Name: adaptation of hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics to mammalian cells
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par les NIH subventions P50HG004952 et R01GM109099 à Mo.

1. capturer oligonucléotide Design
<ol><li>
Concevoir un panneau d’oligonucléotides à utiliser lors de la prise de l’hybridation de la région cible/s.
	<ol>
<li>Visent à concevoir des oligonucléotides de 4 à 8 par région cible, mais au moins, au moins un oligonucléotide ciblant chaque extrémité de la région cible de conception.</li>
		<li>Si la séquence cible est longue (> 500 paires de bases), concevoir les oligonucléotides comme étalé que possible pour assurer l’enrichissement e...

<ol>
	<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. 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P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+budding+yeast+chromatin-associated+interactome.">Defining the budding yeast chromatin-associated interactome.</a> Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proteomic+Investigation+of+Chromatin+Functional+Domains+Reveals+Novel+Synergisms+among+Distinct+Heterochromatin+Components.">The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).</li><li>Wang, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+captured+by+ChIP-mass+spectrometry+are+linked+to+dosage+compensation+in+Drosophila.">Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).</li><li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. 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Co. 439 (1), 132-136 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Capture+of+Chromatin+Interactions+by+Biotinylated+dCas9.">In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9.</a> Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).</li><li>Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-APEX-mediated+proximity+labeling+enables+discovery+of+proteins+associated+with+a+predefined+genomic+locus+in+living+cells.">CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>D&#233;jardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li><li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Protein-DNA+Interactions+in+Human+Alphoid+Chromatin+via+Hybridization+Capture+and+Mass+Spectrometry.">Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li><li>Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+programmable+release+of+captured+DNA.">Multiplexed programmable release of captured DNA.</a> Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).</li><li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+(enChIP)+using+CRISPR.">Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).</li><li>Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Proteomics+Approach+for+the+Discovery+of+Chromatin-associated+Protein+Networks.">A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).</li></ol>

La méthode HyCCAPP décrite ici a plusieurs caractéristiques uniques qui en font une approche puissante pour découvrir les interactions ADN-qui resteraient autrement insaisissables. La nature du processus donne HyCCAPP la possibilité de travailler dans divers organismes et régions du génome. Il s’agit d’une méthode, mais qui a plusieurs limites à prendre en considération.
HyCCAPP est une méthode qui évite toute modification de la cellule afin qu’il peut potentiellement être a...

Au cours de la dernière décennie, il a vu une amélioration spectaculaire des technologies de séquençage, ce qui permet l’étude d’un large éventail des génomes dans un grand nombre d’échantillons et avec une résolution étonnante. Le Consortium de l’Encyclopédie des éléments de l’ADN (Encoder), un effort de plusieurs établissement à grande échelle mené par le National Human Genome Research Institute de la National Institutes of Health, a permis de mieux comprendre comment les facteurs de transcription et autres protéines régulatrices lient à et d’interagissent avec le génome. L’effort initial caractérise les interactions ADN-protéines spécifiques, tels qu’évalués par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour plus de 100 connus de protéines de liaison à l’ADN1. Les méthodes alternatives comme la DNase empreinte2 et formaldéhyde assistée isolement des éléments régulateurs (FAIRE)3 ont également été utilisés pour localiser les régions spécifiques du génome en interaction avec les protéines, mais avec la restriction évidente qui ces approches expérimentales n’identifient pas les protéines qui interagissent. Malgré les efforts considérables au cours des dernières années, aucune technologie n’est apparu qu’efficace permet la caractérisation complète des interactions protéine-ADN en chromatine et l’identification et la quantification des protéines associées à la chromatine.
Pour répondre à ce besoin, nous avons développé une approche originale qui nous qualifiées de protéines de Hybridization Capture of Chromatin-Associated pour la protéomique (HyCCAPP). Initialement développée en levure4,5,6, l’approche isole des régions de chromatine réticulée d’intérêt (avec des protéines de liés) à l’aide de capture de séquences spécifiques hybridation. Après l’isolement des complexes protéine-ADN, approches telles que la spectrométrie de masse peuvent être utilisés pour caractériser l’ensemble des protéines liées à la séquence d’intérêt. Ainsi, la HyCCAPP peut être considéré comme une approche impartiale pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine, en ce sens qu’il ne s’appuie pas sur les anticorps et il est complètement agnostique sur les protéines qui se trouvent. Il existe d’autres approches capables de découvrir roman interaction ADN protéines7, mais s’appuient plus sur puce comme méthodes8,9,10, plasmide insertions11,12, 13,14, ou régions à haute copie numéros15. En revanche, HyCCAPP peut être appliqué aux régions de multi - et unique-copy, et il ne nécessite aucune information préalable sur les protéines dans la région. En outre, bien que certaines des méthodes mentionnées ci-dessus ont des caractéristiques précieuses, notamment en évitant la nécessité pour des réactions de réticulation ADN-protéine, la caractéristique unique de HyCCAPP est qu’il peut être appliqué aux régions de la simple copie de non modifié cellules et sans aucune connaissances préalables sur les protéines de liaison putatif ou anticorps disponibles.
À ce stade, HyCCAPP a surtout été appliquée à l’analyse des différentes régions génomiques de levure4,5,6et a récemment été utilisée pour analyser les interactions protéine-ADN dans l’ADN de l’alpha-satellite, une région de répétition dans le génome humain16. Dans le cadre de nos travaux en cours, nous avons adapté la méthode de capture hybridation initialement développée pour la chromatine de levure être applicable à l’analyse des cellules humaines et vous présente ici un protocole modifié qui permet la capture sélective de la simple copie cible régions du génome humain avec des rendements similaires à nos premières études chez les levures. Ce nouveau protocole optimisé permet maintenant l’adaptation et l’utilisation de la technologie pour interroger des interactions protéine-ADN dans le génome humain, à l’aide de la spectrométrie de masse ou d’autres approches analytiques.
Il est important de souligner que la méthode HyCCAPP est destinée à l’analyse des régions cibles spécifiques et n’est pas encore adaptée aux analyses du génome. La technologie est particulièrement utile lorsqu’il s’agit avec les régions pour lesquelles il y a des informations limitées sur les protéines qui interagissent, ou lorsque vous souhaitez une analyse plus détaillée et approfondie des protéines qui interagissent dans un locus de génome spécifique. HyCCAPP est destiné à découvrir les protéines de liaison à l’ADN, mais pas caractériser avec précision les sites de fixation de protéines spécifiques dans l’ADN génomique. Dans son implémentation actuelle, la méthode ne fournit pas d’informations sur les séquences d’ADN ou des motifs pour protéines individuelles. Donc, il bien complète des technologies existantes telles que FAIRE et peut permettre l’identification des protéines liant le roman en régions génomiques identifiés par une analyse initiale de la FAIRE.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PrimerQuest tool</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Analyze capture oligonucleotids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PairFold</td>
			<td>UBC</td>
			<td></td>
			<td>Analyze interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>850 cm2 roller bottle&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>680058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller system</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>22-288-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson digital sonifier SFX 150</td>
			<td>Emerson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 5M</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12301D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 atreptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>SciGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube shaker and rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>415110Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC buffer 20&#215; concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics to mammalian cells

