Name: optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

O trabalho foi apoiado por (1) uma mama câncer projeto bolsa de estudos (2014-2016) financiado pela ação para Breast Cancer Foundation e ALIVE 2013 através da pesquisa, inovação e desenvolvimento Trust (RIDT) da Universidade de Malta, (2) da faculdade de medicina & Cirurgia, Universidade de Malta e (3) projeto ACT financiado pelo Conselho de Malta para ciência & tecnologia por meio de fusão: O R & I 2016 de programa de desenvolvimento de tecnologia. A publicação deste manuscrito é suportada através da concessão de Jove-Luminex.

Aprovação ética para uso de material de tecido mamário neste estudo foi obtida da Universidade pesquisa ética Comitê (UREC) da Universidade de Malta (Ref: 22/2012).
1. tecido preparação
<ol><li>Usando o apropriado H & E procedimentos14, preparar referência manchada cortes histologicos e digitalmente digitalizar slides para referência durante microdissection.</li>
	<li>Usando um micrótomo, corte 20 seções de tecidos µm para um banho de água livre de RNAse a 40 ° C. Recolha as seções sobre slides de membrana para o laser microdissection usando materiais e equipamento limpo e descontaminado de RNase.</li>
	<li>Seca as lâminas de membrana a 37 ° C numa incubadora de secagem durante a noite. Mancha usando o apropriado H & E procedimento15 com soluções de grau de biologia molecular e aumentar o tempo de coloração de hematoxilina-6 min. Se necessário, mancha os slides de membrana com a imuno-histoquímica adequados protocolos16.</li>
</ol>2. laser Microdissection
<ol><li>Definir os limites de slide e calibrar o movimento de palco.<ol>
<li>Mova a vista do laser em uma área vazia de um slide de membrana. Calibre o foco do laser por disparar um laser atirou em intervalos de foco (5%) a aumentar até o laser começa a perfurar através da membrana. Empate e microdissect qualquer forma e finetune o foco do laser para maximizar a eficiência do laser durante a dissecção do laser.</li>
		<li>Aumente a velocidade de movimento de palco a um ponto onde a eficiência de dissecação do laser não é comprometida. Calibrar o laser para o selecionado da lente objetiva e re-calibrar se alterando objectivos (laser 1 – 15% de velocidade), foco em 70-75% e o poder em 90-100% quando se utiliza o objectivo X 4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digitalizar slides membrana manchada usando o objectivo X 4.</li>
	<li>Selecione e cercar as áreas-alvo para microdissection do slide de membrana. Laser dissecar uma superfície mínima de 42 mm2. Registro da área dissecada para determinar o volume de amortecedor homogeneização da amostra a ser usado.</li>
	<li>Use o mecanismo do elevador de tampa para recuperar a seção dissecada para as tampas de difusor de tubos etiquetados anexado para o apêndice apropriado. Se a seção dissecada não é obtida para a tampa, repita a dissecação do laser da área.</li>
</ol>3. tecido Lysis
Nota: Várias soluções e materiais são fornecidos juntamente com kits de mencionado na Tabela de materiais.
<ol><li>Prepare o volume necessário de mistura homogeneização para lise de amostra usando a homogeneização solução e proteinase K em uma relação de 60:1.</li>
	<li>Pipete 2.4 µ l de homogeneizar a solução em cada tubo para cada 1mm2 de área de tecido, vórtice para 10 s na velocidade máxima e centrifugar a temperatura ambiente por 5 s a 2.500 x g.</li>
	<li>Incube em um bloco de aquecimento a 65 ° C por 12 – 18 h com agitação a 600 rpm.</li>
	<li>Centrifugue os lysates a 21.000 x g durante 5 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>Utilizando uma pipeta, cuidadosamente Aspire o sobrenadante claro e dispense em um tubo rotulado de fresco. Evite aspirar os fragmentos de tecido/membrana como isto pode reduzir a qualidade dos resultados.</li>
	<li>Armazene o sobrenadante claro em um freezer-80 ° C.</li>
</ol>4. com base em hibridação ensaio
<ol><li>Execute as seguintes preparações.<ol>
