Name: optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00
Duration: 11 min 12 s
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El trabajo fue apoyado por (1) una beca de proyecto de la cáncer de mama (2014-2016) financiado por la acción de la Fundación de cáncer de mama y vivo 2013 a través de la investigación, innovación y desarrollo de confianza (RIDT) de la Universidad de Malta, (2) la Facultad de medicina Y cirugía, Universidad de Malta y (3) proyecto financiada por el Consejo de Malta para ciencia y tecnología a través de la fusión de la ley: la i+d tecnología desarrollo programa de 2016. La publicación de este manuscrito se apoya a través de la subvención de Jove-Luminex.

Aprobación ética para el uso de material de tejido de mama en este estudio se obtuvo de la Universidad investigación ética Comité (UREC) de la Universidad de Malta (Ref: 22/2012).
1. preparación de tejido
<ol><li>Mediante adecuados procedimientos H & E14, preparar referencia teñido de tejido y digitalmente, escanear diapositivas de referencia durante la microdisección.</li>
	<li>Con un micrótomo, corte secciones de tejidos de 20 μm en un baño de agua libre de ARNasa a 40 ° C. Recoger las secciones en las diapositivas de la membrana para Microdisección láser utilizando materiales y equipo limpio y descontaminado de Rnasa.</li>
	<li>Secar los portaobjetos de la membrana a 37 ° C en un incubador de secado durante la noche. La mancha utilizando el apropiado H & E procedimiento15 con soluciones de grado de biología molecular y aumentar el tiempo de tinción de hematoxilina a 6 min. Si es necesario, mancha las diapositivas de la membrana con el apropiado immunohistochemical protocolos16.</li>
</ol>2. Microdisección láser
<ol><li>Establecer los límites de la diapositiva y calibrar el movimiento de la etapa.<ol>
<li>Mover el punto de vista de láser en un área vacía de la diapositiva de la membrana. Calibrar el enfoque de láser disparando un láser dispararon aumentando intervalos de enfoque (5%) hasta que el láser comienza a perforar a través de la membrana. Drenaje y microdissect cualquier forma y afinar el foco del láser para maximizar la eficiencia del láser durante la disección del láser.</li>
		<li>Aumentar la velocidad de movimiento del escenario a un punto donde no se comprometa la eficacia de la disección de láser. Calibrar el laser en la lente del objetivo seleccionado y recalibrar si cambiar objetivos (láser velocidad de 1 – 15%), foco en el 70 – 75% y poder al 90-100% cuando se utiliza el objetivo de 4 X.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analizar los portaobjetos de tinción de membrana usando el objetivo 4 de X.</li>
	<li>Seleccionar y delimitar las zonas de microdissection de la diapositiva de la membrana. Láser diseccionar un área mínima de 42 mm2. Registro la zona disecada para determinar el volumen homogeneizante del tampón de muestra a utilizar.</li>
	<li>Utilizar el mecanismo de elevación de tapa para recuperar la sección disecada en las tapas de difusor de tubos etiquetados atado Apéndice correspondiente. Si no se recupera la sección disecada en la tapa, repita la disección del laser de la zona.</li>
</ol>3. tejido lisis
Nota: Varias soluciones y los materiales se suministran junto con kits de mencionado en la Tabla de materiales.
