Name: determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00
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Questa ricerca è stata finanziata dall'Istituto nazionale per generale Medical Science (NIGMS) (5605100122001), un componente del National Institutes of Health (NIH), così come Università del Nebraska a Kearney (UNK) estate studente ricerca programma (SSRP) e UNK Borsa di ricerca dello studente non laureato (URF).

1. preparazione di coloranti, buffer e Gel di agarosio
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni per la colorazione del DNA o la digestione del DNA macchiato.
	<ol>
<li>Preparare 1 x TE (Tris-HCl e acido etilendiamminotetraacetico acido; Soluzione tampone dell'EDTA) con 10 mM Tris-HCl e 1 mM EDTA in un cilindro graduato o matraccio tarato. Conservare a temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Rendere le aliquote di ogni tintura: TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3, BOBO-3 (tabell...

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. 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Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I,+its+structure+determination+and+methodological+implications.">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).</li></ol>

Per digerire fluorescente contrassegnati del DNA (Figura 1), una serie di passaggi sono necessari. In primo luogo, il DNA è macchiato con un fluorocromo durante la notte. DNA può essere incubato con dimeri cianina per un breve periodo di tempo; Tuttavia, Carlsson et al trovato che DNA creato bands doppie per ogni dimensione del DNA a causa di colorazione incompleta20. Per risolvere questo problema, il DNA può essere macchiato durante la no...

La serie TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, POPO-3 e BOBO-3; Tabella 1) è utilizzata in un'ampia varietà di esperimenti dove la visualizzazione del DNA è richiesto1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. la famiglia di dimero cianina è ampiamente usata a causa del loro rendimento quantico, sensibilità e alta affinità per il DNA molecole18,19,20. Cianina dimero tinture hanno grande selettività per il DNA a doppio filamento e quando intercalate hanno un aumento di 100 a 1000 volte di fluorescenza21. Piridinio coloranti (YOYO-1, TOTO-1, YOYO-3 e TOTO-3) hanno una lunghezza d'onda di emissione che loro quinolium tingere (BOBO-1, POPO-1, BOBO-3 e POPO-3) controparti (tabella 1)22. Inoltre, è alto il rendimento quantico per dimeri cianina intercalato nel DNA (0.2 - 0.6)22. Tuttavia, usando un enzima per determinare il profilo di metilazione di una molecola di DNA2 o tratto23 di una molecola di DNA già macchiata con colorante fluorescente richiede un metodo per determinare quali enzimi saranno digerire DNA macchiato. Qualsiasi tipo di colorante che si intercala nel DNA o qualsiasi enzima che dà un modello distinguibile del substrato del DNA può essere utilizzato per questo metodo.
Meng et al. in primo luogo determinato il tasso di digestione del DNA precolorato attraverso elettroforesi del gel usando una varietà di differenti tinture24. Maschmann et al ha ricercato nel più profondo di guardare la famiglia TOTO di coloranti. Sia determinato il tasso di digestione del DNA macchiato per vedere se DNA tinto con un colorante specifico potrebbe essere digerito con un enzima di restrizione25. Altri metodi di studio effetti vincolanti di coloranti intercalate con DNA usando la pinzetta ottica26 o NMR27. Entrambi i metodi richiede attrezzature specializzate; mentre questo metodo consente di apparecchiature che hanno maggior parte dei laboratori di biologia molecolare per determinare se un colorante interferisce con una digestione degli enzimi di limitazione.
Inoltre, in altri metodi per misurare la lunghezza di una data molecola, mappatura ottico ha molecole di DNA non colorati su una superficie di forma allungata e digerito il DNA per determinare il tratto e le dimensioni dei frammenti. Intercalazione di tintura ha dimostrato di aumentare la lunghezza del contorno di molecole di DNA fluorescente macchiati e a seconda del colorante usato, le lunghezze di contorno sono diversi21. Questo metodo è stato utilizzato in una varietà di genomi1,3,4,6,13,28,29,30, 31. Tuttavia, se le molecole sono state pre-tinto, a seconda del colorante e l'enzima, l'enzima può non essere in grado di tagliare il DNA colorato con un colorante specifico. Pertanto, questo metodo determina se DNA tinto con un colorante specifico può essere digerito con un enzima. Inoltre, a seconda della concentrazione del colorante e la tintura utilizzata, la mobilità del DNA bande in un gel migrerà più lentamente del DNA nativo a causa lo svolgimento parziale della spina dorsale del DNA per fare spazio per la tintura da inserire tra coppie di basi32 .
Tuttavia, a volte questi coloranti possono parzialmente o completamente per inibire l'azione di alcuni enzimi di restrizione7,24. Ciò è probabilmente dovuto ad un cambiamento strutturale nel DNA causato tramite il collegamento della tintura fluorescente, che può impedire l'enzima di riconoscere la sua sequenza specifica. Comprendere come queste tinture influenzano gli enzimi di limitazione può aiutare negli esperimenti dove è richiesto il profilo di metilazione o il tratto di DNA macchiato.
Nel nostro metodo, DNA è stato macchiato con un fluorocromo di interesse e si digerisce con un enzima di restrizione. Quindi il DNA è stato electrophoresed su un gel, imaging, ed è stato misurato il tasso di digestione degli enzimi di limitazione. Gli enzimi di restrizione sono stati scelti in base al modello di taglio su un gel. Troppe fasce causato sovrapposizione delle bande di DNA e troppo poche band non ha dato un quadro completo della molecola del DNA. C'è un posto dolce per essere in grado di determinare il profilo della molecola del DNA digerito; Pertanto, essa dipenderà il DNA usato e l'enzima. Un vantaggio di questo metodo è la sua semplicità; richiede solo attrezzature utilizzate in una restrizione digestione ed elettroforesi su gel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Unmethylated lambda DNA</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:155px;">N3013S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">BOBO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">BamHI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">PmlI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0532S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">ScaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R3122S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EcoRI&#160;</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HindIII</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">SmaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Tris</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EDTA</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">S316-212</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HCl</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>Corrosive and irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 1</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7201S</td>
			<td>NEB 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 2</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>NEB 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 3</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB Cutsmart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">High gelling temperature agarose gel</td>
			<td style="width:111px;">Lonza</td>
			<td>50041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25118</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Blue light transilluminator</td>
			<td style="width:111px;">Dark Reader</td>
			<td>DR196</td>
			<td>Wear correct eyewear&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>15585011</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Cannon EOS Rebel T3I camera</td>
			<td style="width:111px;">Cannon</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apogee Model H4</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1704510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Power Pac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1645050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Ficoll</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Xylene Cyanol</td>
			<td style="width:111px;">Eastmen</td>
			<td style="width:155px;">T1579</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualizzazione del DNA per la microscopia di fluorescenza utilizza una varietà di coloranti come cianina coloranti. Questi coloranti sono utilizzati a causa della loro alta affinità e sensibilità per il DNA. Al fine di determinare se le molecole di DNA sono integrale dopo il completamento dell'esperimento, è necessario un metodo per determinare se le molecole macchiate sono integrale dalla digestione del DNA con enzimi di restrizione. Tuttavia, macchiato DNA può inibire gli enzimi, quindi è necessario un metodo per determinare quali enzimi si potrebbe utilizzare per fluorocromo macchiato del DNA. In questo metodo, il DNA è macchiato con una tintura di cianina durante la notte per consentire la tintura e il DNA per equilibrare. Prossimo, tinto il DNA è digerito con un enzima di restrizione, caricato in un gel ed electrophoresed. La band di digerire DNA sperimentali vengono confrontate con un digest in silico per determinare l'attività degli enzimi di limitazione. Se c'è lo stesso numero di bande come previsto, la reazione è completa. Più del previsto indicare digestione parziale e meno bande indicano la digestione incompleta. Il vantaggio di questo metodo è la sua semplicità e utilizza attrezzature che uno scienziato avrebbe bisogno per un enzima di limitazione di analisi e di elettroforesi del gel. Una limitazione di questo metodo è che gli enzimi disponibili per la maggior parte degli scienziati sono enzimi commercialmente disponibili; Tuttavia, potrebbe essere utilizzati qualsiasi enzimi di restrizione.

