Name: optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

Работа была поддержана (1) груди Рак проекта стипендию (2014-2016) финансируется Фонд рака молочной железы и живой 2013 через исследования, инновации и развитие доверия (RIDT) из Университета Мальты, (2) на факультете медицины & Хирургии, Университет Мальты и (3) проекта закона финансируется Мальтийский совет по науке и технологии через слияние: R & I 2016 программы развития технологии. Публикация этой рукописи поддерживается через Jove-Luminex Грант.

Этические утверждения для использования материала ткани молочной железы в этом исследовании было получено от университета Комитет этики научных исследований (UREC) из Университета Мальты (Ref: 22/2012).
1. Подготовка тканей
<ol><li>С помощью соответствующих процедур по H & E14, подготовить окрашенных справочных разделов ткани и сканировать слайды для справки во время microdissection.</li>
	<li>Используя микротом, стрижки 20 мкм тканей на свободной РНКазы водяной бане при 40 ° C. Соберите разделы на мембраны слайды для лазерной microdissection, используя чистый, RNase обеззараживания Оборудование и материалы.</li>
	<li>Сухие слайды мембраны при 37 ° C в сушки инкубатор на ночь. Пятно с помощью соответствующих H & E процедуры15 с молекулярной биологии класса решений и увеличивая окрашивания время гематоксилином до 6 мин. При необходимости, пятно мембраны слайды с соответствующим иммуногистохимических протоколы16.</li>
</ol>2. лазерный Microdissection
<ol><li>Установите пределы слайда и калибровки сценическое движение.<ol>
<li>Переместите лазерный вид на пустую область слайда мембраны. Калибровка лазерный фокус, выпустив лазер выстрелил на повышение фокус интервалы (5%), до тех пор, пока лазер начинает пробить через мембрану. Рисование и microdissect любой формы и finetune лазерный фокус максимизировать эффективность лазерной во время лазерной рассечение.</li>
		<li>Увеличить скорость движения этап до точки, где эффективность вскрытия лазер не нарушается. Калибровку лазера на выбранного объектива и повторной калибровки при изменении цели (лазерная скорость на 1 – 15%), фокус на 70 – 75% и власть на 90 – 100%, при использовании 4 X цель.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Сканировать слайды окрашенных мембраны, используя 4 X цель.</li>
	<li>Выберите и окружить целевых областей для microdissection на слайде мембраны. Лазерная вскрыть Минимальная площадь 42 мм2. Запись области расчлененный определить объем образца гомогенизации буфера для использования.</li>
	<li>Используйте механизм подъема крышки для извлечения расчлененных раздел на капсул диффузор помечены трубы, прилагается к соответствующим придаток. Если расчлененных секции не извлекается на крышку, повторите лазер рассечение района.</li>
</ol>3. ткань Lysis
Примечание: Несколько решений и материалы поставляются вместе с комплекты, упомянутых в Таблице материалов.
<ol><li>Подготовьте необходимый объем гомогенизации смеси для лизиса образца с помощью гомогенизации решение и протеиназы K в соотношении 60: 1.</li>
	<li>Пипетка 2.4 мкл гомогенизации решения в каждую пробирку для каждого 1 мм2 области ткани, вихревые для 10 s на максимальной скорости и центрифуги при комнатной температуре для 5 s на 2500 x g.</li>
	<li>Инкубируйте в блоке Отопление в 65 ° C для 12 – 18 ч встряхивании в 600 об/мин.</li>
	<li>Центрифуга лизатов на 21 000 x g 5 мин при комнатной температуре.</li>
	<li>С помощью пипетки, тщательно аспирационная ясно супернатант и обойтись в обозначенные свежие трубку. Избегайте аспирационных фрагментов ткани/мембраны, как это может снизить качество результатов.</li>
	<li>Храните в морозильной камере-80 ° C ясно супернатант.</li>
</ol>4. на основе гибридизации Assay
<ol><li>Выполните следующие препараты.<ol>
<li>Предварительно нагреть смесь лизис, поместив бутылку реагента в инкубаторе при 37 ° C за 30 мин и осторожно перемешать путем инверсии.</li>
		<li>Если ткани гомогенатах замораживаются, разморозить при комнатной температуре и при 37 ° C на 30 мин Vortex Проинкубируйте образцы на максимальной скорости, после инкубации.</li>
		<li>Установите пожимая инкубатор на 54 ° C и зонд в комплект проверки температуры в пустой колодец 96-луночных плиты. После 2 h проверить температуру на цифровой термометр и установите температуру Дельта пожимая инкубатор для исправления любой разницы температур.</li>