<ol><li>Prepare el volumen requerido de mezcla homogeneización para la lisis de la muestra mediante homogeneización solución y proteinasa K a una proporción de 60: 1.</li>
	<li>Pipetee 2.4 μL de homogeneizar la solución en cada tubo por cada 1 mm2 de área de tejido, vortex durante 10 s a velocidad máxima y centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g.</li>
	<li>Incubar en un bloque de calentamiento a 65 ° C por 12 a 18 h con agitación a 600 rpm.</li>
	<li>Centrifugue los lisados a 21.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Usando una pipeta, cuidadosamente aspirar el sobrenadante y dispensar en un tubo etiquetado fresco. Evite aspirar los fragmentos de tejido de la membrana, esto puede reducir la calidad de los resultados.</li>
	<li>Guarde el sobrenadante en un congelador de-80 ° C.</li>
</ol>4. hibridación basada en análisis
<ol><li>Realice los siguientes preparativos.<ol>
<li>Caliente previamente la mezcla de lisis el frasco del reactivo en una incubadora a 37 ° C por 30 min y mezclar suavemente por inversión.</li>
		<li>Si los homogenados de tejido se congela, descongelar a temperatura ambiente e incubar a 37 ° C por 30 min vórtex las muestras a la velocidad máxima después de la incubación.</li>
		<li>La incubadora de agitación en 54 ° C y colocar la sonda del kit de validación de la temperatura en un pozo vacío de una placa de 96 pocillos. Después de 2 h Verifique la temperatura en el termómetro digital y ajuste la temperatura del delta de sacudir la incubadora para corregir cualquier diferencia de temperatura.</li>
		<li>Deshielo y agitar la punta de prueba sistema y bloqueo reactivo para 10 s, centrifugar a temperatura ambiente durante 5 s a 2.500 x g y mantener en hielo.</li>
		<li>Mantenga el frasco de proteinasa K en el hielo durante el uso.</li>
		<li>Someter a ultrasonidos los granos captura a 46 KHz durante 3 min., luego vortex a máxima velocidad por otros 3 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar una mezcla de grano de trabajo 25 μl por pocillo por ampliar en consecuencia los siguientes reactivos: 4.25 μl de agua libre de nucleasa, 16.65 μl de mezcla de lisis, 1.00 μl del bloqueo reactivo, 0.10 μl de proteinasa K, 0,50 μl de granos de la captura, 2.50 μl de sonda conjunto.</li>
	<li>Vórtice la mezcla de grano de trabajo durante 10 s a velocidad máxima, luego Pipetear 25 μL/pocillo a la placa de separación magnética.</li>
	<li>Pipetee 25 μl tejido homogeneizado a una placa de 96 pocillos de separación magnética y 25 μl solución para 3 pozos como los espacios en blanco de homogeneización.</li>
	<li>Sellar la placa de separación magnética con un sello de presión de plástico transparente y colocar la placa en la incubadora a 54 ± 1 ° C por 18 – 22 h agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Preparar una solución 1 X wash buffer 24 pozos por 31,5 mL de libre de Rnasa de mezcla agua con 0,1 mL de lavado Tampón mL del componente 1 y 1,67 de componente de tampón de lavado 2.</li>
	<li>Retire la placa de la incubadora. Ajustar la temperatura de la incubadora agitación 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Montar la placa de separación magnética en la lavadora de la mano placa magnética y trábela en su lugar. Retire el sello de presión y espere 1 minuto para las bolas magnéticas resolver.</li>
	<li>Paso de lavado: Invierta la placa de separación magnética montada en el plato sobre el fregadero y la mancha blanca /negra suavemente sobre un papel para quitar la solución residual. Utilizando una pipeta multicanal añadir 100 μl de solución tampón de lavado 1 X en cada pozo y espera 15 s. Repita este paso para lavar la placa 3 veces.</li>
	<li>Pipetee 50 μl de reactivo previo a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa a 800 rpm durante 1 min a temperatura ambiente. Incubar durante 1 h a 50 ± 1 ° C agitando a 600 rpm.</li>
	<li>Repita el paso 4.9 (paso de lavado).</li>
	<li>Pipetee 50 μl del reactivo del amplificador a cada pocillo. Selle la placa con un sello de placa de aluminio y agitar la placa como en el paso 4.10.</li>
	<li>Repita el paso 4.9 (paso de lavado).</li>
	<li>Vórtice de la sonda de la etiqueta de 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de la sonda de etiqueta a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10).</li>
	<li>Repita el paso 4.9 (paso de lavado).</li>
	<li>Vórtice ficoeritrina estreptavidina (SAPE) durante 10 s a velocidad máxima. Añadir 50 μl de SAPE a cada pocillo. Tapar y agitar la placa (paso 4.10).</li>
	<li>Repita paso 4.9 (paso de lavado) excepto usar el tampón de lavado SAPE en lugar del tampón de lavado.</li>
	<li>Añadir 130 μl de tampón de lavado SAPE a cada plato así y sellado con un sello de placa de aluminio. Agitar la placa a 800 rpm a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
	<li>Puesta en marcha el analizador de grano magnético. Realizar la calibración y verificación, siguiendo las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Establecer un protocolo en el analizador de grano magnético usando los siguientes parámetros: tamaño de la muestra: 100 μl; Puerta DD: 5.000 – 25.000; Tiempo de espera: 90 s; Región de evento/grano grano: 100; y haga clic en siguiente. Seleccione los números de cuentas respectivas en el panel y definir las regiones de grano con los genes respectivos destino indicado por el fabricante.</li>
	<li>Agregar un nuevo análisis seleccionando "crear lote utilizando un protocolo existente" desde la ficha de lotes . En el diseño de la placa designar los pozos como desconocido o en blanco, respectivamente y proporcionar una etiqueta para cada muestra en el Panel muestras .</li>
