Name: determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch das nationale Institut für allgemeine medizinische Wissenschaft (NIGMS) (5605100122001), eine Komponente des National Institute of Health (NIH), und die University of Nebraska Kearney (UNK) Sommer Student Research Program (SSRP) und UNK finanziert. Undergraduate Research Fellowship (URF).

1. Vorbereitung von Farbstoffen, Puffer und Agarose-Gel
<ol><li>
Bereiten Sie die folgenden Lösungen zum Beizen von DNA oder die Verdauung von gefärbten DNA.
	<ol>
<li>Bereiten Sie 1 X TE (Tris-HCl und Ethylenediaminetetraacetic Säure; EDTA)-Puffer mit 10 mM Tris-HCl und 1 mM EDTA in einem Messzylinder oder volumetrischer Kolben. Lagerung bei Raumtemperatur (18-25 ° C).</li>
		<li>Aliquote jede Farbe zu machen: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (Tabelle 1). Pipette 4 µ...

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping.">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278 (2007).</li><li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li><li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. L., Ravindran, P., Schwartz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+and+nanocoding+approaches+to+whole-genome+analysis.">Optical mapping and nanocoding approaches to whole-genome analysis.</a> Microfluidics and Nanofluidics. 20 (44), 1-14 (2016).</li><li>Kounovsky-Shafer, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presentation+of+large+DNA+molecules+for+analysis+as+nanoconfined+dumbbells.">Presentation of large DNA molecules for analysis as nanoconfined dumbbells.</a> Macromolecules. 46 (20), 8356-8368 (2013).</li><li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanochannel+confinement:+DNA+stretch+approaching+full+contour+length.">Nanochannel confinement: DNA stretch approaching full contour length.</a> Lab Chip. 11 (10), 1721-1729 (2011).</li><li>Yu, H., Jo, K., Kounovsky, K. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+propulsion:+chemical+sensing+and+chemotaxis+of+DNA+driven+by+RNA+polymerase.">Molecular propulsion: chemical sensing and chemotaxis of DNA driven by RNA polymerase.</a> J Am Chem Soc. 131 (16), 5722-5723 (2009).</li><li>Lam, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+mapping+on+nanochannel+arrays+for+structural+variation+analysis+and+sequence+assembly.">Genome mapping on nanochannel arrays for structural variation analysis and sequence assembly.</a> Nat Biotechnol. 30 (8), 771-776 (2012).</li><li>Cao, H., Tegenfeldt, J. O., Austin, R. H., Chou, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+nanostructures+for+interfacing+microfluidics+and+nanofluidics.">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma.">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li><li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+the+Mycobacterium+avium+subspecies+paratuberculosis+genome.">Optical mapping of the Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis genome.</a> BMC Genomics. 10, 25 (2009).</li><li>Jo, K., Schramm, T. M., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis+:+nanocoding.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis : nanocoding.</a> Methods Mol Biol. 544, 29-42 (2009).</li><li>Jo, K., Chen, Y. L., de Pablo, J. J., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows.">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li><li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li><li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compression+and+free+expansion+of+single+DNA+molecules+in+nanochannels.">Compression and free expansion of single DNA molecules in nanochannels.</a> Phys Rev Lett. 95 (26), 268101 (2005).</li><li>Staerk, D., Hamed, A. A., Pedersen, E. B., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bisintercalation+of+homodimeric+thiazole+orange+dyes+in+DNA:+effect+of+modifying+the+linker.">Bisintercalation of homodimeric thiazole orange dyes in DNA: effect of modifying the linker.</a> Bioconjug Chem. 8 (6), 869-877 (1997).</li><li>Spielmann, H. P., Wemmer, D. E., Jacobsen, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy.">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li><li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+YOYO-1+on+the+mechanical+properties+of+DNA.">Effect of YOYO-1 on the mechanical properties of DNA.</a> Soft Matter. 10 (48), 9721-9728 (2014).</li><li>Technologies, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Molecular Probes Handbook: A guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. , (2010).</li><li>Riehn, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+mapping+in+nanofluidic+devices.">Restriction mapping in nanofluidic devices.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (29), 10012-10016 (2005).</li><li>Meng, X., Cai, W., Schwartz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes.">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li><li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family.">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li><li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics.">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304 (2015).</li><li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA.">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clone-free,+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+(Bos+taurus)+genome.">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644 (2015).</li><li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis.">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum.">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913 (2012).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome.">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).</li><li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands.">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I,+its+structure+determination+and+methodological+implications.">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).</li></ol>

