Name: adaptation of hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics to mammalian cells
Uploaded: 2018-06-01T13:30:00
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이 작품 NIH 교부 금 P50HG004952와 모에 R01GM109099에 의해 지원 되었다

1. 캡처 Oligonucleotide 디자인
<ol><li>
대상 지역/s의 하이브리드 캡처 동안 사용할 oligonucleotides의 패널 디자인.
	<ol>
<li>4-8 oligonucleotides 대상 지역, 그러나 최소한 디자인, 하나 이상의 oligonucleotide 대상 영역의 각 끝을 대상으로 디자인을 목표로 합니다.</li>
		<li>대상 시퀀스는 긴 경우 (> 500의 기본적인 쌍), 전체 대상 지역 chromatin의 효과적인 농축을 최대한 밖으로 보기로 oligonucleotides 디?...

<ol>
	<li>Consortium, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome.">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2013).</li><li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAse+footprinting:+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity.">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Res. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li><li>Simon, J. M., Giresi, P. G., Davis, I. J., Lieb, J. 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P., Fillingham, J., Siahbazi, M., Greenblatt, J., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+budding+yeast+chromatin-associated+interactome.">Defining the budding yeast chromatin-associated interactome.</a> Mol Syst Biol. 6, 448 (2010).</li><li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Proteomic+Investigation+of+Chromatin+Functional+Domains+Reveals+Novel+Synergisms+among+Distinct+Heterochromatin+Components.">The Proteomic Investigation of Chromatin Functional Domains Reveals Novel Synergisms among Distinct Heterochromatin Components.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (3), 764-780 (2013).</li><li>Wang, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+proteins+captured+by+ChIP-mass+spectrometry+are+linked+to+dosage+compensation+in+Drosophila.">Chromatin proteins captured by ChIP-mass spectrometry are linked to dosage compensation in Drosophila.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (2), 202-209 (2013).</li><li>Byrum, S. D., Raman, A., Taverna, S. D., Tackett, A. 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Co. 439 (1), 132-136 (2013).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Capture+of+Chromatin+Interactions+by+Biotinylated+dCas9.">In Situ Capture of Chromatin Interactions by Biotinylated dCas9.</a> Cell. 170 (5), 1028-1043 (2017).</li><li>Myers, S. A., Wright, J., Zhang, F., Carr, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-APEX-mediated+proximity+labeling+enables+discovery+of+proteins+associated+with+a+predefined+genomic+locus+in+living+cells.">CRISPR/Cas9-APEX-mediated proximity labeling enables discovery of proteins associated with a predefined genomic locus in living cells.</a> bioRxiv. , (2017).</li><li>D&#233;jardin, J., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Proteins+Associated+with+Specific+Genomic+Loci.">Purification of Proteins Associated with Specific Genomic Loci.</a> Cell. 136 (1), 175-186 (2009).</li><li>Buxton, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elucidating+Protein-DNA+Interactions+in+Human+Alphoid+Chromatin+via+Hybridization+Capture+and+Mass+Spectrometry.">Elucidating Protein-DNA Interactions in Human Alphoid Chromatin via Hybridization Capture and Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 16 (9), 3433-3442 (2017).</li><li>Kennedy-Darling, J., Holden, M. T., Shortreed, M. R., Smith, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+programmable+release+of+captured+DNA.">Multiplexed programmable release of captured DNA.</a> Chembiochem. 15 (16), 2353-2356 (2014).</li><li>Fujita, T., Fujii, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+specific+genomic+regions+and+identification+of+associated+molecules+by+engineered+DNA-binding+molecule-mediated+chromatin+immunoprecipitation+(enChIP)+using+CRISPR.">Isolation of specific genomic regions and identification of associated molecules by engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) using CRISPR.</a> Chromatin Protoc. Third Ed. , 43-52 (2015).</li><li>Lambert, J. -. P., Mitchell, L., Rudner, A., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Proteomics+Approach+for+the+Discovery+of+Chromatin-associated+Protein+Networks.">A Novel Proteomics Approach for the Discovery of Chromatin-associated Protein Networks.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (4), 870-882 (2009).</li></ol>

