Name: determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes
Uploaded: 2018-02-02T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Instituto Nacional para geral médica ciência (NIGMS) (5605100122001), um componente do National Institutes of Health (NIH), bem como a Universidade de Nebraska em Kearney (UNK) programa de pesquisa de estudante verão (SSRP) e UNK Bolsa de iniciação científica (Al-URF).

1. preparação de corantes, Buffers e Gel de Agarose
<ol><li>
Prepare as seguintes soluções para coloração de DNA ou a digestão do DNA manchada.
	<ol>
<li>Preparar 1 x TE (Tris-HCl e ácido etilenodiaminotetracético ácido; Buffer de EDTA) usando 10 mM Tris-HCl e 1 mM de EDTA em uma proveta ou balão volumétrico. Armazenar em temperatura ambiente (18-25 ° C).</li>
		<li>Fazer alíquotas de cada tintura: TOTO-1, 1-YOYO, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO, BOBO-3 (tabela 1). Pipete 4 µ l de...

<ol>
	<li>Teague, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+human+genome+structure+by+single-molecule+analysis.">High-resolution human genome structure by single-molecule analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 10848-10853 (2010).</li><li>Ananiev, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+discerns+genome+wide+DNA+methylation+profiles.">Optical mapping discerns genome wide DNA methylation profiles.</a> BMC Mol Biol. 9, 68 (2008).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+rice+genome+sequence+by+optical+mapping.">Validation of rice genome sequence by optical mapping.</a> BMC Genomics. 8, 278 (2007).</li><li>Reslewic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodospirillum+rubrum.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodospirillum rubrum.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (9), 5511-5522 (2005).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+shotgun+optical+mapping+of+Rhodobacter+sphaeroides+strain+2.4.1+and+its+use+for+whole-genome+shotgun+sequence+assembly.">Whole-genome shotgun optical mapping of Rhodobacter sphaeroides strain 2.4.1 and its use for whole-genome shotgun sequence assembly.</a> Genome Res. 13 (9), 2142-2151 (2003).</li><li>Gupta, A., Kounovsky-Shafer, K. 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Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gradient+nanostructures+for+interfacing+microfluidics+and+nanofluidics.">Gradient nanostructures for interfacing microfluidics and nanofluidics.</a> Applied Physics Letters. 81 (16), 3058-3060 (2002).</li><li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+analysis+reveals+widespread+structural+variation+in+multiple+myeloma.">Single-molecule analysis reveals widespread structural variation in multiple myeloma.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (25), 7689-7694 (2015).</li><li>Wu, C. W., Schramm, T. M., Zhou, S., Schwartz, D. C., Talaat, A. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+migration+of+single+DNA+molecules+in+microchannels+using+oscillatory+shear+flows.">Elongation and migration of single DNA molecules in microchannels using oscillatory shear flows.</a> Lab Chip. 9 (16), 2348-2355 (2009).</li><li>Jo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single-molecule+barcoding+system+using+nanoslits+for+DNA+analysis.">A single-molecule barcoding system using nanoslits for DNA analysis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (8), 2673-2678 (2007).</li><li>Reccius, C. H., Mannion, J. T., Cross, J. D., Craighead, H. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+structure+of+a+DNA+complex+with+the+fluorescent+bis-intercalator+TOTO+determined+by+NMR+spectroscopy.">Solution structure of a DNA complex with the fluorescent bis-intercalator TOTO determined by NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 34, 8542-8553 (1995).</li><li>Carlsson, C., Jonsson, M., Akerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Double+bands+in+DNA+gel+electrophoresis+caused+by+bis-intercalating+dyes.">Double bands in DNA gel electrophoresis caused by bis-intercalating dyes.</a> Nucleic Acids Res. 23 (13), 2413-2420 (1995).</li><li>Kundukad, B., Yan, J., Doyle, P. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+restriction+endonuclease+activity+by+DNA+binding+fluorochromes.">Inhibition of restriction endonuclease activity by DNA binding fluorochromes.</a> J Biomol Struct Dyn. 13 (6), 945-951 (1996).</li><li>Maschmann, A., Kounovsky-Shafer, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+restriction+enzyme+activity+when+cutting+DNA+labeled+with+the+TOTO+Dye+family.">Determination of restriction enzyme activity when cutting DNA labeled with the TOTO Dye family.</a> Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. , 1-12 (2017).</li><li>Biebricker, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+DNA+intercalators+on+DNA+and+DNA-processing+enzymes+elucidated+through+force-dependent+binding+kinetics.">The impact of DNA intercalators on DNA and DNA-processing enzymes elucidated through force-dependent binding kinetics.</a> Nature Communications. 6, 7304 (2015).</li><li>Gunther, K., Mertig, M., Seidel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+structural+properties+of+YOYO-1+complexed+DNA.">Mechanical and structural properties of YOYO-1 complexed DNA.</a> Nucleic Acids Res. 38 (19), 6526-6532 (2010).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+clone-free,+single+molecule+map+of+the+domestic+cow+(Bos+taurus)+genome.">A clone-free, single molecule map of the domestic cow (Bos taurus) genome.</a> BMC Genomics. 16, 644 (2015).</li><li>Ray, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+structural+alterations+in+solid+tumor+oligodendroglioma+by+single+molecule+analysis.">Discovery of structural alterations in solid tumor oligodendroglioma by single molecule analysis.</a> BMC Genomics. 14, 505 (2013).</li><li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+the+model+medicinal+mushroom+Ganoderma+lucidum.">Genome sequence of the model medicinal mushroom Ganoderma lucidum.</a> Nat Commun. 3, 913 (2012).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+molecule+scaffold+for+the+maize+genome.">A single molecule scaffold for the maize genome.</a> PLoS Genet. 5 (11), e1000711 (2009).</li><li>Sischka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+and+kinetics+between+DNA+and+DNA+binding+ligands.">Molecular mechanisms and kinetics between DNA and DNA binding ligands.</a> Biophys J. 88 (1), 404-411 (2005).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments.">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li><li>Zipper, H., Brunner, H., Bernhagen, J., Vitzthum, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigations+on+DNA+intercalation+and+surface+binding+by+SYBR+Green+I,+its+structure+determination+and+methodological+implications.">Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I, its structure determination and methodological implications.</a> Nucleic Acids Res. 32 (12), e103 (2004).</li></ol>