Um Eindringmittel beschrifteten DNA (Abbildung 1)zu verdauen, sind eine Reihe von Schritten erforderlich. Erstens ist DNA über Nacht mit einem Fluorochrom befleckt. DNA kann für einen kürzeren Zeitraum mit Cyanin Dimere inkubiert; Allerdings fand Carlsson Et Al. , dass DNA doppelte Bändern für jede DNA-Größe aufgrund unvollständiger Färbung20erstellt. Um dem abzuhelfen, kann die DNA über Nacht zu verhindern, dass doppelte Bänder ge...

Die TOTO-Serie (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, und BOBO-3; Tabelle 1) wird in einer Vielzahl von Experimenten verwendet wo die Visualisierung der DNA erforderlich1,2,3,4,5,6,7, ist 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. Cyanin-Dimer-Familie ist weit verbreitet, aufgrund ihrer Quantenausbeute, Empfindlichkeit und hohe Affinität für DNA-Moleküle18,19,20. Cyanin Dimer Farbstoffe haben große Selektivität für doppelte stranded DNA und wenn Zwischenspiele einen 100 bis 1000 fachen Anstieg der Fluoreszenz21haben. Pyridiniumdichromat Farbstoffe (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 und TOTO-3) haben eine kürzere Emissionswellenlänge als ihre Quinolium färben (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 und POPO-3) Pendants (Tabelle 1)22. Auch die Quantenausbeute für Cyanin Dimere Zwischenspiele in DNA ist hoch (0,2 - 0,6)22. Mithilfe eines Enzyms bestimmen das Profil der Methylierung von DNA-Molekül2 oder dehnen23 eines DNA-Moleküls, die bereits mit fluoreszierenden Farbstoff gefärbt erfordert jedoch eine Methode, um festzustellen, welche Enzyme wird gebeizt DNA zu verdauen. Jede Art von Farbstoff, die in DNA Plasmamembrane oder jedes Enzym, das eine erkennbare Muster des Substrats DNA gibt kann für diese Methode verwendet werden.
Meng Et Al. bestimmt zunächst die Verdauung bei prestained DNA durch Gelelektrophorese mit einer Vielzahl von verschiedenen Farbstoffen24. Maschmann Et Al. vertieft tiefer zu betrachten, die TOTO-Familie von Farbstoffen. Beide entschlossen die Verdauung bei gefärbten DNA zu sehen, ob DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt mit einem Restriktionsenzym25verdaut werden könnte. Andere Methoden studieren Bindung Auswirkungen von Farbstoffen mit DNA mit Hilfe von optischen Pinzette26 oder NMR27eingelagert. Entweder-Methode erfordert spezialisierten Ausrüstung; in der Erwägung, dass mit dieser Methode können Geräte, die meisten molekularbiologischen Labore haben um festzustellen, ob ein Farbstoff stört eine Beschränkung Enzym Verdauung.
Darüber hinaus hat optische Zuordnung in andere Methoden, um die Länge eines bestimmten Moleküls zu messen, länglich ungefärbten DNA-Moleküle auf einer Oberfläche und verdaut DNA, um die Ausdehnung und Größe der Fragmente zu bestimmen. Interkalation von Farbstoff wurde gezeigt, dass die Kontur Länge der Gewebekulturen gefärbten DNA-Moleküle und abhängig von der Farbstoff verwendet, die Konturen Längen sind verschiedene21. Diese Methode wurde verwendet worden, in einer Vielzahl von Genome1,3,4,6,13,28,29,30, 31. jedoch wenn Moleküle vor gebeizt, je nach Farbstoff und Enzym, das Enzym möglicherweise nicht zum Schneiden von DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt. Diese Methode bestimmt somit, wenn DNA mit einem bestimmten Farbstoff gefärbt mit einem Enzym verdaut werden kann. Darüber hinaus werden abhängig von der Konzentration des Farbstoffes und der Farbstoff genutzt, die Mobilität der DNA Bands in einem Gel langsamer als native DNA aufgrund der teilweise Abbau der DNA Rückgrat um Platz für den Farbstoff zwischen Basenpaare32 einfügen zu migrieren .
Aber manchmal diese Farbstoffe können teilweise oder vollständig hemmen die Wirkung von bestimmten Restriktionsenzyme7,24. Dies ist vermutlich aufgrund eines strukturellen Wandels in der DNA verursacht durch die Befestigung der Fluoreszenzfarbstoff, die das Enzym kann verhindern, dass seine spezifischen Reihenfolge zu erkennen. Verstehen, wie diese Farbstoffe Restriktionsenzyme beeinflussen kann in Experimenten helfen wo die Methylierung-Profil oder die gefärbten DNA-Abschnitt erforderlich ist.
