Name: optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

Arbejdet var støttet af (1) et bryst kræft projekt legat (2014-2016) finansieret af handlingen for Breast Cancer Foundation og ALIVE 2013 gennem forskning, Innovation og udvikling Trust (RIDT) for University of Malta, (2) det medicinske fakultet & Kirurgi, University of Malta og (3) projekt ACT finansieres af Malta Rådet for Science & Technology gennem FUSION: The R & I teknologi udvikling program 2016. Offentliggørelsen af dette manuskript understøttes gennem Jove-Luminex grant.

Etisk godkendelse for brug af bryst væv materiale i denne undersøgelse blev indhentet fra Universitet forsknings etiske udvalg (UREC) for University of Malta (Ref: 22/2012).
1. væv forberedelse
<ol><li>Ved hjælp af passende H & E procedurer14, forberede farves reference tissue sektioner og digitalt scanne dias for reference under microdissection.</li>
	<li>Brug en mikrotom, skåret 20 µm væv sektioner på en RNAse-fri vandbad ved 40 ° C. Indsamle sektionerne på membran dias til laser microdissection ved hjælp af ren, RNase-dekontamineres udstyr og materialer.</li>
	<li>Tørre membran dias ved 37 ° C i en tørring inkubator natten over. Pletten ved hjælp af den relevante H & E procedure15 med molekylær biologi klasse løsninger og stiger den farvning tiden af hæmatoxylin til 6 min. Hvis det er påkrævet, pletten membran dias med passende immunhistokemiske protokoller16.</li>
</ol>2. laser Microdissection
<ol><li>Sæt dias grænser og kalibrere scenen bevægelse.<ol>
<li>Flytte visningen laser over på et tomt område af en membran dias. Kalibrere laser fokus ved at affyre en laser skud på stigende fokus intervaller (5%), indtil laseren begynder at gennembore gennem membranen. Draw og microdissect enhver form og finjustere laser fokus på at maksimere laser effektivitet under laser dissektion.</li>
		<li>Øge scenen bevægelse hastighed til et punkt, hvor laser dissektion effektivitet ikke er kompromitteret. Kalibrere laser på udvalgte mål linsen og kalibrere igen hvis ændre mål (laser hastighed på 1 – 15%), fokus på 70-75%, og magt på 90-100%, når du bruger 4 X målet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skan farves membran dias ved hjælp af den 4 X mål.</li>
	<li>Vælg og omringe målområderne for microdissection på diasset membran. Laser dissekere et minimumsareal af 42 mm2. Optage området dissekeret for at bestemme mængden af homogenisering prøvebuffer skal anvendes.</li>
	<li>Bruge cap lift mekanisme til at hente de dissekerede afsnit på diffuser caps af mærket rør knyttet til den relevante vedhæng. Hvis afsnittet dissekeret ikke er hentet ind på fælles landbrugspolitik, Gentag laser dissektion af området.</li>
</ol>3. Vævscentre Lysis
Bemærk: Flere løsninger og materialer er leveret sammen med kits nævnt i Tabel af materialer.
<ol><li>Forberede prøve lysis bruger homogenisering løsning og proteinase K i forholdet 60:1 kræves homogenisering blanding volumen.</li>
	<li>Afpipetteres 2,4 µL af homogenisering løsning til hvert rør for hver 1 mm2 i væv område, vortex for 10 s ved den maksimale hastighed, og der centrifugeres ved stuetemperatur i 5 s på 2.500 x g.</li>
	<li>Inkuber i en varme blok på 65 ° C i 12-18 h med rysten på 600 rpm.</li>
	<li>Der centrifugeres lysates på 21.000 x g i 5 min ved stuetemperatur.</li>
	<li>Ved hjælp af en pipette, omhyggeligt Aspirér klart supernatanten og dispensere ind i en mærket frisk rør. Undgå sugning væv/membran fragmenter, som dette kan reducere kvaliteten af resultaterne.</li>
	<li>Gemme klart supernatanten i et-80 ° C fryser.</li>
</ol>4. hybridisering-baseret analyse
<ol><li>Udføre følgende præparater.<ol>
<li>Pre varm lysis blandingen ved at placere reagensflaske i en inkubator ved 37 ° C i 30 min. og bland forsigtigt ved inversion.</li>
		<li>Hvis væv homogeniseret er frosset, tø op ved stuetemperatur og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. Vortex prøver ved den maksimale hastighed efter inkubation.</li>
		<li>Sæt den ryster inkubator ved 54 ° C og placere sonden i temperatur validering kit i en tom godt af en 96-brønd plade. Efter 2 h kontrollere temperaturen på den digitale termometer og indstille delta temperatur ryster inkubator at korrigere for enhver temperaturforskel.</li>