<li>Pré-aquecer a mistura de Lise, colocando o frasco de reagente na incubadora a 37 ° C por 30 min e misture suavemente por inversão.</li>
		<li>Se o tecido homogenates são congelados, descongelar à temperatura ambiente e incubar a 37 ° C por 30 min. Vortex as amostras à velocidade máxima após a incubação.</li>
		<li>Definir a incubadora agitando a 54 ° C e coloque a sonda do kit de validação de temperatura em um poço vazio de uma placa de 96 poços. Após 2 h verificar a temperatura do termômetro digital e regule a temperatura do delta de tremer a incubadora para corrigir qualquer diferença de temperatura.</li>
		<li>Degelo e vortex a sonda definida e bloqueio de reagente para 10 s, centrifugar a temperatura ambiente por 5 s em 2.500 x g e manter no gelo.</li>
		<li>Mantenha o frasco de Proteinase K no gelo durante o uso.</li>
		<li>Proceda à sonicação os grânulos de captura de 46 KHz por 3 min, então vórtice na velocidade máxima por mais 3 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar uma mistura de grânulo de trabalho µ l 25 por alvéolo pela ampliação em conformidade os seguintes reagentes: 4,25 µ l de água livre de Nuclease, 16.65 µ l da mistura de Lise, 1,00 µ l de reagente 0,10 µ l de Proteinase K, 0,50 µ l de grânulos de captura, 2,50 µ l de sonda conjunto de bloqueio.</li>
	<li>Vórtice o mix de grânulo de trabalho para 10 s velocidade máxima, em seguida Pipetar 25 µ l/poço para a placa de separação magnética.</li>
	<li>Pipetar 25 µ l tecido homogeneizado para uma placa de 96 poços de separação magnética e 25 µ l de solução 3 poços como os espaços em branco de homogeneização.</li>
	<li>A placa de separação magnética usando um selo de pressão de plástico transparente do selo e coloque a placa na incubadora a 54 ± 1 ° C por 18 a 22 h agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Prepare uma solução tampão de lavagem de 1x para 24 poços misturando água 31,5 mL de RNase-livre com 0,1 mL de lavagem do buffer componente 1 e 1,67 mL de componente de tampão de lavagem 2.</li>
	<li>Retire a placa da incubadora. Regule a temperatura da incubadora a agitação de 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Fixar a placa de separação magnética na máquina de lavar à mão placa magnética e trave no lugar. Remova o selo de pressão e esperar 1 min para os grânulos magnéticos resolver.</li>
	<li>Etapa de lavagem: Inverta a placa de separação magnética, montada sobre o prato sobre a pia e a mancha suavemente sobre um papel absorvente para retirar a solução residual. Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 µ l de 1 X solução de tampão de lavagem em cada poço e espere 15 s. Repita este passo para lavar a placa 3 vezes.</li>
	<li>Pipete 50 µ l de reagente pré-amplificador para cada poço. A placa do selo com um selo de chapa de alumínio e agitar a placa a 800 rpm durante 1 min à temperatura ambiente. Incube durante 1 h a 50 ± 1 ° C e agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Repita a etapa 4.9 (etapa de lavagem).</li>
	<li>Pipete 50 µ l de reagente de amplificador para cada poço. A placa do selo com um selo de chapa de alumínio e agitar a placa como na etapa 4.10.</li>
	<li>Repita a etapa 4.9 (etapa de lavagem).</li>
	<li>Vórtice da sonda de rótulo para 10 s na velocidade máxima. Adicione 50 µ l da sonda de rótulo para cada poço. Fechar e agitar a placa (passo 4.10).</li>
	<li>Repita a etapa 4.9 (etapa de lavagem).</li>
	<li>Vórtice a Streptavidin ficoeritrina (SAPE) por 10 s na velocidade máxima. Adicione 50 µ l de SAPE a cada poço. Fechar e agitar a placa (passo 4.10).</li>
	<li>Repita etapa 4.9 (etapa de lavagem) exceto uso o tampão de lavagem SAPE em vez de solução-tampão de lavagem.</li>
	<li>Adicione 130 µ l de tampão de lavagem SAPE para cada prato bem e selo com um selo de chapa de alumínio. Agite a placa a 800 rpm, à temperatura ambiente por 3 min.</li>
	<li>Arranque o analisador magnético do grânulo. Realizar a calibração e verificação de rotina, seguindo as instruções do fabricante.</li>