여기서 설명 하는 HyCCAPP 메서드는 그것에 게 밝히기 애매 남아 것 이다 DNA 상호 작용 하는 강력한 접근 방식을 많은 독특한 기능이 있습니다. 과정의 성격 HyCCAPP 다른 유기 체와 게놈의 지역에서 작동 하도록 유연성을 제공 합니다. 그러나 그것은 방법,, 그는 몇 가지 제한이 간주.
HyCCAPP 일차 전지, 세포 배양 시스템, 또는 심지어 조직 샘플에서 잠재적으로 적용할 수 있도록 셀 ...

지난 10 년 동안 많은 수의 샘플, 그리고 놀라운 해상도 다양 한 게놈의 연구를 수 있도록 시퀀싱 기술에 극적인 개선을 보았다. 백과 사전의 DNA 요소 (인코딩) 컨소시엄, 국가 인간 게놈 연구소는 건강의 국가 학회의 주도로 대규모 다 기관 노력 개별 녹음 방송 요인에 대 한 통찰력을 제공 하고있다 그리고 다른 규제 단백질 바인딩할 게놈 상호 작용. 초기 노력 Chromatin immunoprecipitation (칩)에 의해 100 개 이상의 알려진된 DNA 묶는 단백질1에 대 한 평가 특정 DNA 단백질 상호 작용, 특징. 등 DNase 프린팅2 포름알데히드 규제 요소 (시 키)3 의 보조 절연 단백질, 하지만 분명 한 제한으로 작용 하는 게놈의 특정 영역을 찾을 사용 되었습니다 또한 다른 방법에 실험 방법 팬 들은 상호 작용 단백질의 정보를 식별 하지 않습니다. 지난 년 동안 광범위 한 노력에도 불구 하 고 아무 기술 염색 질, 그리고 식별에 단백질 DNA 상호 작용의 포괄적인 특성화 및 정량화 chromatin 관련 단백질의 효율적으로 있도록 떠오르고 있다.
이 필요를 해결 하기 위해 우리는 우리가 Hybridization Capture of Chromatin-Associated 단백질으로 단백질 (HyCCAPP)에 대 한 불리는 새로운 접근 방식을 개발. 처음 개발 된 효 모4,5,6, 접근 가교 된 chromatin 관심 영역 (바인딩된 단백질)와 시퀀스 관련 교 잡 캡처를 사용 하 여 격리 합니다. 단백질-DNA 복합물의 고립, 후 질량 분석 등 접근 관심사의 순서에 바인딩된 단백질의 세트의 특성을 사용할 수 있습니다. 따라서, HyCCAPP 소설 DNA 단백질 상호 작용의 항 체 그리고 그것에 의존 하지 않습니다 의미를 밝히기 위해 바이어스 비 접근은 완전히 찾을 수 있는 단백질에 대 한 불가 지론으로 간주 될 수 있습니다. 다른 방법을 밝히기 소설 DNA 상호 작용 단백질7, 하지만 대부분 칩 같은 방법8,,910, 플라스 미드 삽입11,12,에 의존 하는 능력 13,14또는 높은 복사 번호15지역. 반면, HyCCAPP는 다중 및 단일 복사 영역에 적용할 수 있는 그리고 지역에서 단백질에 대 한 사전 정보는 필요 하지 않습니다. 또한, 일부 방법 중 위는 중요 한 기능, 특히 DNA-단백질 가교 반응, HyCCAPP의 독특한 특징은에 단일 복사 영역에 적용할 수 있습니다 필요를 피하고 수정 되지 않은 셀, 언급 하 고 없이 상 상속 의무적인 단백질, 또는 사용할 수 있는 항 체에 대 한 사전 지식.
이 시점에서, HyCCAPP 효 모4,,56, 다양 한 게놈 지역 분석에 주로 적용 되 고 최근 알파 위성 DNA 반복 영역에에서 단백질 DNA 상호 작용을 분석 하는 데 사용 했다 인간 게놈16. 우리의 지속적인 작업의 일환으로, 우리 처음 효 모 chromatin 인간 세포의 분석에 적용 되 고 현재 여기 단일 복사 대상의 선택적 캡처 수 있도록 수정 된 프로토콜에 대 한 개발 교 잡 캡처 접근을 적응 시켰다 우리의 초기 연구에서 효 모와 유사한 효율성으로 인간 게놈에 있는 영역입니다. 이 새로운 최적화 된 프로토콜 적응 및 질량 분석 또는 다른 분석 접근을 사용 하 여 인간 게놈 전체 DNA 단백질 상호 작용을 심문 기술의 활용 수 있습니다.
그것은 HyCCAPP 메서드를 사용 하면 특정 대상 지역 분석을 위한 게놈 넓은 분석에 적합 하지 않습니다 강조 하는 것이 중요. 기술 영역 상호 작용 단백질에 대 한 부족 한 정보는 거래 할 때 또는 특정 게놈 소재 시에 상호 작용 단백질의 더 포괄적인 심층 분석을 원할 때 특히 유용 하다. HyCCAPP은 DNA 묶는 단백질을 폭로 하지만 정확 하 게 genomic DNA에 특정 단백질 바인딩 사이트 특성을 하지 의미입니다. 현재 구현, 방법론 DNA 바인딩 시퀀스 또는 개별 단백질에 대 한 주제에 대 한 정보를 제공 하지 않습니다. 따라서, 그것은 멋지게 시 키, 같은 기존 기술을 보완 하 고 게놈 지역에 소설 묶는 단백질의 id는 초기 시 키 분석으로 식별 하는 것을 허용할 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>PrimerQuest tool</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OligoAnalyzer 3.1</td>
			<td>IDT</td>
			<td></td>
			<td>Analyze capture oligonucleotids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PairFold</td>
			<td>UBC</td>
			<td></td>
			<td>Analyze interactions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 media</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11875093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess automated cell counter</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>850 cm2 roller bottle&#160;</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>680058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roller system</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>22-288-525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>37 % formaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igepal CA-630</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I3021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson digital sonifier SFX 150</td>
			<td>Emerson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 fluorometer</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR assay kit</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Q32850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyzer 2100</td>
			<td>Agilent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 5M</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AM9760G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12321D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag-15 magnet</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12301D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads M-280 atreptavidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>60210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>SciGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube shaker and rotator</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>415110Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I (RNase-free)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>M0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SSC buffer 20&#215; concentrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