		<li>Tøvejr og vortex sonden indstillet og blokerer reagens for 10 s, centrifugeres ved stuetemperatur i 5 s på 2.500 x g, og holde på is.</li>
		<li>Holde Proteinase K hætteglasset på isen under brug.</li>
		<li>Der sonikeres capture perler på 46 KHz i 3 min., derefter vortex ved den maksimale hastighed for en anden 3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Forberede en 25 µL arbejder perle mix pr. brønd ved at skalere op de følgende reagenser i overensstemmelse hermed: 4,25 µL nukleasen-gratis vand, 16.65 µL af lysis blanding, 1,00 µL af blokering reagens, 0,10 µL af Proteinase K, 0,50 µL af capture perler, 2,50 µL af sonden sæt.</li>
	<li>Vortex arbejder perle mix for 10 s ved maksimal hastighed, derefter afpipetteres 25 µL/brønd i magnetisk separation plade.</li>
	<li>Pipette 25 µL væv homogenatet til en magnetisk separation 96-brønd plade og 25 µL homogenisering løsning 3 brønde som de tomme felter.</li>
	<li>Forsegle magnetisk separation pladen ved hjælp af en klar plast pres segl og pladen anbringes i inkubator ved 54 ± 1 ° C for 18-22 h mens ryste på 600 rpm.</li>
	<li>Forberede en 1 X buffer vaskeopløsning 24 brønde ved at blande 31,5 mL af RNase-fri vand med 0,1 mL af wash buffer komponent 1 og 1,67 mL af wash buffer komponent 2.</li>
	<li>Fjerne pladen fra inkubator. Indstil temperaturen den ryster rugemaskine til 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Montere magnetisk separation plade på håndholdte magnetisk plade vaskemaskinen og låse på plads. Fjerne presset segl og vente 1 min til de magnetiske perler til at løse.</li>
	<li>Vask trin: Invertere magnetisk separation plade monteret på pladen over vasken og skamplet forsigtigt på en silkepapir at fjerne resterende løsning. Ved hjælp af en multikanalpipette tilføje 100 µL 1 X buffer vaskeopløsning til hver brønd og vent 15 s. Gentag dette trin for at vaske pladen 3 gange.</li>
	<li>Tilsæt 50 µL forforstærker reagens til hver brønd. Forsegle pladen med en aluminium plade segl og ryste pladen på 800 rpm i 1 minut ved stuetemperatur. Inkuber i 1 time på 50 ± 1 ° C under omrystning på 600 rpm.</li>
	<li>Gentag trin 4.9 (vask trin).</li>
	<li>Tilsæt 50 µL forstærker reagens til hver brønd. Forsegle pladen med en aluminium plade segl og ryste pladen som i trin 4.10.</li>
	<li>Gentag trin 4.9 (vask trin).</li>
	<li>Vortex etiket sonden for 10 s ved maksimal hastighed. Tilsæt 50 µL af etiketten sonde til hver brønd. Forsegle og ryste plade (trin 4.10).</li>
	<li>Gentag trin 4.9 (vaskemaskine trin).</li>
	<li>Vortex Streptavidin phycoerythrin (SAPE) for 10 s ved maksimal hastighed. Tilsæt 50 µL af SAPE til hver brønd. Forsegle og ryste plade (trin 4.10).</li>
	<li>Gentag trin 4.9 (vask trin) undtagen brug SAPE wash buffer i stedet for wash bufferopløsning.</li>
	<li>Tilføje 130 µL af SAPE wash buffer til hver brønd og segl plade med en aluminium plade segl. Ryst pladen på 800 rpm ved stuetemperatur i 3 min.</li>
	<li>Start-up magnetisk bead analyzer. Udfør kalibrering og verifikation rutine ved at følge producentens anvisninger.</li>
	<li>Oprette en protokol om magnetisk bead analyzer ved hjælp af følgende parametre: stikprøvestørrelse: 100 µL; DD Gate: 5.000-25.000; Timeout: 90 s; Perle begivenhed/perle Region: 100; og klik på næste. Vælg de respektive perle numre i panelet og definere regionerne perle med de respektive mål gener som angivet af fabrikanten.</li>
	<li>Tilføje en ny analyse ved at vælge "Opret Batch ved hjælp af en eksisterende protokol" fra fanen batch . I plade layout udpege brøndene som Ukendt eller tomme, henholdsvis og angive en etiket for hver prøve i panelet prøver .</li>
	<li>Fjerne aluminium plade segl fra 96-brønd reaktion plade. Udsende pladen bakke ved at klikke på knappen Skub ud , læg pladen i magnetisk bead analyzer. Klik på trække| Kør Batch til at indlede analyzer. Efter læsning, skub ud og fjerne den 96-brønd plade. Ren og lukke magnetisk bead analyzer, som anbefalet af fabrikanten.</li>
</ol>5. dataanalyse
<ol><li>I Batch| Resultaterne under fanen Vælg filen respektive analyse og klik på knappen Eksporter to.csv . Åbne the.csv fil ved hjælp af et regneark software.</li>
	<li>Observere perle tæller og udelader alle resultater med < 40 perler/regionen.</li>