	<li>Configurar um protocolo sobre o analisador magnético do grânulo, usando os seguintes parâmetros: tamanho da amostra: 100 µ l; Portão DD: 5.000 – 25.000; Tempo limite: 90 s; Região do evento/pérola grânulo: 100; e clique em Avançar. Selecione os números respectivos grânulo no painel e definir as regiões de grânulo com os genes de destino correspondente, conforme indicado pelo fabricante.</li>
	<li>Adicione uma nova análise, selecionando "lote criar usando um protocolo existente" da guia lotes . No layout de placa designar os poços como desconhecido ou em branco, respectivamente e fornecer um rótulo para cada amostra no painel amostras .</li>
	<li>Remova o selo de placa de alumínio da placa de 96 poços de reação. Ejetar a bandeja da placa clicando no botão Eject , carregar a placa para o analisador magnético do grânulo. Clique em retrair| Lote de executar para iniciar o analisador. Após a leitura, ejetar e retire a placa de 96 poços. Limpar e desligar o analisador magnético do grânulo, conforme recomendado pelo fabricante.</li>
</ol>5. análise de dados
<ol><li>No lote| Guia de resultados , selecione o arquivo de análise respectivos e clique no botão Exportar to.csv . The.csv aberto arquivo usando um software de planilha eletrônica.</li>
	<li>Observar as contagens do grânulo e omitir qualquer resultado com grânulos de 40 </região.</li>
	<li>Média, os valores dos poços em branco e elaborar o desvio padrão (SD) e limite de deteção (LOD) (em média de branco + (3xSD)) por gene alvo. Defina os valores mais baixos do que o LOD como sem ser detectado. Nota: Se qualquer um dos valores de expressão de normalização são detectadas, considere os dados de exemplo como inadequada. Considere valores de expressão mais 20.000 como acima do limite superior de sensibilidade. Os lysates destas amostras deve ser diluídos e re-analisados.</li>
	<li>Subtrai a média em branco a partir dos dados brutos por gene.</li>
	<li>Calcule a média geométrica dos genes normalizando selecionados por amostra. Normalize os dados de amostra individual para a respectiva média geométrica.</li>
	<li>Analise os dados em plataformas de ciência de dados ou usando algoritmos definidos.<ol>
<li>Importe os dados para a plataforma de ciência de dados clicando em Adicionar dados. Arraste o arquivo de dados para o Processo de trabalho e conectar a um operador [Selecione atributos] , então um principais (PCA) da análise de componentes operador e depois para o porto de t resul.</li>
		<li>No Atributo selecione operador selecionar o subconjunto de dados normalizado gene e uma variável nominal como subtipo de câncer de mama. Execute o processo clicando em jogar. Na guia gráficos , selecione o "Scatter cor 3D" no estilo gráfico e a variável nominal no campo de cores . Avalie a variabilidade de dados PCA em um terreno de 3-dimensional.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction:+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients.">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li><li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses.">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li><li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling.">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li><li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer:+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011.">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li><li>Schnitt, S. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-derived+microvesicles+induce+transformation+by+transferring+tissue+transglutaminase+and+fibronectin+to+recipient+cells.">Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).</li><li>Moon, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+on+circulating+extracellular+vesicles+as+a+liquid+biopsy+to+detect+breast+cancer.">Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer.</a> Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).</li><li>Parker, J. 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A Invitrogen™ QuantiGene™ Plex ensaio é proprietário da Thermo Fisher Scientific.

