotrófica (ela)6,7,8. Sinápticas alterações aparecem na fase inicial do AD, em concerto com o declínio e o comprometimento da função de neurônio7,8. No entanto, os detalhes de como patologia dendrito contribui para a patogênese nestas doenças neurodegenerativas continua elusiva.
O desenvolvimento dos dendritos é regulado por genes que codificam uma complexa rede de reguladores, como a família de Wnt de proteínas9,10, fatores de transcrição e ligantes de receptores de superfície de célula11,12 . Neurônios da drosófila consistem em quatro classes (classe I, II, III, IV), de qual classe IV da neurônios têm os padrões mais complexos de ramificação e têm sido empregados como um poderoso sistema experimental para melhor compreensão morfogênese13, 14. Durante a morfogênese cedo, superexpressão e/ou RNAi silenciamento de genes nos neurônios da classe IV resulta em alterações nos padrões de ramificação e dendrito poda13. É importante desenvolver um método prático de análise quantitativa da arborização dendrítica neuronal.
Anteriormente mostramos que silenciar da Drosophila ortholog de SOX5, Sox102F, levou a menores dendritos de neurônios da e complexidade reduzida em classe IV de neurônios da15. Aqui, apresentamos o procedimento de análise quantitativa para a complexidade de arborização dendrítica neuronal (NDAC) em Drosophila. Este protocolo, adaptado a partir da metodologia descrita anterior, fornece um método breve para ensaiar o desenvolvimento de neurônios sensoriais da. Ele ilustra a imagem robusta a rotulagem e o neurônio no terceiro ínstar larval parede corporal16,17,18,19. É um protocolo valioso para pesquisadores que desejam investigar o NDAC as diferenças no desenvolvimento e na vivo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:949px;" width="948">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Phosphate buffered saline(PBS)</td>
			<td style="width:223px;">Gibco Life Sciences</td>
			<td style="width:197px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">TritonX-100</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">9002-93-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:363px;">Paraformaldehyde(PFA)</td>
			<td style="width:223px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:197px;">15714-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:29px;width:363px;">Sylgard 184 silicone elastomer base and curing agent</td>
			<td style="width:223px;">Dow Corning Corportation</td>
			<td style="width:197px;">3097366-0516;3097358-1004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:25px;width:363px;">ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td style="width:223px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Fingernail polish&#160;</td>
			<td style="width:223px;">CVS</td>
			<td style="width:197px;">72180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Stereo microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">SMZ800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:223px;">Nikon</td>
			<td style="width:197px;">Eclipse Ti-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Petri dish</td>
			<td style="width:223px;">Falcon</td>
			<td style="width:197px;">353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Forceps</td>
			<td style="width:223px;">Dumont</td>
			<td style="width:197px;">11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Scissors&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-5611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:363px;">Insect Pins&#160;</td>
			<td style="width:223px;">Roboz Surgical Instrument Co</td>
			<td style="width:197px;">RS-6082-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:19px;width:363px;">Microscope slides and cover slips</td>
			<td style="width:223px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:197px;">15-188-52</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative analysis of neuronal dendritic arborization complexity in drosophila

Dentritos são as projeções ramificadas de um neurônio, e morfologia dendrítica reflete organização sináptica durante o desenvolvimento do sistema nervoso. Drosófila larval neuronal dendrítica arborização (da) é um modelo ideal para o estudo de morfogênese de dendrites neurais e função dos genes no desenvolvimento do sistema nervoso. Existem quatro classes de neurônios da. Classe IV é a mais complexa, com um padrão de ramificação que cobre quase toda a área da parede do corpo larval. Nós anteriormente têm caracterizado o efeito de silenciamento da Drosophila ortholog de SOX5 na classe de complexidade de arborização dendrítica neuronal de IV (NDAC) usando quatro parâmetros: o comprimento de dendrites, a área de superfície de cobertura dendrito, o número total de galhos e a estrutura de ramificação. Este protocolo apresenta o fluxo de trabalho de análise quantitativa NDAC, consistindo de dissecação larval, microscopia confocal e procedimentos de análise de imagem usando o software ImageJ. Mais introspecção da desenvolvimento neuronal e seus mecanismos subjacentes irá melhorar a compreensão da função neuronal e fornecem pistas sobre as causas fundamentais da neurológicas e transtornos do desenvolvimento neurológico.