	<li>Gennemsnitlig ud værdierne i de blanke brønde og træne standardafvigelse (SD) og Limit of Detection (LOD) (blank gennemsnit + (3xSD)) pr. mål-genet. Indstil værdierne lavere end LOD som uopdaget. Bemærk: Hvis nogen af de normalisere udtryk værdier er uopdaget, betragte eksempeldataene som utilstrækkelig. Overvej udtryk værdier over 20.000 som over den øverste følsomhed grænse. Lysates af disse prøver skal fortyndes og re-analyseres.</li>
	<li>Subtraher det tomme gennemsnit fra de rå data pr. gen.</li>
	<li>Beregne den geometriske middelværdi af de valgte normalisere gener pr. prøve. Normalisere individuelle eksempeldata til den respektive geometriske middelværdi.</li>
	<li>Analysere data på data videnskab platforme eller bruger definerede algoritmer.<ol>
<li>Importere data til data videnskab platform ved at klikke på Tilføj Data. Træk datafilen ind Processen arbejdsområde og tilsluttes en [Vælg attributter] operatør, derefter til en Principal komponent analyse (PCA) operatør, og derefter til result port.</li>
		<li>Vælg delmængden af normaliserede gen data og en nominel variabel såsom bryst kræft undertype i operatoren Vælg attributten . Køre processen ved at klikke spille. Vælg den "Scatter 3D farve" i diagramtypografi og den nominelle variabel i feltet farve under fanen diagrammer . Vurdere PCA data variation på en 3-dimensional plot.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction:+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients.">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li><li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses.">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li><li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling.">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li><li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer:+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011.">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li><li>Schnitt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prognosis+of+invasive+breast+cancer:+from+morphology+to+molecular+taxonomy.">Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy.</a> Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).</li><li>Bae, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+in+carcinoma+cells+correlates+with+tumor+aggressiveness+and+poor+clinical+outcome+in+patients+with+invasive+breast+cancer.">Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).</li><li>Park, J., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+interactions+with+fibronectin+stimulate+epithelial-mesenchymal+transition.">Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition.</a> Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+breast+cancer+micrometastases+with+a+fibronectin-targeting+contrast+agent.">MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent.</a> Nat Commun. 6, 7984 (2015).</li><li>Antonyak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-derived+microvesicles+induce+transformation+by+transferring+tissue+transglutaminase+and+fibronectin+to+recipient+cells.">Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).</li><li>Moon, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+on+circulating+extracellular+vesicles+as+a+liquid+biopsy+to+detect+breast+cancer.">Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer.</a> Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).</li><li>Parker, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+risk+predictor+of+breast+cancer+based+on+intrinsic+subtypes.">Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.</a> J Clin Oncol. 27, (2009).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+the+PAM50-based+Prosigna+Breast+Cancer+Prognostic+Gene+Signature+Assay+and+nCounter+Analysis+System+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+tumor+specimens.">Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens.</a> BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections.">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li><li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).</li><li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Classification+of+Breast+Cancer+Patients+Using+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Derived+RNA+Samples.">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers &amp; Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li></ol>

The Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay er proprietære af Thermo Fisher videnskabelige.

En perle-baserede multiplex bDNA assay var optimeret til at kvantificere genekspression på nedbrudt RNA stammer fra FFPE bryst kræft væv og normal brystet kanaler. Optimering af analysen, normalisere involveret udvikle en algoritme til at klassificere brystkræft tumorer i luminale og basal undertyper udnytter 8 velkendte biomarkører og 5 potentielle gener. Yderligere oplysninger om datanormalisering blev gjort ved hjælp af permutationer af normalisere gener. Udvælgelsen af de normalisere gener var baseret på den bedste forudsigelse af receptor status ved hjælp af Luminal/Basal klassificeringen gener. For at klassificere Luminal/Basal undertyper fra FFPE væv, var normalisere gener valgt Beta-actin (ACTB), glyceraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) og Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Metoden kan være tilpasset til brug i andre diagnostiske og forskningsområder efter passende udvalg af den normalisere gen sæt. En vigtig anvendelse af denne metode i forskningssektoren er måling af biomarkører i arkivalier, der er godt kommenteret med kliniske resultater. Dette kunne validere potentielle prædiktive markører i retrospektive undersøgelser, hurtigt og præcist og undgå langsigtede Fremtidsstudier afventer sygdomsfri overlevelse og samlet overlevelsesdata. I øjeblikket er vores gruppe ved at undersøge brugen af analysen at opdage receptor-positiv exosomes, som kræver udvikling af en ny algoritme ved hjælp af alternative normalisere gener for yderligere oplysninger om datanormalisering. Brugen af flydende biopsier og robust gen expression assays vil give høj overførselshastighed multiplex assays tilpasset til patienthåndtering under behandlingen, og give et middel til at følge behandling effektivitet, potentielle tilbagefald på grund af modstand mod terapi, og den metastatisk kapacitet af tumor.
Denne metode også har en bred vifte af mulige applikationer i diagnosticering af tumorer og er tilpasset den aktuelle diagnostiske arbejdsproces. De vigtigste fordele ved denne metode i feltet diagnostiske omfatter: (1) gennemførelsen af høj overførselshastighed assays, (2) undtagen subjektivitet og tvetydige resultater med oprindelse fra image-baserede målinger, (3) nøjagtig påvisning af flere mål samtidigt, hvilket forbedrer nøjagtigheden og minimere brugen af dyrebare patientprøver, og (4) ingen krav om højt specialiserede faciliteter og menneskelige ressourcer. Optimeret prøvetagning proces, sammen med lav input materiale kræves til perle-baserede multiplex analysen, giver mulighed for yderligere undersøgelse af tumor heterogenitet; ved hjælp af laser microdissection til at adskille flere foci af maligne væv fra sektionen samme patient, er det muligt at sammenligne flere genekspression mellem dem samt med matchede normale væv (figur 4). Lav materialeforbruget er afgørende for diagnostisk program på tumor biopsier, der giver begrænset tumor væv. Analysen evne til at måle genekspression fra nedbrudt RNA prøver giver mulighed for nem transport af prøver til analyse i en institution eller til servicering laboratorier. Derudover var hele afsnittet analyse også muligt ved hjælp af H & E farves materiale (figur 1).
For succesen med denne protokol, er det bydende nødvendigt at: (1) sikre korrekt prøvetagning af tumor site/s, der er mængden for analysen, og (2) udvikle godt optimeret og validerede data normalisering algoritmer, for hvert gen udtryk panelet og/eller individuelle prognostiske eller forprogrammeret biomarkører. Den tidligere afhænger den tekniske erfaring af tekniker/videnskabsmand udføre prøveudtagning. Det anbefales at tage en ekstra kerne og forberede en væv microarray (TMA) i det samme format af multiplex magnetisk bead assay (96-brønds format). Dette vil give et arkiv af tumor websteder som en kopi af prøver anvendes til den RNA-baserede assay. TMAs kan også vurderes med andre teknikker til opfølgende forskning eller validering af resultaterne. Udvikling af normalisering algoritmer er afhængig af materialet undersøges og normalisere gener valgt til normalisering. Forskellige paneler af normalisering gener er udvalgt på grundlag af niveauet og variabiliteten af udtryk i prøven analyseres og dette varierer mellem kræft væv fra forskellige oprindelser, exosomes fra plasma, eller cirkulerende tumorceller. Validering af analysen omfatter prøve behandling da forskellige præparater vil også resultere i forskellige normalisering algoritmer.
For at opsummere, brugen af bDNA teknologi i kombination med magnetisk bead teknologi og udvælgelse af den rette panel af target gener, vil give den ekstra fordel at måle genekspression direkte i væv lysates stammer fra små mængder af patient materiale, herunder microdissected materiale, exosomes, og cirkulerende tumorceller. Tillæg til påvisning af tumor heterogenitet har korrekt brug af paneler potentiale til at opdage tumor stammer exosomes for tidlig diagnosticering og tidlig påvisning af tilbagefald. Da der er ikke behov for en nukleinsyre amplifikation skridt, signal forstærkning ved hjælp af bDNA teknologi, kombineret med perle-baserede multiplex, måler flere genekspression i klinisk kommenteret arkivalier og give en ressource for biomarkør validering.