Um ensaio baseado em grânulo multiplex plasmático foi otimizado para quantificar a expressão do gene em RNA degradado derivado de tecido de câncer de mama FFPE e ductos mamários normais. Otimizando o ensaio, envolvido a desenvolver um algoritmo para classificar os tumores de câncer de mama em subtipos luminal e basais, utilizando 8 conhecidos biomarcadores e potencial de 5 normalizando os genes. Normalização de dados foi feita usando permutações dos genes normalizando. A seleção dos genes normalizando baseou-se na melhor previsão do status do receptor usando os genes do classificador Luminal/Basal. Para classificar subtipos Luminal/Basal dos tecidos FFPE, normalizando genes selecionados foram Beta-actina (ACTB), gliceraldeído 3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e hipoxantina Fosforibosiltransferase 1 (HPRT1).
O método pode ser adaptado para uso em outro diagnóstico e investigação das áreas de seleção adequada do conjunto de genes de normalização. Uma aplicação importante desse método no domínio da investigação é a medição de biomarcadores em arquivos um material que é bem anotado com desfechos clínicos. Isto poderia validar potenciais marcadores preditivos em estudos retrospectivos, rapidamente e com precisão e evitar estudos prospectivos a longo prazo aguardando dados de sobrevivência global e sobrevivência livre de doença. Atualmente, nosso grupo está investigando o uso do teste para detectar o receptor-positivo exosomes, que exige o desenvolvimento de um novo algoritmo usando alternativo normalizando os genes para a normalização de dados. O uso de líquido biópsias e ensaios de expressão do gene robusto permitirá ensaios multiplex alto throughput, adaptados para a gestão do paciente durante o tratamento e fornecer um meio para acompanhar a eficácia do tratamento, possíveis recaídas devido à resistência à terapia e o capacidade metastática do tumor.
Esse método também tem uma vasta gama de aplicações possíveis no diagnóstico de tumores e é adaptado para o fluxo de trabalho atual e diagnóstico. As principais vantagens deste método no campo diagnóstico incluem: (1) execução de ensaios de alta taxa de transferência, (2) excluindo a subjetividade e resultados ambíguos, originários de medidas baseada em imagem, (3) detecção precisa de alvos múltiplos ao mesmo tempo, que aumentar a precisão e não minimizar o uso de amostras de pacientes preciosas e (4) nenhuma exigência para instalações altamente especializadas e recursos humanos. O processo de amostragem otimizado, juntamente com a baixa entrada de material necessário para o ensaio multiplex baseada em grânulo, permite mais investigação da heterogeneidade de tumor; usando o laser microdissection para separar, com precisão, vários focos de tecido maligno da mesma seção do paciente, é possível comparar vários expressão gênica entre eles, bem como com tecido normal correspondente (Figura 4). Baixa entrada de material é vital para a aplicação diagnóstica em biópsias de tumor que fornecem o tecido do tumor limitado. A capacidade do ensaio para medir a expressão gênica de amostras de RNA degradadas permite fácil transporte de amostras para análise dentro de uma instituição ou a manutenção de laboratórios. Além disso, a análise da seção inteira também foi possível usando H & E manchado material (Figura 1).
Para o sucesso do presente protocolo, que é imperativo: (1) Certifique-se de uma amostragem adequada do tumor local/s que lysed para o ensaio e (2) desenvolver bem otimizado e validado algoritmos de normalização de dados, para cada painel de expressão de gene e/ou prognóstico individual ou biomarcadores preditivos. O primeiro depende da experiência técnica do técnico/cientista realizar a amostragem. É aconselhável tomar um núcleo adicional e preparar um microarray do tecido (TMA) no mesmo formato do ensaio multiplex do grânulo magnético (formato de 96 poços). Isto irá fornecer um arquivo de localizações tumorais como uma réplica das amostras utilizadas para o ensaio baseado em RNA. TMAs também podem ser avaliadas com outras técnicas para pesquisa de acompanhamento ou a validação dos resultados. O desenvolvimento de algoritmos de normalização é dependente do material a ser investigado e os normalização genes selecionados para normalização. Diferentes painéis de normalizar os genes são selecionados com base no nível e variabilidade de expressão na amostra analisada, e isso varia entre os tecidos de câncer de diferentes origens, exosomes de plasma ou células tumorais de circulação. Validação do ensaio inclui amostra de processamento desde várias preparações também resultará em algoritmos diferentes de normalização.
Para resumir, o uso da tecnologia plasmático em combinação com a tecnologia de microesferas magnéticas e a seleção do painel adequado de genes alvo, proporcionará a vantagem adicional de medição expressão gênica diretamente no tecido lysates derivado de pequenas quantidades de material do paciente, incluindo material, exosomes microdissected e circulação de células tumorais. Além de detecção de heterogeneidade do tumor, o uso adequado de painéis tem o potencial de detectar tumor derivado exosomes para o diagnóstico precoce e detecção precoce de recidivas. Desde que não há nenhuma necessidade para uma etapa de amplificação de ácidos nucleicos, a amplificação de sinal, usando a tecnologia plasmático, combinada com os cinemas baseado em grânulo, mede múltipla expressão gênica em material de arquivo clinicamente-anotado e fornecer um recurso para validação de biomarcador.