In unserer Methode wurde DNA befleckt mit einem Fluorochrom von Interesse und mit einem Restriktionsenzym verdaut. Dann wurde die DNA auf einem Gel, abgebildet, electrophoresed und die Beschränkung Enzym Verdauung wurde gemessen. Die Restriktionsenzyme wurden basierend auf den geschnittenen Muster auf einem Gel gewählt. Zu viele Bands verursacht Überlappung der DNA-Bänder und zu wenige Bands gaben kein vollständiges Bild des DNA-Moleküls. Es gibt ein Sweet Spot, das Profil der verdauten DNA-Moleküls bestimmen zu können; Daher hängt es von der DNA verwendet und das Enzym. Ein Vorteil dieser Methode ist seine Einfachheit; Es erfordert nur eine Einschränkung Verdauung und Gel-Elektrophorese verwendet.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Unmethylated lambda DNA</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:155px;">N3013S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">BOBO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">BamHI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">PmlI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0532S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">ScaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R3122S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EcoRI&#160;</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HindIII</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">SmaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Tris</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EDTA</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">S316-212</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HCl</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>Corrosive and irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 1</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7201S</td>
			<td>NEB 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 2</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>NEB 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 3</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB Cutsmart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">High gelling temperature agarose gel</td>
			<td style="width:111px;">Lonza</td>
			<td>50041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25118</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Blue light transilluminator</td>
			<td style="width:111px;">Dark Reader</td>
			<td>DR196</td>
			<td>Wear correct eyewear&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>15585011</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Cannon EOS Rebel T3I camera</td>
			<td style="width:111px;">Cannon</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apogee Model H4</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1704510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Power Pac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1645050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Ficoll</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Xylene Cyanol</td>
			<td style="width:111px;">Eastmen</td>
			<td style="width:155px;">T1579</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualisierung der DNA für die Fluoreszenzmikroskopie nutzt eine Vielzahl von Farbstoffen wie Cyanin-Farbstoffe. Diese Farbstoffe werden aufgrund ihrer hohen Affinität und Sensibilität für DNA eingesetzt. Um festzustellen, ob die DNA-Moleküle in voller Länge nach Abschluss des Experiments sind, ist eine Methode erforderlich, um festzustellen, ob die gefärbten Moleküle in voller Länge sind von DNA mit Restriktionsenzymen verdaut. Gefärbten DNA kann jedoch die Enzyme hemmen, so eine Methode benötigt wird, um festzustellen, welche Enzyme, die man für Fluorochrom verwenden DNA befleckt. Bei dieser Methode wird DNA gefärbt, mit einem Cyanin-Farbstoff über Nacht um den Farbstoff und DNA zu equilibrate ermöglichen. Nächste, gefärbten DNA ist mit einem Restriktionsenzym verdaut, geladen in ein Gel und electrophoresed. Die experimentelle DNA-Digest-Bänder sind ein in Silico -Digest zu bestimmen, die Beschränkung Enzym-Aktivität gegenüber. Wenn es die gleiche Anzahl von Bands wie erwartet, ist die Reaktion abgeschlossen. Mehr Bands als erwartet, teilweise Verdauung zeigen und weniger Bands zeigen unvollständige Verdauung. Der Vorteil dieses Verfahrens liegt in seiner Einfachheit und es verwendet Geräte, die ein Wissenschaftler für ein Restriktionsenzym müssten assay und gel-Elektrophorese. Eine Einschränkung dieser Methode ist, dass die Enzyme zur Verfügung, um die meisten Wissenschaftler im Handel erhältlichen Enzyme sind; jedoch konnte Restriktionsenzyme verwendet werden.