Optimering af RNA baseret assays ved hjælp af formalin-fast paraffin-embedded (FFPE) arkivalier er udfordrende på grund af variation i kirurgisk væv forarbejdning og nedbrydning af RNA forårsaget af formalin anvendes til væv integritet bevarelse1, 2. For at overvinde begrænsningen af udfører præcis gen expression undersøgelser fra arkivalier, brugte vores gruppe bDNA multiplex magnetisk bead assay. I stedet for enzymatisk forstærkning af en target skabelon bruger bDNA teknologi hybridisering af specifikke sonder og forstærkning af en reporter signal3. Den korte anerkendelse sekvenser af opsamling og registrering af sonder er designet til at krydse til korte brudstykker af target RNA4. Desuden overvinder brug af væv homogeniseret som direkte råvaren i denne analyse, de uundgåelige tab af RNA, at resultaterne fra assays kræver forudgående RNA ekstraktion og oprensning. Signal forstærkning, brug af kort anerkendelse sekvenser og udelukkelse af en rensning skridt, bidrage til at reducere i tekniske variation af analysen. Teknologien giver mulighed for at multiplex assay (op til 80 RNA mål) og måle udtryk af et panel af mål fra lav materiale input. Denne protokol beskriver forberedelsen og farvning af vævsprøver for laser microdissection. Farvning på membran dias lette billeddannelse af tumor og histologiske arkitektur at levere nøjagtige udvalg og profilering af: (1) tumor og normale kanaler i brystvæv, og (2) den maligne celler kloner i heterogene tumorer.
Molekylær klassificering af brystkræft er en proces, der afhører molekylære markører for at kategorisere patient tumorer i tre molekylære klasser, dvs., luminale, human epidermal vækstfaktor receptor 2 (HER2)-beriget og basal undertype. Undertypen HER2-beriget er veldefinerede, med højt udtryk af HER2-receptoren, på grund af ERBB2 gen amplifikation, kombineret med lav eller fraværende østrogen receptor (ER) og progesteron receptor (PgR). Den luminale subtype er generelt positive for ER og basal subtype er i generelle negative for de tre receptorer (HER2, ER, PgR), og betydeligt overlap med triple negative breast cancer (TNBC) diagnostisk undertype5,6. Andre markører bruges til at bestemme epitel og mesenchymale egenskaber. Fibronektin (FN1) er en hovedbestanddel af bryst væv mesenchymale rum. Øget FN1 udtryk er ledsaget af højt Ki67 farvning, og viser en signatur for en mere invasive tumor7,8 og er forbundet med metastaser9. Det er interessant, blev FN1 fundet for at være til stede i microvesicles stammer fra tumorceller, som inducerede aktivering af mitogenic signaler i modtagerens fibroblaster10. Derfor, omløb microvesicles såsom exosomes er en potentiel markør for tidlig påvisning eller metastaser og tilbagefald11.
Tumor område udvalg for bryst kræft transcriptional subtyping er jævne udført af macrodissection12,13. For at overvinde væv heterogenitet og øge følsomheden, har vi kombineret klassisk væv farvning med multiplex Molekylær profilering metoder. Som et bevis for princippet, er to særskilte bryst kræft kloner defineret af deres epitelial mesenchymale signatur og metastatisk potentiale. Arbejdsgang af den beskrevne protokol kan let oversættes til den aktuelle opsætning af kliniske og bruges til selektivt isolerer og karakteriserer væv undertyper ved hjælp af målrettede mRNA profilering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatoxylin Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS16-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Aquaeous solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT110216-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Monosan</td>
			<td>MONX10963</td>
			<td>Working dilution: 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rabbit anti-mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0354</td>
			<td>Working dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER antibody (6F11)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>VPE614</td>
			<td>Working dilution: 1/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2 antibody (CB11)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>CB11-L-CE</td>
			<td>Working dilution: 1/325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody (MIB-1)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7240</td>
			<td>Working dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin Biotin Complex kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>4x, 10x, 20x and 40x objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection membranes</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>S0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi CellCamera 1.4</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>MX4285c-ACK07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Cellcut Plus</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffuser caps</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>50210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>52056A-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX200 100/200</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic bead analyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermaseal RTS Sealing Film</td>
			<td>Thermaseal</td>
			<td>765246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit</td>
			<td>Affymetrix/Panomics</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (50&#181;g/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Speed Vortex</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MSV-3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Silvercrest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASEZAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium 96-well plate seal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z721549-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Validation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td>
			<td>RapidMiner</td>
			<td></td>
			<td>Data Science Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation oven</td>
			<td>Hybaid (Thermo Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material