		<li>Оттепель и вихревой зонда набор и блокирование реагент для 10 s, центрифуги при комнатной температуре для 5 s на 2500 x g и держать на льду.</li>
		<li>Держите протеиназы K флакона на льду во время использования.</li>
		<li>Sonicate захвата бусы на 46 кГц на 3 мин, затем вихря на максимальной скорости для еще 3 мин.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Подготовить рабочие 25 мкл шарик смесь хорошо путем масштабирования до следующих реагентов соответственно: 4.25 мкл нуклеиназы свободной воды, 16.65 мкл лизис смеси, 1.00 мкл преграждать реагент, 0.10 мкл протеиназы K, 0,50 мкл захвата бусы, 2,50 мкл, комплекса зонд.</li>
	<li>Перемешать шарик рабочих для 10 s на максимальной скорости, затем Пипетка 25 мкл/колодец в пластину магнитной сепарации.</li>
	<li>Пипетка 25 мкл ткани огневки плиту 96-луночных магнитной сепарации и 25 мкл гомогенизации решение 3 скважины как пробелы.</li>
	<li>Уплотнение магнитной сепарации пластину, используя прозрачные пластиковые Напорное уплотнение и место пластину в инкубаторе 54 ± 1 ° C 18-22 ч при встряхивании в 600 об/мин.</li>
	<li>Подготовка 1 X мыть буферный раствор для 24 скважины путем смешивания 31.5 мл РНКазы свободной воды с 0,1 мл промывки буфер компонента 1 и 1,67 мл мыть буфер компонента 2.</li>
	<li>Снять пластину из инкубатора. Установите температуру пожимая инкубатора для 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Смонтировать пластину магнитной сепарации на ручных магнитные пластины шайбу и зафиксируйте на месте. Выньте Напорное уплотнение и подождите 1 мин для магнитной бусины урегулировать.</li>
	<li>Стиральная шаг: Инвертируйте магнитной сепарации пластине на пластину над раковиной и пятно мягко на папиросной бумаги для удаления остаточного решения. С помощью многоканальных дозаторов мкл 100 1 X мыть буферного раствора в каждой скважине и подождите 15 s. Повторите этот шаг для мыть пластину 3 раза.</li>
	<li>Пипетка 50 мкл Реагента предварительный усилитель для каждой скважины. Уплотнение пластину с алюминиевой пластины печать и поколебать пластину на 800 об/мин в течение 1 мин при комнатной температуре. Инкубируйте 1 час при 50 ± 1 ° C при встряхивании в 600 об/мин.</li>
	<li>Повторите шаг 4.9 (стиральная шаг).</li>
	<li>Пипетка 50 мкл Реагента усилитель для каждой скважины. Уплотнение пластину с алюминиевой пластины печать и встряхнуть пластину как шаг 4.10.</li>
	<li>Повторите шаг 4.9 (стиральная шаг).</li>
	<li>Вихревой лейбл зонд для 10 s на максимальной скорости. Добавьте 50 мкл метки датчика для каждой скважины. Печать и поколебать пластину (шаг 4.10).</li>
	<li>Повторите шаг 4.9 (мытье шаг).</li>
	<li>Вихревой стрептавидина фикоэритрин (SAPE) для 10 s на максимальной скорости. Добавьте 50 мкл SAPE каждой скважины. Печать и поколебать пластину (шаг 4.10).</li>
	<li>Повторите шаг 4.9 (стиральная шаг) за исключением использования буфера мытья SAPE вместо промывочный раствор буфера.</li>
	<li>Мкл 130 SAPE мыть буфера для каждой хорошо и уплотнение пластины с алюминиевой пластины печать. Встряхните пластину на 800 об/мин при комнатной температуре в течение 3 мин.</li>
	<li>Запуск Анализатор магнитный шарик. Выполните процедуру калибровки и проверки, следуя инструкциям производителя.</li>
	<li>Настройка протокола на Анализатор магнитный шарик, используя следующие параметры: размер выборки: 100 мкл; DD ворота: 5 000 – 25 000; Время ожидания: 90 s; Шарик события/шарик регион: 100; и нажмите кнопку Далее. Выберите номера соответствующих шарик в панели и определить регионы шарик с соответствующих целевых генов, как указано заводом-изготовителем.</li>
	<li>Добавьте новый анализ, выбрав «создать пакет с помощью существующего протокола» на вкладку пакеты . В тарелку макет назначить скважин неизвестных или пустой, соответственно и предоставляют метку для каждого образца в палитре « образцы ».</li>
	<li>Удалите алюминиевой пластины печать с 96-луночных реакции пластины. Извлечь лоток плиты, нажав на кнопку Eject , загрузить пластину в Анализатор магнитный шарик. Нажмите кнопку отозвать| Запуск пакетного инициировать анализатор. После прочтения, извлечь и удалить пластину 96-луночных. Чистота и выключить Анализатор магнитный шарик, как рекомендовано изготовителем.</li>
</ol>5. анализ данных
<ol><li>В партии| Вкладка результаты , выберите файл соответствующего анализа и нажмите кнопку Экспорт to.csv . Открыть the.csv файл с помощью программного обеспечения электронной таблицы.</li>
	<li>Соблюдать отсчеты шарик и исключить любые результаты с < 40 бусы/региона.</li>