Otimização dos ensaios de RNA baseado usando fixada em formol parafina (FFPE) material de arquivo é desafiador devido à variabilidade no processamento do tecido cirúrgico e degradação do RNA causada por formol utilizado para tecido de preservação de integridade1, 2. Para superar a limitação de realizar estudos de expressão do gene exata do material de arquivo, nosso grupo usado o ensaio de multiplex do grânulo magnético plasmático. Em vez de amplificação enzimática de um modelo de destino, a tecnologia plasmático usa hibridização de sondas específicas e amplificação de um sinal de repórter3. As sequências de reconhecimento curto das sondas captura e deteção são projetadas para cruzar a curtos fragmentos de RNA de destino4. Além disso, o uso de tecido homogenates como matérias-primas direto neste ensaio, supera a inevitável perda de RNA que resulta da necessidade de purificação e extração de RNA prévia de ensaios. Amplificação de sinal, o uso de sequências de reconhecimento de curta e a exclusão de uma etapa de purificação, contribuam para a redução na variação técnica do ensaio. A tecnologia oferece a possibilidade de multiplexar o ensaio (até 80 destinos de RNA) e medir a expressão de um painel de metas de baixo material de entrada. Este protocolo descreve a preparação e a coloração das amostras de tecido para o laser microdissection. Mancha nas corrediças de membrana facilitar a imagem do tumor e arquitetura histológica para fornecer a seleção exata e perfilagem de: (1) o tumor e dutos de tecido mamário normais e (2) a célula maligna clones dentro de tumores heterogêneos.
Classificação molecular do cancro da mama é um processo que interroga marcadores moleculares para categorizar os pacientes tumores em três classes moleculares, ou seja, receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano, luminal (HER2)-subtipo enriquecido e basal. O subtipo enriquecido HER2 é bem definido, com alta expressão do receptor HER2, devido a amplificação do gene ERBB2, combinado com baixos ou ausentes de receptor de estrógeno (ER) e receptores de progesterona (PgR). O subtipo luminal é geralmente positivo para ER e o subtipo basal são em geral negativo para os três receptores (HER2, ER, PgR) e significativamente sobreposições com o triplo negativo mama câncer (TNBC) diagnóstico do subtipo5,6. Outros marcadores são usados para determinar características epiteliais e mesenquimais. Fibronectina (FN1) é um componente principal do compartimento mesenquimais de tecido da mama. Expressão aumentada de FN1 é acompanhada por Ki67 alta coloração e mostra uma assinatura para um mais invasivo tumor7,8 e está associado a metástase9. Curiosamente, FN1 foi encontrado para estar presente na microvesicles originários das células do tumor, que induziu a ativação dos sinais mitogênico em fibroblastos destinatário10. Daí, circulação aumentada como exosomes são um potencial marcador da deteção adiantada ou metástase e recaída11.
Seleção de área de tumor de câncer de mama transcriptional subtipos recorrentemente foi executada por macrodissection12,13. Para superar a heterogeneidade do tecido e aumentar a sensibilidade, combinamos confiantemente clássico tecido mancha com métodos de criação de perfil moleculares multiplex. Como prova de princípio, dois clones de câncer de mama distintos foram definidos por sua assinatura mesenquimal epitelial e potencial metastático. O fluxo de trabalho do protocolo descrito pode ser facilmente traduzido para a configuração actual do clínica e usado para isolar e caracterizar os subtipos de tecidos usando perfis de mRNA alvo selectivamente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatoxylin Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS16-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Aquaeous solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT110216-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Monosan</td>
			<td>MONX10963</td>
			<td>Working dilution: 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rabbit anti-mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0354</td>
			<td>Working dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER antibody (6F11)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>VPE614</td>
			<td>Working dilution: 1/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2 antibody (CB11)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>CB11-L-CE</td>
			<td>Working dilution: 1/325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody (MIB-1)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7240</td>
			<td>Working dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin Biotin Complex kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>4x, 10x, 20x and 40x objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection membranes</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>S0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi CellCamera 1.4</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>MX4285c-ACK07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Cellcut Plus</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffuser caps</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>50210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>52056A-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX200 100/200</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic bead analyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermaseal RTS Sealing Film</td>
			<td>Thermaseal</td>
			<td>765246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit</td>
			<td>Affymetrix/Panomics</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (50&#181;g/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Speed Vortex</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MSV-3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Silvercrest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASEZAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium 96-well plate seal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z721549-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Validation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td>
			<td>RapidMiner</td>
			<td></td>
			<td>Data Science Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation oven</td>
			<td>Hybaid (Thermo Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material