adaptation of hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics to mammalian cells

단백질 (HyCCAPP) 기술에 대 한 단백질 chromatin 관련의 교 잡 캡처 효 모에 소설 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 처음 개발 되었다. 분석을 대상 지역에 바인딩된 가능성이 단백질에 대 한 사전 지식 없이도 관심의 대상 영역을 수 있습니다. 이론에서 그러면 관심, 어떤 게놈 영역을 분석 하는 데 사용할 HyCCAPP 그리고 다른 세포 시스템에서 작동 하도록 충분 한 유연성을 제공 합니다. 이 방법은 알려진된 전사 인자, Chromatin Immunoprecipitation (칩) 및 칩 같은 방법에 대 한 더 적합 한 작업의 바인딩 사이트를 공부 하는 것은 아닙니다. HyCCAPP의 힘은 제한 된 DNA 영역을 탐구 하는 능력 또는 그것에 바인딩 단백질에 대 한 지식에 있다. 그것은 편견 (칩 같은 방법에 존재 하는) 단백질 기반 chromatin 농축 항 체를 사용 하 여 도입을 방지 하는 편리한 방법을 수 있습니다. 잠재적으로, HyCCAPP를 진정으로 새로운 DNA 단백질 상호 작용을 밝히기 위해 강력한 도구를 수 있습니다. 날짜 하려면, 기술은 주로 적용 된 효 모 세포 또는 포유류 세포에서 높은 복사 반복 시퀀스. 우리가 구상 하는 강력한 도구가 되었다, HyCCAPP 접근 포유류 세포에서 단일 복사 loci를 효율적으로 캡처를 최적화 해야 합니다. 여기, 선물이 우리의 적응 초기 효 HyCCAPP 프로토콜 인간의 세포 라인을 캡처하고 표시 단일 복사 chromatin 지역이 수정 프로토콜 효율적으로 격리 될 수 있습니다.