A fim de digerir fluorescente etiquetadas DNA (Figura 1), uma série de passos são necessários. Primeiro, DNA está manchada com um fluorocromo durante a noite. DNA pode ser incubada com dímeros cianina, por um período mais curto de tempo; no entanto, Carlsson et al encontraram que o DNA criado bandas duplas para cada tamanho de DNA devido à coloração incompleta20. Para remediar esta situação, o DNA pode ser manchado durante a noite ...

A série TOTO (TOTO-1, YOYO-1, POPO-1, BOBO-1, TOTO-3, YOYO-3, 3-POPO e BOBO-3; A tabela 1) é utilizado em uma ampla variedade de experiências onde a visualização do DNA é necessário1,2,3,4,5,6,7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17. a família de dímero de cianina é amplamente utilizada devido a sua alta afinidade por moléculas de DNA a18,19,20, sensibilidade e rendimento quântico. Cianina dímero corantes tem grande seletividade para ADN encalhado dobro e quando intercaladas têm um aumento de 100 a 1000 vezes de fluorescência21. Corantes de piridínio (YOYO-1, TOTO-1, 3-YOYO e TOTO-3) tem um emissão comprimento de onda menor do que seus quinolium tingir (BOBO-1, 1-POPO, BOBO-3 e POPO-3) homólogos (tabela 1)22. Além disso, o rendimento quântico de dímeros cianina intercalados no DNA é alto (0,2 - 0,6)22. No entanto, usando uma enzima para determinação do perfil de metilação de uma molécula de DNA2 ou esticar23 de uma molécula de DNA já manchada com uma tintura fluorescente requer um método para determinar que enzimas digerirá DNA manchada. Qualquer tipo de corante que se intercala no ADN ou qualquer enzima que dá um padrão discernível do substrato DNA pode ser usada para este método.
Meng et al primeiro determinada a taxa de digestão de DNA prestained através de eletroforese em gel usando uma variedade de diferentes corantes24. Miranda et al analisaram no mais profundo de olhar para a família de totó de corantes. Ambos determinados a taxa de digestão de DNA manchada para ver se DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima de restrição,25. Outros métodos de estudam efeitos vinculativos de corantes intercalados com DNA usando Pinça óptica26 ou NMR27. Qualquer método requer equipamento especializado; Considerando que, esse método permite que o equipamento que a maioria dos laboratórios de biologia molecular têm para determinar se uma tintura interfere com uma enzima de restrição de digestão.
Além disso, em outros métodos para medir o comprimento de uma determinada molécula, mapeamento óptico tem alongado imaculadas moléculas de DNA em uma superfície e digerido DNA para determinar a extensão e tamanho dos fragmentos. Intercalação de corante foi mostrada para aumentar o comprimento de contorno das moléculas de DNA fluorescente manchadas e dependendo do corante usado, os contorno dos comprimentos diferentes21. Este método tem sido utilizado em uma variedade de genomas1,3,4,6,13,28,29,30, 31. no entanto, se moléculas foram pre-manchadas, dependendo da tintura e a enzima, a enzima não pode ser capaz de cortar o DNA manchada com um determinado corante. Portanto, este método determina se o DNA manchada com uma tintura determinada pode ser digerido com uma enzima. Além disso, dependendo da concentração de corante e o corante utilizado, a mobilidade do DNA bandas em um gel irão migrar mais lentamente do que o DNA nativo devido a desenrolar parcial do backbone DNA para fazer o quarto para a tintura inserir entre pares de bases32 .
No entanto, às vezes estes corantes podem parcialmente ou completamente, inibir a ação de determinadas enzimas de restrição7,24. Isto é pensado para ser devido a uma mudança estrutural no causada pelo acessório do corante fluorescente, que pode impedir que a enzima reconhecendo sua sequência específica de DNA. Compreender como estes corantes afetam as enzimas de restrição pode ajudar em experiências onde o perfil de metilação ou trecho de DNA manchada é necessário.