	<li>Средние значения пустых скважин и стандартное отклонение (SD) и предел обнаружения (LOD) (бланк в среднем + (3xSD)) в целевых генов. Установите значения меньше, чем Лод как незамеченными. Примечание: Если какой-либо нормализации значения выражений незамеченными, связи образец данных как неадекватное. Рассмотрим выражение значения более 20000 как на чувствительность верхний предел. Лизатов этих образцов следует разбавлять и заново проанализированы.</li>
	<li>Вычтите пустой среднее из необработанных данных в ген.</li>
	<li>Вычислите геометрическое выбранного нормализующее генов на сэмпл. Нормализации отдельных образцов данных для соответствующих геометрическое.</li>
	<li>Анализ данных на данных платформах науки или использования определенных алгоритмов.<ol>
<li>Импортируйте данные в платформу данных науки, нажав кнопку Добавить данные. Перетащите файл данных в Рабочей области процесса и подключиться к оператору [Выберите атрибуты] , затем основной компонент анализа (PCA) оператор и затем к порту result.</li>
		<li>В Выберите атрибут оператор выберите подмножество данных нормализованных гена и номинальная переменная например подтип рака молочной железы. Запустите процесс, нажав кнопку играть. На вкладке диаграммы выберите «блуждающий 3D цвет» в стиль диаграммы и номинальный переменную в поле Цвет . Оценка изменчивости данных СПС на 3-мерного участка.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction:+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients.">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li><li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses.">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li><li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling.">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li><li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer:+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011.">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li><li>Schnitt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prognosis+of+invasive+breast+cancer:+from+morphology+to+molecular+taxonomy.">Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy.</a> Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).</li><li>Bae, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+in+carcinoma+cells+correlates+with+tumor+aggressiveness+and+poor+clinical+outcome+in+patients+with+invasive+breast+cancer.">Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).</li><li>Park, J., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+interactions+with+fibronectin+stimulate+epithelial-mesenchymal+transition.">Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition.</a> Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+breast+cancer+micrometastases+with+a+fibronectin-targeting+contrast+agent.">MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent.</a> Nat Commun. 6, 7984 (2015).</li><li>Antonyak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-derived+microvesicles+induce+transformation+by+transferring+tissue+transglutaminase+and+fibronectin+to+recipient+cells.">Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).</li><li>Moon, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+on+circulating+extracellular+vesicles+as+a+liquid+biopsy+to+detect+breast+cancer.">Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer.</a> Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).</li><li>Parker, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+risk+predictor+of+breast+cancer+based+on+intrinsic+subtypes.">Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.</a> J Clin Oncol. 27, (2009).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+the+PAM50-based+Prosigna+Breast+Cancer+Prognostic+Gene+Signature+Assay+and+nCounter+Analysis+System+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+tumor+specimens.">Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens.</a> BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections.">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li><li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).</li><li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Classification+of+Breast+Cancer+Patients+Using+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Derived+RNA+Samples.">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers &amp; Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li></ol>

Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay является собственностью термо Фишер научно.

На основе бисера мультиплекс bDNA пробирного был оптимизирован для количественного определения экспрессии генов на деградированных РНК, производные от FFPE ткани рака молочной железы и нормальной груди воздуховодов. Оптимизация assay, участвующих развивающихся алгоритм классификации опухолей молочной железы рак в Люминал и базальной подтипы, используя 8 биомаркеров известных и потенциальных 5 нормализующее генов. Нормализация данных было сделано с помощью перестановок нормализующее генов. Выбор нормализующее генов был основан на лучший прогноз рецептор статуса с помощью Люминал/базальной классификатор генов. Для классификации Люминал/базальной подтипы из FFPE тканей, нормализации гены выбран были бета актина (ACTB), Глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (GAPDH) и гипоксантин Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Метод может быть адаптирована для использования в других диагностических и областей исследования, после надлежащего отбора нормализующее набора генов. Один из важных применение этого метода в научно-исследовательском секторе является измерение биомаркеров в архивных материалов, которые хорошо аннотированных с клиническим исходам. Это может проверять потенциальных прогнозирования маркеров в ретроспективных исследований, быстро и точно и избежать долгосрочных перспективных исследований, ожидающих безрецидивной выживаемости и общей выживаемости данных. В настоящее время наша группа изучает использование проба для выявления рецептор положительным exosomes, который требует разработки нового алгоритма, используя альтернативный нормализующее генов для нормализации данных. Использование жидкого биопсии и надежные ген выражение анализов позволит высокой пропускной способности мультиплекс анализов, приспособленных для управления пациента во время лечения и предоставляют возможность следить за эффективностью лечения, возможных рецидивов из-за резистентности к терапии и метастатического потенциала опухоли.
Этот метод также имеет широкий спектр возможных применений в диагностике опухолей и адаптирована к текущей диагностики рабочего процесса. Основные преимущества этого метода в области диагностики включают в себя: (1) осуществление анализов высокой пропускной способности, (2) за исключением субъективности и двусмысленные результаты возникая от измерений на основе образов, (3) точное обнаружение нескольких целей одновременно, который повысить точность и свести к минимуму использование драгоценных пациентов образцов и (4) не требуется высоко специализированных учреждений и людских ресурсов. Процесс оптимизированной выборки, вместе с низкой ввода материала, необходимого для на базе шарик мультиплекс assay, позволяет дальнейшее расследование неоднородности опухоли; с помощью лазерной microdissection точно отделить несколько очагов злокачественных тканей из секции же пациента, его можно сравнить несколько экспрессии генов между ними, а также с соответствует нормальной ткани (рис. 4). Низкий материальный вклад имеет жизненно важное значение для диагностики приложения на биопсии опухоли, которые предоставляют ограниченные опухолевой ткани. Assay способность измерения экспрессии генов от деградированных РНК образцов позволяет легко транспортировки проб для анализа в учреждение или на обслуживание лабораторий. Кроме того целый раздел анализ был также возможно с использованием материала (рис. 1) запятнанных H & E.
Для успеха этого протокола, важно, чтобы: (1) обеспечить надлежащего отбора проб опухоли сайта/s, что лизированы для assay и (2) разработка хорошо оптимизированы и проверены алгоритмы нормализации данных, для каждой панели выражение гена и/или индивидуальных модельных или интеллектуального биомаркеров. Бывший зависит от технического опыта техник/ученого выполнения выборки. Рекомендуется принять дополнительные ядра и подготовить microarray ткани (TMA) в том же формате пробирного мультиплекс магнитный шарик (96-луночных формат). Это даст Архив опухоли сайты как копия образцов для анализа на базе РНК. TMAs может также оцениваться с другими методами для последующего исследования или проверки достоверности результатов. Разработка алгоритмов нормализации зависит от материала проводится расследование и нормализующее генов, отобранных для нормализации. Различные панели нормализации гены выбираются на основе уровня и изменчивости выражения в образце проанализированы и это колеблется от рака тканей из различных источников, exosomes плазмы, или циркулирующих клеток опухоли. Проверка анализа включает в себя пример обработки, поскольку различные препараты также приведет к нормализации различных алгоритмов.
Подводя итоги, использование bDNA технологии в сочетании с технологией магнитной бусины и выбор правильного группы генов-мишеней, обеспечит дополнительное преимущество измерения экспрессии генов непосредственно в ткани лизатов производным от небольших количеств пациента материала, включая материал, exosomes microdissected и циркулирующих клеток опухоли. Помимо обнаружения опухоли гетерогенности надлежащее использование панелей имеет потенциал для обнаружения опухоли производные exosomes для ранней диагностики и раннего выявления рецидивов. Так как нет необходимости для шага амплификации нуклеиновых кислот, усиления сигнала, используя bDNA технология, в сочетании с на основе бисера мультиплекс, меры несколько экспрессии генов в клинически Аннотированная архивных материалов и обеспечение ресурсов для Проверка биомаркеров.