Os dendritos dos neurônios da foram rotulados por co-superexpressão GFP (UAS-GFP; ppk-GAL4) no da soma neural e dendríticas mandris para fluorescência de GFP, análise de imagem. A morfologia dos dendritos do neurônio da foi fotografada por um microscópio confocal invertido (Figura 2).
Os dendritos dos neurônios da foram rastreados usando software ImageJ Fiji. O arquivo foi usado para estimar...

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Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Este protocolo centra-se na análise quantitativa de complexidade arborização dendrítica neuronal (NDAC) em Drosophila, que pode ser usado para estudos da morfogênese dendrítica.

Análise quantitativa da arborização dendrítica Neuronal complexidade em Drosophila

Dendrites are the branched projections of a neuron, and dendritic morphology reflects synaptic organization during the development of the nervous system. ...

O objetivo geral deste procedimento é observar o impacto do gene SOX5 na complexidade dos neurônios de arborização dendrítica durante o desenvolvimento neuronal em Drosophila. Este método pode ajudar a estudar a morfogênese de neurodndritos, e a função genética no desenvolvimento do sistema nervoso, para entender melhor os genes da doença neurodegenerativa. Em última análise, esta técnica fornece uma análise quantitativa da complexidade dos dendritos, que pode ser usada em muitos tipos diferentes de neurodíritos.As implicações dessa técnica se estendem para o mecanismo genético da doença neurodegenerativa, pois a mutação é a chave para entender a função genética. Cruzes de configuração de UAS-GFP;ppk-GAL4 com a cepa UAS-Sox102F-RNAi voa ou controles W118. Cultura as moscas sob condições padrão a 25 graus Celsius.Em cerca de cinco a seis dias, use fórceps para coletar cuidadosamente a terceira larva instar para dissecção. Coloque uma larva em uma placa de dissecção feita de base de elastômero de silício, e uma placa de Petri de cultura tecidual. Em seguida, coloque o prato sob o microscópio de dissecção.Agora fixe a cauda da larva para expor a linha média. Em seguida, fixar os ganchos da boca larva para que o lado dorsal da larva esteja para cima. Agora adicione 200 microliters de PBS ao prato para imergir a larva na solução.Em seguida, corte a cauda e a boca da larva com pequenas incisões. Em seguida, corte a larva aberta ao longo da linha dorsal e entre as duas traqueias, indo de caudal para rostral. Em seguida, coloque um alfinete em cada um dos quatro cantos do corpo para que o corpo fique plano.Agora conserte a parede do corpo da larva em 4% de PFA por 25 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave a larva com PBS três vezes por cinco minutos por lavagem. Após as lavagens, remova os pinos e transfira o tecido para uma lâmina de vidro.Em seguida, mergulhe o tecido em meio de montagem antifado e monte-o com um deslizamento de tampa. Deixe o tecido montado secar por uma hora antes de selar o deslizamento da tampa com polimento das unhas. Armazene esses slides no escuro a quatro graus Celsius.Capture imagens da série Z com um microscópio confocal usando um objetivo de 20X. Primeiro, defina o alcance dos passos z para incluir todos os neurônios da DA na parede do corpo da larva, e defina o tamanho do passo para meio micrômetro. Em seguida, armazene as imagens como arquivos TIF ou ND2 para processamento.Em seguida, avalie o número e a morfologia dos dendritos nos neurônios da promotoria. Comece avaliando seus comprimentos. Primeiro, em Fiji ImageJ, divida as imagens em canais separados, se necessário.Apenas o canal GFP precisa ser avaliado. Em seguida, faça uma projeção z. Na nova janela, selecione a intensidade máxima para o tipo de projeção e escolha as fatias de partida e parada.Em seguida, clique em OK para produzir uma imagem de projeção z com projeções claras de dendrite. Agora rastreie os neurites usando a ferramenta plug-in. Primeiro, vá para a soma do neurônio de interesse e clique onde um dendrite emerge do corpo celular.Em seguida, clique na ponta deste dendrite. Se a linha azul que liga os dois pontos correr o comprimento do neurite, pressione Y para sim. Em seguida, se esta linha se encaixa no caminho completo do