때문에 성공 하려면 HyCCAPP chromatin의 대용량 입력된에 대 한 필요성, 세포 confluency의 상대적으로 높은 수준에 성장 된다. Trypan 세포 사망률은 보통 확인 하는 데 사용은 블루 얼룩 (< 10%). 단일 복사본 실험, chromatin 콘텐츠 교 잡 캡처 해야 femtomolar 범위에서 이전에 보통 시작 물자로 적어도 109 셀을 필요 합니다. 전체 규모 실험, 이전에 더 작은 일괄 처리 캡처 oligonucle...

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Adaptation of Hybridization Capture of Chromatin-associated Proteins for Proteomics to Mammalian Cells

이것은 후속 proteomic 분석에 대 한 가교 된 chromatin의 순서 특정 캡처에 의존 하는 특정 대상 loci에 새로운 상호 작용 하는 DNA 단백질을 식별 하는 방법. 잠재적인 바인딩 단백질도 세포 수정에 대 한 사전 지식이 요구 된다. 처음에 효 모에 대 한 개발, 기술은 지금 되었습니다 포유류 세포에 대 한 적응.

교 잡의 적응 포유류 세포 단백질 Chromatin 관련 단백질의 캡처

The hybridization capture of chromatin-associated proteins for proteomics (HyCCAPP) technology was initially developed to uncover novel DNA-protein ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

환자 조직에 대한 메틸 결합 DNA 캡처 시퀀싱

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

연구

유전학

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

생리 산소 조건에 노출 된 인간 세포의 캡 결합 단백질의 분석

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

Generation of Genome-wide Chromatin Conformation Capture Libraries from Tightly Staged Early Drosophila Embryos

단단히 준비 초기 초파리 배아에서 게놈 넓은 Chromatin 구조 캡처 라이브러리의 생성

Investigating the three-dimensional architecture of chromatin offers invaluable insight into the mechanisms of gene regulation. Here, we describe a ...

Formaldehyde-assisted Isolation of Regulatory Elements to Measure Chromatin Accessibility in Mammalian Cells

포유류 세포에 측정 Chromatin 접근 규제 요소의 포 름 알 데히드 기반 격리

Appropriate gene expression in response to extracellular cues, that is, tissue- and lineage-specific gene transcription, critically depends on highly ...

A Simple, Rapid, and Quantitative Assay to Measure Repair of DNA-protein Crosslinks on Plasmids Transfected into Mammalian Cells

간단 하 고 빠른, 양적 분석 결과에 플라스 미드 DNA-단백질 Crosslinks의 측정 수리에 포유류 세포로 페

The purpose of this method is to provide a flexible, rapid, and quantitative technique to examine the kinetics of DNA-protein crosslink (DPC) repair in ...

A Fast and Quantitative Method for Post-translational Modification and Variant Enabled Mapping of Peptides to Genomes

포스트 번역 상 수정 및 변형에 대 한 신속 하 고 양적 방법 사용의 펩 티 드 유전자에 매핑

Cross-talk between genes, transcripts, and proteins is the key to cellular responses; hence, analysis of molecular levels as distinct entities is slowly ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

CRISPR 가이드 RNA 포유류 시스템 복제

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Chromatin Immunoprecipitation Assay Using Micrococcal Nucleases in Mammalian Cells

포유류 세포에서 미세 Coccal 뉴클레아제사용 염색질 면역침전 분석

To express cellular phenotypes in organisms, living cells execute gene expression accordingly, and transcriptional programs play a central role in gene ...