Degradação do ácido nucleico em tecido arquivamento, heterogeneidade do tumor e a falta de amostras de tecido congelado fresco pode afetar negativamente o serviços de diagnóstico de câncer em laboratórios de patologia em todo o mundo. Amplificação do gene e expressão diagnóstico teste usando arquivamento ou material que requer transporte para manutenção de laboratórios, precisa de um teste mais robusto e preciso, adaptado para fluxos de trabalho clínicos atuais. Nossa equipe de pesquisa otimizada a utilização da Invitrogen™ QuantiGene™ Plex ensaio (Thermo Fisher Scientific) para quantificar o RNA em material de arquivo usando tecnologia ramificada-DNA (plasmático) em Luminex xMAP® grânulos magnéticos. O ensaio de expressão do gene descrito neste manuscrito é um método de rápida e multiplex de romance, que com precisão pode classificar o câncer de mama para os diferentes subtipos moleculares, omitindo a subjetividade da interpretação inerente em técnicas de imagem. Além disso, devido a baixa entrada de material necessário, tumores heterogêneos podem ser microdissected do laser usando hematoxilina e eosina (H & E) manchadas de seções. Este método tem uma ampla gama de aplicações possíveis, incluindo a classificação de tumor com potencial diagnóstico e medição de biomarcadores em biópsias de líquido, que permitiriam a melhor gestão do paciente e acompanhamento da doença. Além disso, a medição quantitativa de biomarcadores em material de arquivo é útil na pesquisa de Oncologia, com acesso a bibliotecas de material clinicamente-anotado, em que estudos retrospectivos podem validar potenciais biomarcadores e seus resultados clínicos correlação.