	<li>Retire el sello de placa de aluminio de la placa de 96 pocillos de reacción. Abrir la bandeja de la placa haciendo clic en el botón de expulsión , la placa de carga en el analizador de grano magnético. Haga clic en retractarse| Ejecutar por lotes para iniciar el analizador. Después de leer, expulse y retire la placa de 96 pocillos. Limpiar y cerrar el analizador de grano magnético según lo recomendado por el fabricante.</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>En el lote| Ficha de resultados , seleccione el archivo de los análisis respectivos y haga clic en el botón exportar to.csv . The.csv abrir archivo usando un software de hoja de cálculo.</li>
	<li>Observar las cuentas de perla y omitir ningún resultado, < 40 granos/región.</li>
	<li>Promedio de los valores de los pocillos del blanco y calcular la desviación estándar (SD) y límite de detección (LOD) (espacio en blanco media + (3xSD)) por el gene de la blanco. Establecer los valores más bajo que el LOD como desapercibido. Nota: Si cualquiera de los valores de expresión normalización son detectado, mirar los datos de la muestra como inadecuada. Considerar valores de expresión más 20.000 como sobre el límite de sensibilidad superior. Los lisados de estas muestras deben diluirse y volver a analizar.</li>
	<li>Reste el promedio en blanco de los datos crudos por gene.</li>
	<li>Calcular la media geométrica de los genes de normalización seleccionados por muestra. Normalizar datos individuales de la muestra para la media geométrica respectiva.</li>
	<li>Análisis de datos en plataformas de ciencia de datos o utilizando algoritmos definidos.<ol>
<li>Importar los datos en la plataforma de la ciencia de datos haciendo clic en Agregar datos. Arrastre el archivo de datos en el Proceso de trabajo y conectar a un operador [Seleccionar atributos] , luego a un principales análisis de componentes (ACP) operador y luego al puerto de t resul.</li>
		<li>En el Atributo seleccionar operador seleccionar el subconjunto de datos de genética normalizada y una variable nominal como subtipo de cáncer de mama. Ejecutar el proceso haciendo clic en jugar. En la ficha gráficos seleccione la "dispersión de Color 3D" en el estilo de tabla y la variable nominal en el campo de Color . Evaluar la variabilidad de los datos PCA en una parcela de 3 dimensiones.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction:+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients.">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li><li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses.">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li><li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling.">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li><li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer:+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011.">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li><li>Schnitt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prognosis+of+invasive+breast+cancer:+from+morphology+to+molecular+taxonomy.">Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy.</a> Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).</li><li>Bae, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+in+carcinoma+cells+correlates+with+tumor+aggressiveness+and+poor+clinical+outcome+in+patients+with+invasive+breast+cancer.">Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).</li><li>Park, J., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+interactions+with+fibronectin+stimulate+epithelial-mesenchymal+transition.">Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition.</a> Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+breast+cancer+micrometastases+with+a+fibronectin-targeting+contrast+agent.">MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent.</a> Nat Commun. 6, 7984 (2015).</li><li>Antonyak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-derived+microvesicles+induce+transformation+by+transferring+tissue+transglutaminase+and+fibronectin+to+recipient+cells.">Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).</li><li>Moon, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+on+circulating+extracellular+vesicles+as+a+liquid+biopsy+to+detect+breast+cancer.">Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer.</a> Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).</li><li>Parker, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+risk+predictor+of+breast+cancer+based+on+intrinsic+subtypes.">Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.</a> J Clin Oncol. 27, (2009).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+the+PAM50-based+Prosigna+Breast+Cancer+Prognostic+Gene+Signature+Assay+and+nCounter+Analysis+System+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+tumor+specimens.">Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens.</a> BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections.">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li><li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).</li><li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Classification+of+Breast+Cancer+Patients+Using+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Derived+RNA+Samples.">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers &amp; Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li></ol>

El Invitrogen™ QuantiGene™ Plex es propiedad de Thermo Fisher Scientific.