Оптимизация РНК на основе анализов с использованием архивных формалин Исправлена парафин врезанных (FFPE) материал является сложной задачей вследствие изменчивости в ткани хирургической обработки и деградации РНК, вызванных формалин, используемый для сохранения целостности тканей в1, 2. Чтобы преодолеть ограничение проведения точных ген выражение исследования из архивных материалов, наша группа используется bDNA мультиплекс магнитный шарик assay. Вместо ферментационная амплификация Целевой шаблон bDNA технология использует гибридизации конкретных зондов и усиления сигнала репортер3. Последовательности коротких признание захвата и обнаружения датчиков предназначены для гибридизируйте короткие фрагменты целевой РНК4. Кроме того использование ткани гомогенатах как прямой исходного материала в этот assay, преодолевает неизбежные потери РНК, что результаты анализов, требующих предварительного РНК добычи и очистки. Усиления сигнала, использования коротких распознавания последовательностей и исключения шага очистки, способствуют сокращению технических разновидность assay. Технология обеспечивает возможность мультиплекс пробирного (до 80 целей РНК) и измерить выражение группы целей от низкого входного материала. Этот протокол описывает подготовку и окрашивания образцов ткани для лазерной microdissection. Окрашивание на слайдах мембраны облегчить изображений опухоли и гистологической архитектуры для обеспечения тщательного отбора и профилирование: (1 опухоли и нормальной воздуховодов в ткани молочной железы и (2) злокачественных клеток клоны в гетерогенных опухоли.
Молекулярной классификации рака молочной железы является процессом, который допрашивает молекулярных маркеров для классификации пациентов опухоли в три молекулярных классы, т.е., рецептор Люминал, человека эпидермального фактора роста 2 (HER2)-обогащенный и базальных подтип. HER2-обогащенный подтип четко определены, с высокая экспрессия рецептора HER2, из-за амплификации генов ERBB2, в сочетании с низкой или отсутствии эстрогеновый рецептор (Эр) и рецепторы прогестерона (ГРР). Люминал подтип положительными для ER и базальной подтипа в общем негативном для трех рецепторов (HER2, ER, ГРР) и значительно перекрывается с тройной отрицательный груди Рак (ТНРМЖ) диагностических подтипа5,6. Другие маркеры используются для определения характеристики эпителиальных и мезенхимы. Фибронектина (FN1) является основным компонентом отсеке мезенхимальных ткани груди. Увеличение FN1 выражение сопровождается высокой Ki67 окрашивание и показана сигнатура для более инвазивные опухоли7,8 и связан с метастазированием9. Интересно, что было обнаружено FN1 присутствовать в микровезикулы, возникая от опухолевых клеток, которые индуцированной активации митогенный сигналов в10получателей фибробластов. Следовательно циркулирующих микровезикулы, таких как exosomes маркер потенциал раннего обнаружения или метастазов и рецидивов11.
Выбор области опухоли для подтипов транскрипционный анализ рака груди периодически были произведены macrodissection12,13. Чтобы преодолеть гетерогенность ткани и увеличить чувствительность, мы объединили надежно окрашивания с мультиплексной молекулярная профилируя методы классической ткани. Как доказательство принципа были определены два отдельных груди Рак клоны их эпителиального мезенхимальных подписью и метастатическим потенциалом. Рабочий процесс описан протокола можно легко переводится в текущих клинических установки и используется выборочно изолировать и характеризуют подтипы ткани с помощью целенаправленных мРНК профилирования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatoxylin Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS16-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Aquaeous solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT110216-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Monosan</td>
			<td>MONX10963</td>
			<td>Working dilution: 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rabbit anti-mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0354</td>
			<td>Working dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER antibody (6F11)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>VPE614</td>
			<td>Working dilution: 1/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2 antibody (CB11)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>CB11-L-CE</td>
			<td>Working dilution: 1/325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody (MIB-1)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7240</td>
			<td>Working dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin Biotin Complex kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>4x, 10x, 20x and 40x objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection membranes</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>S0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi CellCamera 1.4</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>MX4285c-ACK07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Cellcut Plus</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffuser caps</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>50210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>52056A-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX200 100/200</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic bead analyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermaseal RTS Sealing Film</td>
			<td>Thermaseal</td>
			<td>765246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit</td>
			<td>Affymetrix/Panomics</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (50&#181;g/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Speed Vortex</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MSV-3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Silvercrest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASEZAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium 96-well plate seal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z721549-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Validation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td>
			<td>RapidMiner</td>
			<td></td>
			<td>Data Science Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation oven</td>
			<td>Hybaid (Thermo Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material