neurite, clique em caminho completo.Se a linha não se encaixar no caminho, clique em pontos mais ao longo deste neurite para dobrar o caminho em vários segmentos de linha que se encaixarão no comprimento do neurite. Em seguida, clique em caminho completo e proceda com a marcação do caminho para o próximo neurite. Depois de completar todos os caminhos de rastreamento, selecione a opção Analisar caminhos, medir caminhos para exportar os caminhos para um arquivo CSV.Use esses dados para calcular e o valor médio dos comprimentos do caminho para análise. Em seguida, calcule a área da superfície do neurônio. Primeiro, selecione a ferramenta de desenho manual livre na janela Fiji ImageJ.Em seguida, conecte os pontos finais do neurônio de interesse. Em seguida, selecione a opção Medir na janela Analisar. O resultado aparece em uma nova caixa com o valor para a área selecionada.Copie esse valor para o software de análise de dados. Finalmente, calcule o número total de ramos usando o plugin Analyze Skeletonized Paths. Os dendritos dos neurônios da DA foram rotulados por co-superexpressão GFP em suas arbors soma e dendrito para análise de imagens de floresnce GFP.A morfologia dos dendritos foi imagem usando um microscópio confocal invertido. Os dendritos dos neurônios da promotoria foram rastreados como descrito. O arquivo foi usado para estimar o comprimento do dendrite.O silenciamento de Sox102F em neurônios da na terceira larva instar levou a uma redução significativa no número total de dendritos com cerca de metade do comprimento do ramo e com uma estrutura mais simples, mostrando apenas metade do número de ramos. Logicamente, isso levou à redução da área da superfície da árvore. Este protocolo fornece um método rápido para avaliar o desenvolvimento de neurônios sensoriais da DA.Ao tentar este procedimento, certifique-se de tirar um grande número de imagens de cada grupo de neurônios da promotoria para obter uma boa cobertura. Após este procedimento, outros métodos como a análise de dendrite podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais sobre o desenvolvimento dendrite. Desde o seu desenvolvimento, essa técnica tem ajudado pesquisadores do campo das neurociências a fazer inferências em doenças neurodegenerativas, como o Alzheimer usando sistemas modelo.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantitative Analysis of Neuronal Dendritic Arborization Complexity in Drosophila

Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Análise Sholl automatizado de Morfologia Neuronal Digitized em múltiplas escalas

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

Neurociência

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Análise de Morfologia Spine dendríticas em neurônios cultivados CNS

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Optogenetic Perturbação da atividade neural com Iluminação Laser no Semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; As larvas in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

Rápido Micro-iontoforese de glutamato e GABA: uma ferramenta útil para investigar Integração Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Assessment of Dendritic Arborization in the Dentate Gyrus of the Hippocampal Region in Mice

Avaliação de dendríticas Arborização no giro dentado do hipocampo em Ratos Região

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity ...

Quantitative Analysis of Climbing Defects in a Drosophila Model of Neurodegenerative Disorders

Análise Quantitativa de Defeitos de escalada em um modelo de Drosophila de doenças neurodegenerativas

Locomotive defects resulting from neurodegenerative disorders can be a late onset symptom of disease, following years of subclinical degeneration, and ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

Analisando dendríticas Morfologia em Colunas e Camadas

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Avaliação da complexidade dendrítica do hipocampo em ratos idosos usando o método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Biologia celular quantitativa de neurodegeneração em Drosophila , através de uma análise imparcial das proteínas fluorescente etiquetadas usando o ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...