Un análisis bDNA multiplex basados en grano fue optimizado para cuantificar la expresión génica en RNA degradado derivado de tejido de cáncer de mama FFPE y conductos de la mama normal. Optimizar el análisis, involucrados desarrollar un algoritmo para clasificar tumores de cáncer de mama en los subtipos luminales y basals utilizando 8 biomarcadores conocidos y potenciales 5 normalización de genes. Normalización de datos se realizó mediante permutaciones de los genes de normalización. La selección de los genes de normalización se basó en la mejor predicción del estado del receptor usando los genes de clasificador de Luminal Basal. Para clasificar los subtipos Luminal Basal de los tejidos FFPE, los genes de normalización seleccionados fueron Beta-actina (ACTB), gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) e hipoxantina fosforribosiltransferasa 1 (HPRT1).
El método puede adaptarse para el uso en otro diagnóstico y líneas de investigación tras la selección adecuada del conjunto de gene normalización. Una aplicación importante de este método en el sector de investigación es la medición de biomarcadores en material de archivo que está anotado bien con los resultados clínicos. Podría validar posibles marcadores predictivos en estudios retrospectivos, con rapidez y precisión y evitar estudios prospectivos a largo plazo en espera de datos de supervivencia global y supervivencia libre de enfermedad. Actualmente nuestro grupo está investigando el uso de la prueba para detectar receptores positivos exosomas, que requiere el desarrollo de un nuevo algoritmo que usa alternativo normalización de genes de normalización de datos. El uso de biopsias líquidas y ensayos de expresión genética sólida permitirá ensayos multiplex de alto rendimiento adaptados para el manejo de los pacientes durante el tratamiento y proporcionar un medio para seguir la eficacia del tratamiento, posibles recaídas debido a la resistencia a la terapia y la capacidad metastásica del tumor.
Este método también tiene una amplia gama de posibles aplicaciones en el diagnóstico de tumores y se adapta al actual flujo de trabajo diagnóstico. Las principales ventajas de este método en el área de diagnóstico incluyen: (1) la aplicación de ensayos de alto rendimiento, (2) excluyendo la subjetividad y resultados dudosos procedentes de medidas basadas en la imagen, (3) detección precisa de objetivos múltiples al mismo tiempo que mejorar la precisión y no minimizar el uso de preciosas muestras de pacientes y (4) requiere de instalaciones altamente especializadas y recursos humanos. El proceso de muestreo optimizada, junto con la entrada de material requerido para el ensayo multiplex basados en grano, permite más investigación de la heterogeneidad del tumor; mediante Microdisección láser para separar con precisión los focos múltiples de tejido maligno de la misma sección del paciente, es posible comparar varios genes entre ellos, así como con el tejido normal combinado (figura 4). Entrada material es vital para la aplicación de diagnóstico en las biopsias del tumor que proporcionan tejido tumoral limitada. La capacidad del ensayo para medir la expresión génica de muestras de RNA degradadas permite fácil transporte de las muestras para el análisis dentro de una institución o al servicio de los laboratorios. Además, análisis de la sección entera era también posible con H & E tinción de material (figura 1).
Para el éxito de este protocolo, es imprescindible: (1) asegurar el correcto muestreo del tumor sitio/s que son lisis para el análisis y (2) desarrollar bien optimizado y validado algoritmos de normalización de datos, para cada panel de expresión génica o el pronóstico individual o biomarcadores predictivos. El primero depende de la experiencia técnica del técnico/científico realizar el muestreo. Se recomienda tomar un núcleo adicional y preparar un microarray de tejido (TMA) en el mismo formato del ensayo multiplex grano magnético (formato de 96 pocillos). Esto proporcionará un archivo de sitios de tumor como una réplica de las muestras utilizadas para el análisis de RNA. TMAs también pueden ser evaluadas con otras técnicas de seguimiento investigación o validación de los resultados. El desarrollo de algoritmos de normalización es dependiente en el material investigado y los genes de normalización seleccionados para la normalización. Diferentes paneles de normalización de genes se seleccionan según el nivel y variabilidad de expresión en la muestra analizada y esto varía entre los tejidos de cáncer de distintos orígenes, exosomas de plasma o células tumorales circulantes. Validación del ensayo incluye muestra de procesamiento puesto que diversas preparaciones también resultará en algoritmos de normalización diferentes.