Нуклеиновые кислоты деградации в архивных тканей, опухоли неоднородность и отсутствие образцов свежий замороженные ткани может негативно сказаться на рак диагностические услуги в патологии лабораториях во всем мире. Амплификации генов и выражение диагностическое тестирование с использованием архивных материалов или материал, который требует транспорт для обслуживания лабораториями, нуждается в более надежной и точной тест, адаптированных к текущих клинических процессов. Наша исследовательская группа оптимизированного использования Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (термо Фишер научных) для количественного определения РНК в архивных материалов, с использованием технологии разветвленной ДНК (bDNA) на Luminex xMAP® магнитные бусы. Пробирного выражение гена, описанные в этой рукописи — роман, быстрый и мультиплексной метод, который может точно классифицировать рака молочной железы в различных молекулярных подтипы, опуская субъективности интерпретации присущей методы визуализации. Кроме того из-за низкой ввода необходимых материалов, гетерогенных опухоли могут быть лазерной microdissected с помощью гематоксилином и эозином (H & E) окрашенных секций. Этот метод имеет широкий спектр возможных применений, включая классификации опухоли с диагностический потенциал и измерение биомаркеров в жидком биопсий, которые позволили бы лучше пациента управления и мониторинга заболеваний. Кроме того количественные измерения биомаркеров в архивных материалов является полезным в онкологии исследований с доступ к библиотекам клинически Аннотированная материала, в котором можно проверить ретроспективные исследования потенциальных биомаркеров и их клинических исходов корреляции.