La capture de l’hybridation des protéines associées à la chromatine de technologie protéomique (HyCCAPP) a été initialement développée pour découvrir de nouvelles interactions ADN-protéine dans la levure. Il permet l’analyse d’une zone cible d’intérêt sans besoin de connaissances préalables sur les protéines probables lié à la région cible. Ceci, en théorie, permet HyCCAPP à utiliser pour analyser n’importe quelle région génomique d’intérêt, et il fournit suffisamment de souplesse pour travailler dans les systèmes cellulaires différentes. Cette méthode n’est pas destinée à étudier des sites de liaison connue des facteurs de transcription, une tâche mieux adaptée à l’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) et les méthodes de type puce. La force de HyCCAPP réside dans sa capacité à explorer des régions d’ADN pour lesquels il existe peu ou aucune connaissance sur les protéines lié à elle. Il peut également être une méthode pratique pour éviter les biais (présent dans la puce comme méthodes) introduits par un enrichissement de la chromatine à base de protéines en utilisant des anticorps. Potentiellement, l’HyCCAPP peut être un outil puissant pour découvrir véritablement nouvelles interactions ADN-protéines. A ce jour, la technologie a été principalement appliquée aux cellules de levure ou de séquences répétées de copie élevée dans les cellules de mammifères. Pour devenir un outil puissant que nous envisageons, HyCCAPP approches doivent être optimisées pour capturer efficacement les loci de l’exemplaire unique dans les cellules de mammifères. Ici, nous présentons notre adaptation de la levure initiale HyCCAPP protocole de lignées cellulaires humaines de capture et montrent que les régions de chromatine exemplaire unique peuvent être efficacement isolées avec ce protocole modifié.

En raison de la nécessité pour les grandes quantités d’entrée de la chromatine de HyCCAPP réussir, les cellules sont cultivées à des niveaux relativement élevés de confluence. Trypan coloration bleu est utilisée pour confirmer que le taux de mort cellulaire sont modérés (< 10 %). Dans les expériences de l’exemplaire unique, contenu de chromatine avant l’hybridation capture doit être dans la plage de femtomolar, qui exige habituellement au moins 109 cellules ...

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Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

Il s’agit d’une méthode pour identifier de nouvelles protéines interagissant avec ADN loci cible spécifique, en s’appuyant sur la capture de séquences spécifiques de chromatine réticulée pour analyses protéomiques ultérieures. Aucune connaissance préalable de protéines de liaison potentielle, ni modifications cellulaires ne sont nécessaires. Initialement développé pour la levure, la technologie a été adaptée pour les cellules mammifères.

Adaptation de l’hybridation prise de protéines associées à la chromatine pour la protéomique pour les cellules de mammifères

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Méthyl-liaison par capture d&#39;ADN de séquençage pour les tissus du patient

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Recherche

Génétique

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l&#39;oxygène

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

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The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

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Génération de chromatine Genome-wide Conformation Capture bibliothèques d’embryons de drosophile début étroitement mise en scène

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

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The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

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