Um festzustellen, wenn ein intercalating Farbstoff ein Restriktionsenzym verdauen DNA auswirkt, muss die richtige Reihenfolge der Schritte sein gefolgt (Abbildung 1). Sobald DNA ist gebeizt und mit einem bestimmten Enzym verdaut, kann ein Bild des Gels aufgenommen werden, bestimmen die Anzahl der Fragmente und ihrer Größe (Abbildung 2). Um die Enzym-Effizienz, die Gesamtzahl der erwarteten sichtbare Bänder geteilt durch die An...

Watch this Scientific Journal Video about Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes at JoVE.com

Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Färbung der DNA-Moleküle für die Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht eine Wissenschaftler um sie während eines Experiments zu sehen. In die hier vorgestellte Methode sind DNA-Moleküle vorab mit Fluoreszenz-Farbstoffen gefärbt und mit Methylierung und nicht-Methylierung sensibel Restriktionsenzymen verdaut.

Bestimmen, ob DNA mit einem Cyanin Farbstoff kann nicht verdaut werden mit Restriktionsenzymen gebeizt

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie zur metabolischen Profils von biologischen Proben

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Forschung

Biochemie

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging-Amyloid Gewebe gebeizt mit lumineszierenden konjugierte Oligothiophenes von hyperspektralen konfokalen Mikroskopie und Fluoreszenz Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Dual DNA Lineale zur Untersuchung des Mechanismus der Ribosomentranslokation mit Single-Nukleotid-Auflösung

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Charakterisierung zellulärer Proteine mit in-zelliger schneller photochemischer Oxidation von Proteinen

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Kryo-EM- und Einzelpartikelanalyse mit Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Kontinuierlicher fluoreszenzbasierter Endonuklease-gekoppelter DNA-Methylierungsassay zum Screening auf DNA-Methyltransferase-Inhibitoren

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Herstellung von Nukleosomenkernpartikeln, die mit DNA-Reparaturfaktoren für die Strukturbestimmung der Kryo-Elektronenmikroskopie komplexiert sind

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Bestimmung der thermodynamischen und kinetischen Assoziation eines DNA-Aptamers und Tetracyclins mittels isothermer Titrationskalorimetrie

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Measuring Ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

Quantitative Detection of DNA Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications (Video) | JoVE 

Quantitativer Nachweis von DNA-Protein-Vernetzungen und deren posttranslationale Modifikationen

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Assessing Hepatic Steatosis with 3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment (Video) | JoVE 

Analyse fluoreszenzgefärbter Lipidtröpfchen mit 3D-Rekonstruktion zur Beurteilung der Lebersteatose

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...