Nukleinsyre nedbrydning i arkivering væv, tumor heterogenitet og mangel på frisk frosset væv prøver kan negativ indflydelse på kræft diagnostic services i patologi laboratorier verden over. Gen amplifikation og udtryk diagnostiske test ved hjælp af arkivmateriale eller materiale, der kræver transport til servicering laboratorier, har brug for en mere robust og præcis test tilpasses aktuelle kliniske arbejdsgange. Vores research team optimeret brug af Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher videnskabelige) at kvantificere RNA i arkivmateriale ved hjælp af forgrenede-DNA (bDNA) teknologi på Luminex xMAP® magnetiske perler. Gen expression analysen beskrives i dette håndskrift er en roman, hurtig, og multiplex metode, der kan præcist klassificere brystkræft i de forskellige molekylære undertyper, udelade subjektivitet fortolkning iboende imaging teknikker. Hertil kommer, på grund af den lave indgang på materiale kræves, heterogene tumorer kan være laser microdissected ved hjælp af hæmatoxylin og Eosin (H & E) farves sektioner. Denne metode har en bred vifte af mulige applikationer herunder tumor klassifikation med diagnostiske potentiale og måling af biomarkører i flydende biopsier, der ville give bedre patienthåndtering og sygdomsovervågning. Derudover er kvantitativ måling af biomarkører i arkivalier nyttige i onkologi forskning med adgang til biblioteker af klinisk kommenteret materiale, hvor retrospektive undersøgelser kan validere potentielle biomarkører og deres kliniske resultater korrelation.