Em nosso método, o DNA foi manchada com um fluorocromo de interesse e digerido com uma enzima de restrição. Então o DNA foi electrophoresed em um gel, cuja imagem, e a taxa de digestão de enzima de restrição foi medida. As enzimas de restrição foram escolhidas com base no padrão de corte em um gel. Muitas bandas causaram a sobreposição das bandas de DNA e muito poucas bandas não deu uma imagem completa da molécula de DNA. Há um ponto doce para ser capaz de determinar o perfil da molécula de DNA digerido; Portanto, dependerá do DNA usado e a enzima. Uma vantagem deste método é sua simplicidade; exige somente equipamentos utilizados em uma eletroforese de gel e digestão de restrição.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="605">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Unmethylated lambda DNA</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td style="width:155px;">N3013S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">BOBO-1</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>B3582</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">YOYO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Y3606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">TOTO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>T3604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">POPO-3</td>
			<td style="width:111px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P3584</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">BamHI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0136S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">PmlI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0532S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">ScaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R3122S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EcoRI&#160;</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0101S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HindIII</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0104S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">SmaI</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>R0141S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Tris</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">EDTA</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td style="width:155px;">S316-212</td>
			<td>Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">HCl</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25358</td>
			<td>Corrosive and irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 1</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7201S</td>
			<td>NEB 1.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 2</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7202S</td>
			<td>NEB 2.1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Buffer 3</td>
			<td style="width:111px;">NEB</td>
			<td>B7204S</td>
			<td>NEB Cutsmart</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">High gelling temperature agarose gel</td>
			<td style="width:111px;">Lonza</td>
			<td>50041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Acetic Acid</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>S25118</td>
			<td>Hazardous</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Blue light transilluminator</td>
			<td style="width:111px;">Dark Reader</td>
			<td>DR196</td>
			<td>Wear correct eyewear&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:173px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:111px;">Fisher</td>
			<td>15585011</td>
			<td style="width:167px;">Carcinogen; other alternatives are Nancy 520, Gel red, etc.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Cannon EOS Rebel T3I camera</td>
			<td style="width:111px;">Cannon</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Apogee Model H4</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1704510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:173px;">Power Pac Basic Power Supply</td>
			<td style="width:111px;">Biorad</td>
			<td>1645050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Ficoll</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">BP525-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:111px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:155px;">B-392</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:173px;">Xylene Cyanol</td>
			<td style="width:111px;">Eastmen</td>
			<td style="width:155px;">T1579</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining if dna stained with a cyanine dye can be digested with restriction enzymes