Описан метод был применен для одновременного измерения 40 стенограммы в H & E, витражи (рис. 1), microdissected (рис. 2) сильно деградировавших FFPE материала. С помощью этого метода, мы покажем Точная характеристика рецептор статуса (Рисунок 3А), Классификация опухолей в Люминал и базальной молекулярной подтипы17и дифференцированного выражение мезенхимальных маркера, FN1, при сравнении опухоли и соответствующий контроль ткани (рис. 3B), в различные положительные и отрицательные подтипы рецепторов.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Рисунок 1: экспрессии генов с помощью H & E окрашенных материалов. Корреляция между выражение профиль, производный от секции неокрашенных опухоли по сравнению с окрашенных опухоли секции. [Корреляции Пирсона p-значение = 5.34E-26]. Воспроизводится с разрешения17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Рисунок 2: Лазерная microdissection тканей FFPE. (.A) H & E окрашенных слайд; (B) иммуногистохимическое окрашивание для ER выражения; (C) HER2 иммуногистохимическое окрашивание; (D) неокрашенных раздел 20 мкм лазер microdissection мембраны слайды. Желтая стрелка указывает области инвазивной опухоли, которые не разграничены четко из-за отсутствия окрашивания. (E) A раздела 20 мкм окрашивали H & E для лучшего разграничение областей, представляющих интерес. Белые стрелки указывают лазерного рассечение тропа в то время как красная стрелка показывает лазерный фокус во время вскрытия. Все иллюстрации были захвачены при 10-кратном. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Рисунок 3: выражение (A) рецептор статус и маркер FN1, (B) мезенхимальные опухоли груди, по сравнению с соответствует нормальной. Классическая груди диагностики рака подтипы определяются согласно диагностических результатов с использованием иммуногистохимии и флуоресценции в situ гибридизация (рыбы) для HER2 двусмысленные иммуногистохимическое окрашивание. Нормализованное выражение (A) HER2 и ER, (B) FN1 измеряется на основе гибридизации assay иллюстрируется в HER2 позитивные, ER позитивные и ТНРМЖ случаев по сравнению с пациента соответствует нормальной груди ткани. Крускала Уоллис тестовой статистики (K-W χ2) показывает, что выражение HER2 значительно (p < 0,05) выше в опухолевой ткани противоположность соответствует нормальной ткани в когорте позитивные HER2 и значительно ниже в когорте ТНРМЖ. ER выражение не было найдено значительно выше в опухолевой ткани, а не соответствует нормальной в ER положительные и ТНРМЖ когорты. FN1 значительно выше в опухолевой ткани в HER2 и ER позитивные подтипы и показывает тенденцию к будучи значительно повышен в опухолевой ткани также в когорте ТНРМЖ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Рисунок 4: тематическое исследование: опухоль гетерогенность. Морфологически различные опухоли были microdissected и рассматриваются как отдельных образцов. (A) Мастер сканирования H & E секции. (B, C) 10 x и 40 кратном, соответственно для каждого морфологию опухоли определены. (D) иммуногистохимическое окрашивание для ER при 10-кратном. (E) иммуногистохимическое окрашивание для Ki67 при 10-кратном показаны выше митотическая активность в опухоли 1. (F) нормированный уровни выражения гена ESR1 в каждом опухоли, показаны относительно высокой и равных выражение между опухоли, как ожидается от результата иммуногистохимических. (G) нормированный уровни выражения FN1, мезенхимальные маркером, где увеличение FN1 выражение сопровождается высокой Ki67 пятнать показаны подпись для более инвазивные опухоли. В опухоль 2, которая выглядит как медленнее пролиферирующих опухолевых с нижней злокачественным потенциалом снижения FN1 выражения наблюдается обратное. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Нуклеиновые кислоты деградации в архивных тканей, опухоли неоднородность и отсутствие образцов свежий замороженные ткани может негативно сказаться на рак диагностические услуги в патологии лабораториях во всем мире. Эта рукопись описывает оптимизации группы биомаркеров, используя пробирного мультиплекс магнитный шарик для классификации рака груди.

Оптимизация мультиплекс на базе РНК выражение Assay, с использованием архивных материалов рака молочной железы

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Высокая профилирования микроРНК Производительность: Оптимизированная Мультиплекс QRT-PCR на шкале Nanoliter на Fluidigm Динамический МФХБ ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Высокая пропускная способность экспрессии белков генератора с использованием платформы Микрофлюидных

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Протокол биопленки Streamer формирования в микрожидкостных устройств с Micro-столбов

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Изготовление биоактивными, PCL основе &quot;Self-установки&quot; памятью формы полимеров Scaffold

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Общий протокол для оптимизации производства гетерологичных белка с использованием автоматизированной технологии Microbioreactor

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Быстрое на основе образа бактериальных вирулентности Assay, используя амебы

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

Новая модель Ex Vivo для оценки работы эндоскопической подслизистую инъекционного материала

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Материальное формирование рекомбинантного паука шелка через водный солнцестояния использованием тепла и давления

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Геном Редактирование Saccharomyces cerevisiae и создание дрожжевого искусства пикселей

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...