Den beskrevne metode er blevet anvendt til samtidig måling af 40 udskrifter i H & E farves (figur 1), microdissected (figur 2) forringet stærkt FFPE materiale. Bruger denne metode, vise vi det nøjagtige karakterisering af receptoren status (figur 3A), klassifikation af tumorer i luminale og basal molekylære undertyper17og differentierede udtryk af mesenchymale markør, FN1, når man sammenligner tumor og matchede kontrol væv (figur 3B), i de forskellige receptor positive og negative undertyper.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Figur 1: genekspression ved hjælp af H & E farves materiale. Korrelation mellem et udtryk profil stammer fra en unstained tumor afsnit i forhold til en farves tumor sektion. [Pearson korrelation p-værdi = 5.34E-26]. Gengivet med tilladelse17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Figur 2: Laser microdissection af FFPE væv. (A) H & E farves dias; (B) immunhistokemisk farvning for ER udtryk; (C) HER2 immunhistokemisk farvning; (D) Unstained 20 µm sektion på laser microdissection membran dias. Den gule pil angiver et område af invasive tumor, der ikke er klart afgrænset skyldes manglende farvning. (E) A 20 µm afsnit plettet med H & E for bedre afgrænsning af områder af interesse. Hvide pile angiver laser dissektion trail, mens den røde pil viser laser fokus under dissektion. Alle illustrationer blev fanget ved 10 x forstørrelse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Figur 3: udtryk for (A) receptor status og b mesenchymale markør FN1, i bryst tumor i forhold til matchet normal. Klassisk diagnostiske bryst kræft undertyper er defineret som diagnostisk resultatet ved hjælp af Immunhistokemi og fluorescens i situ hybridisering (FISH) for HER2 tvetydige immunhistokemisk farvning. Den normaliserede udtryk for (A) HER2 og ER, (B) FN1 målt ved hybridisering-baseret analysen er illustreret i HER2 positive, ER positiv og TNBC tilfælde i forhold til patienten matchede normale brystvæv. Kruskal-Wallis prøvningsstatistikken (K-W χ2) viser, at udtrykket af HER2 betydeligt (p < 0,05) højere i tumor væv i modsætning til den matchede normale væv i HER2 positive kohorten og betydeligt lavere i TNBC kohorten. ER udtrykket blev ikke fundet for at være væsentligt højere i tumor væv i modsætning til den matchede normale i den ER positive og TNBC kohorter. FN1 er betydeligt højere i tumor væv i de HER2 og ER positiv undertyper og viser en tendens til at være betydeligt forhøjet i tumor væv også i TNBC kohorte. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Figur 4: Case study: tumor heterogenitet. Morfologisk adskiller sig tumorer blev microdissected og behandlet som særskilte prøver. (A) master scanning af afsnittet H & E. (B, C) Et 10 x og 40 x forstørrelse, henholdsvis for hver tumor morfologi identificeret. (D) immunhistokemisk farvning for ER ved 10 x forstørrelse. (E) immunhistokemisk farvning for Ki67 ved 10 x forstørrelse viser en højere mitotiske aktivitet i tumor 1. (F) normaliseret udtryk niveauer for ESR1 gen i hver tumor viser relativt høje og lige udtryk mellem tumorer som forventet fra immunhistokemiske resultat. (G) normaliseret udtryk niveauer af FN1, en mesenchymale markør, hvor øget FN1 udtryk er ledsaget af højt Ki67 farvning viser en signatur for en mere invasive tumor. Inverse er observeret i tumor 2, der synes at være en langsommere prolifererende tumor med en lavere malignt potentiale repræsenteret ved nedsat FN1 udtryk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nukleinsyre nedbrydning i arkivering væv, tumor heterogenitet og mangel på frisk frosset væv prøver kan negativ indflydelse på kræft diagnostic services i patologi laboratorier verden over. Dette manuskript beskriver optimering af et panel af biomarkører ved hjælp af en multiplex magnetisk bead assay for at klassificere brystkræft.

Optimering af en Multiplex RNA-baserede udtryk analyse ved hjælp af bryst kræft arkivalier

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Ved hjælp af en Mikrofluid Platform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protokol for Biofilm Streamer Dannelse i en mikrofluidindretning med Micro-søjler

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Fremstilling af et bioaktivt, PCL-baserede &quot;Self-montering&quot; formhukommelse polymerskelet

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generisk protokol for optimering af heterolog Protein produktion ved hjælp af automatiserede Microbioreactor teknologi

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

En hurtig Image-baserede bakteriel virulens analyse ved hjælp af Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

En ny Ex Vivo Model for evaluering af endoskopisk submukøse injektion materielle ydeevne

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Materiale dannelse af rekombinante Spider Silks gennem vandig Solvation ved hjælp af varme og tryk

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex Genome redigering af Saccharomyces cerevisiae og skabelsen af gær pixel kunst

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...