Al fine di determinare che se un colorante intercalante interesserà un enzima di restrizione digestione del DNA, l'ordine corretto delle operazioni deve essere seguita (Figura 1). Una volta che il DNA è macchiato e si digerisce con un enzima specifico, può essere scattata una foto del gel per determinare il numero di frammenti e la loro dimensione (Figura 2). Al fine di determinare l'efficienza di enzima, il numero totale di b...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Macchiatura di molecole di DNA per microscopia a fluorescenza permette uno scienziato per visualizzarli durante un esperimento. Nel metodo presentato qui, molecole di DNA sono pre-colorati con coloranti fluorescenti e digeriti con metilazione ed enzimi di restrizione sensibili non-metilazione.

Determinare se il DNA macchiato con un cianina tintura può essere digerito con enzimi di restrizione

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Guaina elettroforesi capillare-spettrometria di massa per metaboliche Profiling di campioni biologici

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Ricerca

Biochimica

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imaging dell'amiloide tessuti macchiati con luminescenti oligotiofeni coniugati di Hyperspectral confocale microscopia e fluorescenza Lifetime Imaging

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

I governanti del DOPPIO DNA studiano il meccanismo della traslocazione del ribosoma con la risoluzione Single-Nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caratterizzare le proteine cellulari con l'ossidazione fotochimica veloce all'incell delle proteine

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Crio-EM e analisi a singola particella con Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Saggio di metilazione del DNA accoppiato a endonucleasi a fluorescenza continua per lo screening degli inibitori della DNA metiltransferasi

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparazione di particelle nucleosomiche complessate con fattori di riparazione del DNA per la determinazione strutturale della microscopia crioelettronica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Determinazione dell'associazione termodinamica e cinetica di un aptamero del DNA e di una tetraciclina mediante calorimetria isotermica a titolazione

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Measuring Ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

Quantitative Detection of DNA Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications (Video) | JoVE 

Rilevazione quantitativa dei legami incrociati DNA-proteina e delle loro modificazioni post-traduzionali

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Assessing Hepatic Steatosis with 3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment (Video) | JoVE 

Analisi di goccioline lipidiche colorate con fluorescenza con ricostruzione 3D per la valutazione della steatosi epatica

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...