O método descrito tem sido aplicado para a medição simultânea de 40 transcritos em H & E manchado (Figura 1), microdissected (Figura 2) altamente degradadas material FFPE. Usando esse método, mostramos a caracterização precisa do status do receptor (Figura 3A), classificação de tumores em subtipos moleculares luminal e basal17e expressão diferencial do marcador mesenquimal, FN1, comparando-se tumor e o tecido de controle correspondente (Figura 3B), nos vários subtipos de positivo e negativo do receptor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Figura 1: expressão gênica usando H & E manchado material. Correlação entre um perfil de expressão derivada de uma seção de tumor imaculado em comparação com uma seção de tumor manchada. [De correlação de Pearson p-valor = 5.34E-26]. Reproduzido com permissão de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Figura 2: Laser microdissection dos tecidos FFPE. (A) H & E slide manchado; Imuno-histoquímica (B) coloração para expressão de ER; (C) HER2 coloração imuno-histoquímica; (D) Unstained seção 20 µm em slides de membrana microdissection do laser. A seta amarela indica uma área de tumor invasivo que não é claramente demarcada devido a falta de coloração. (E), A seção de 20 µm corados com H & E, para melhor delimitação de áreas de interesse. Setas brancas indicam trilha de dissecação do laser, enquanto a seta vermelha mostra o foco do laser durante a dissecção. Todas as ilustrações foram capturadas em ampliação de 10x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Figura 3: expressão de status do receptor (A) e (B) mesenquimal marcador FN1, no tumor de mama em comparação com correspondência normal. Os subtipos de câncer de mama diagnóstico clássico são definidos conforme o resultado diagnóstico usando imuno-histoquímica e fluorescência em situ da hibridação (peixe) para coloração de imuno-histoquímica equívoca de HER2. A expressão normalizada do (A) HER2 e ER, FN1 (B) medida pelo ensaio baseados em hibridização é ilustrada em HER2 positiva, ER positivo e casos TNBC comparados ao paciente correspondem tecido mamário normal. A estatística de teste Kruskal Wallis (K-W χ2) mostra que a expressão de HER2 é significativamente (p < 0,05) superior do tecido do tumor em oposição o tecido normal correspondente a coorte de HER2 positiva e significativamente menor na coorte TNBC. Expressão de ER não foi encontrado para ser significativamente mais elevado do tecido do tumor em oposição a normal correspondente no ER positivo e coortes TNBC. FN1 é significativamente maior no tecido do tumor nos subtipos positivos HER2 e ER e mostra uma tendência para ser significativamente elevados no tecido do tumor também na coorte TNBC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Figura 4: estudo de caso: heterogeneidade tumor. Tumores morfologicamente distintas foram microdissected e trataram como amostras distintas. (A), o mestre faz a varredura da seção H & E. (B, C) Um 10 x e ampliação de 40x, respectivamente para cada morfologia do tumor identificada. (D) imuno-histoquímica mancha para ER na ampliação de 10x. (E) imuno-histoquímica mancha para Ki67 em ampliação de 10x mostrando uma maior atividade mitótica no tumor 1. (F) normalizado os níveis de expressão do gene ESR1 em cada tumor mostrando uma expressão relativamente alta e igual entre tumores como esperado a partir do resultado de imuno-histoquímica. (G) normalizado os níveis de expressão de FN1, um marcador mesenquimal, onde a expressão aumentada de FN1 é acompanhada por Ki67 alta coloração mostrando uma assinatura para um tumor mais invasivo. O inverso é observado no tumor 2, que parece ser um tumor mais lento proliferando com um menor potencial maligno representado pela reduzida expressão FN1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Degradação do ácido nucleico em tecido arquivamento, heterogeneidade do tumor e a falta de amostras de tecido congelado fresco pode afetar negativamente o serviços de diagnóstico de câncer em laboratórios de patologia em todo o mundo. Este manuscrito descreve a otimização de um painel de biomarcadores usando um ensaio de multiplex do grânulo magnético para classificar os cancros da mama.

Otimização de um ensaio de expressão baseada em RNA Multiplex usando Material de arquivo de câncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Profiling MicroRNA de Alto Rendimento: Multiplex Optimized qRT-PCR em Escala nanolitros no IFCS Fluidigm dinâmico ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Bioengenharia

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Alto rendimento Gerador Protein Expression Usando uma plataforma microfluídica

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocolo para a formação de biofilme Streamer em um dispositivo micro com micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Fabricação de uma baseada em PCL Bioativos, &quot;Self-fitting&quot; Memória de Forma Polymer Andaime

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para otimização da produção de proteína heteróloga usando tecnologia automatizada de Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Um novo modelo Ex Vivo para a avaliação de desempenho de Material de injeção submucosa endoscópica

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteção da endotoxina em Nano-formulações usando Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) ensaios

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Formação de Material de Seda de Aranha Recombinante por Solvatação Aquosa Usando Calor e Pressão

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

Edição do genoma de CRISPR/Cas12a multiplex de Saccharomyces cerevisiae e a criação da arte do pixel do fermento

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...