Visualização do DNA para microscopia de fluorescência utiliza uma variedade de corantes como cianina corantes. Estes corantes são utilizados devido a sua alta afinidade e sensibilidade para DNA. A fim de determinar se as moléculas de DNA são comprimento total após a conclusão do experimento, um método é necessário para determinar se as moléculas manchadas são comprimento total por digestão com enzimas de restrição de DNA. No entanto, DNA manchada pode inibir as enzimas, portanto, um método é necessária para determinar que as enzimas se poderia usar para fluorocromo manchado de DNA. Neste método, o DNA está manchada com uma tintura de cianina durante a noite para permitir que o corante e DNA para equilibrar. Próximo, manchada de DNA é digerido com uma enzima de restrição, carregado em um gel e electrophoresed. As bandas de síntese de DNA experimentais são comparadas com um digest em silico para determinar a atividade de enzima de restrição. Se há o mesmo número de bandas como esperado, a reação é completa. Bandas mais do que o esperado indicam digestão parcial e menos bandas indicam digestão incompleta. A vantagem desse método é sua simplicidade e usa equipamento que precisaria de uma cientista para uma enzima de restrição do ensaio e electroforese do gel. Uma limitação deste método é que as enzimas disponíveis para a maioria dos cientistas são enzimas comercialmente disponíveis; no entanto, poderia ser usadas qualquer enzimas de restrição.

A fim de determinar que se um corante intercalante afetará uma enzima de restrição, digerindo o DNA, a ordem correta dos passos deve ser seguidos (Figura 1). Uma vez que o DNA é manchada e digerido com uma determinada enzima, uma foto do gel pode ser tomada para determinar o número de fragmentos e seu tamanho (Figura 2). A fim de determinar a eficiência da enzima, o número total de bandas visíveis esperados, dividido pelo...

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Determining if DNA Stained with a Cyanine Dye Can Be Digested with Restriction Enzymes

Moléculas de DNA para microscopia de fluorescência de coloração permite que um cientista para visualizá-las durante um experimento. O método apresentado aqui, as moléculas de DNA são previamente coradas com corantes fluorescentes e digeridas com metilação e enzimas de restrição não-metilação sensíveis.

Determinar se o DNA manchada com um cianina tintura pode ser digerido com enzimas de restrição

Visualization of DNA for fluorescence microscopy utilizes a variety of dyes such as cyanine dyes. These dyes are utilized due to their high affinity and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Sheathless Capillary Electrophoresis&#8211;Mass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Capillary ElectrophoresisÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry for Metabolic Profiling of Biological Samples

Sheathless Eletroforese Capilar-Espectrometria de Massa para Metabolic Profiling de amostras biológicas

In metabolomics, a wide range of analytical techniques is used for the global profiling of (endogenous) metabolites in complex samples. In this paper, a ...

Bioquímica

Imaging Amyloid Tissues Stained with Luminescent Conjugated Oligothiophenes by Hyperspectral Confocal Microscopy and Fluorescence Lifetime Imaging

Imagem de tecidos amiloides manchado com Luminescent Oligothiophenes conjugados por hiperespectrais Confocal imagem de vida de fluorescência e microscopia

Proteins that deposit as amyloid in tissues throughout the body can be the cause or consequence of a large number of diseases. Among these we find ...

Dual DNA Rulers to Study the Mechanism of Ribosome Translocation with Single-Nucleotide Resolution

Réguas duplas do ADN para estudar o mecanismo da translocação ribosome com a definição do único-nucleotide

The ribosome translocation refers to the ribosomal movement on the mRNA by exactly three nucleotides (nt), which is the central step in protein synthesis. ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Crio-EM e Análise de Partículas Únicas com Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

Preparation of Nucleosome Core Particles Complexed with DNA Repair Factors for Cryo-Electron Microscopy Structural Determination

Preparação de Partículas Nucleares Complexadas com Fatores de Reparo de DNA para Determinação Estrutural por Microscopia Crio-Eletrônica

DNA repair in the context of chromatin is poorly understood. Biochemical studies using nucleosome core particles, the fundamental repeating unit of ...

Determining the Thermodynamic and Kinetic Association of a DNA Aptamer and Tetracycline Using Isothermal Titration Calorimetry

Determinando a associação termodinâmica e cinética de um aptamer de DNA e tetraciclina usando calorimetria de titulação isotérmica

The determination of binding affinity and behavior between an aptamer and its target is the most crucial step in selecting and using an aptamer for ...

Measuring Ubiquitylated, SUMOylated, and ADP-Ribosylated DNA-Protein Crosslinks

Quantitative Detection of DNA-Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications

Quantitative Detection of DNA Protein Crosslinks and Their Post-Translational Modifications (Video) | JoVE 

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

DNA-protein crosslinks (DPCs) are frequent, ubiquitous, and deleterious DNA lesions, which arise from endogenous DNA damage, enzyme (topoisomerases, ...

Assessing Hepatic Steatosis with 3D Fluorescence Lipid Droplet Reconstruction

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment (Video) | JoVE 

Análise de Gotículas Lipídicas Coradas por Fluorescência com Reconstrução 3D para Avaliação da Esteatose Hepática

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...