En Resumen, el uso de la tecnología bDNA en combinación con la tecnología magnética de grano y la selección del adecuado panel de genes diana, le proporcionará la ventaja de medir la expresión génica directamente en lisados de tejidos derivados de pequeñas cantidades de material de paciente, incluyendo microdissected exosomas material y circulación de las células del tumor. Además de la detección de heterogeneidad del tumor, el uso adecuado de los paneles tiene el potencial para detectar tumor derivado de exosomas para el diagnóstico temprano y detección precoz de recidivas. Puesto que no hay necesidad para un paso de amplificación de ácidos nucleicos, la amplificación de la señal usando la tecnología bDNA, combinada con el complejo basado en el grano, medidas de múltiples genes en el material de archivo clínico anotado y proporcionar un recurso para validación de biomarcadores.

Optimización de ensayos basado en RNA usando archivo formalina-fijo material parafina-encajado (FFPE) es difícil debido a la variabilidad en el tratamiento quirúrgico del tejido y la degradación del ARN causada por formol usado para tejido integridad preservación1, 2. Para superar la limitación de la realización de estudios de expresión génica precisa de material de archivo, nuestro grupo utiliza el ensayo de grano magnético multiplex de bDNA. En lugar de amplificación enzimática de una plantilla de destino, la tecnología bDNA utiliza hibridación de sondas específicas y la amplificación de un reportero señal3. Las secuencias de reconocimiento corto de las sondas de detección y captura están diseñadas para hibridar a fragmentos cortos de RNA del objetivo4. Además, el uso de homogenados de tejido como material de partida directo en este ensayo, supera la inevitable pérdida de ARN, que resulta del análisis que requiere purificación y previa extracción de RNA. Amplificación de la señal, el uso de secuencias cortas de reconocimiento y la exclusión de un paso de purificación, contribuyen a reducir variación técnica del ensayo. La tecnología ofrece la posibilidad de multiplexar el ensayo (hasta 80 blancos de RNA) y medir la expresión de un grupo de objetivos de baja material de entrada. Este protocolo describe la preparación y tinción de muestras de tejido para Microdisección láser. La coloración de las diapositivas de membrana facilitar la proyección de imagen del tumor y la arquitectura histológica para proporcionar selección exacta y perfiles de: (1) el tumor y los conductos normales en el tejido mamario y (2) clones de la célula maligna en tumores heterogéneos.
Clasificación molecular del cáncer de mama es un proceso que interroga marcadores moleculares para categorizar tumores de pacientes en tres clases moleculares, es decir, receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico luminal, humano (HER2)-subtipo enriquecido y basal. El subtipo HER2-enriquecido está bien definido, con alta expresión de HER2 receptor, debido a la amplificación del gen ERBB2, combinada con baja o ausencia de receptores de estrógeno (ER) y receptor de progesterona (PgR). El subtipo luminal es generalmente positivo para ER y el subtipo basal es en general negativo para los tres receptores (HER2, ER, PgR) y significativamente se traslapa con la mama triple negativos subtipo diagnóstico cáncer (TNBC)5,6. Otros marcadores se utilizan para determinar las características epiteliales y mesenquimales. Fibronectina (FN1) es un componente principal del compartimiento mesenquimal del tejido de mama. Mayor expresión de FN1 se acompaña de Ki67 alta coloración y muestra una firma para un tumor más invasivo7,8 y se asocia con metástasis9. Interesante, FN1 fue encontrada para estar presente en microvesículas que se origina en las células del tumor, que induce la activación de la señal mitogénica en fibroblastos receptores10. Por lo tanto, circulan microvesículas como exosomas son un marcador potencial de la detección temprana o de la metástasis y recaen11.
Selección de áreas de tumor para subclasificación transcripcional del cáncer de mama recurrente ha sido realizada por macrodissection12,13. Para superar la heterogeneidad del tejido y aumentar la sensibilidad, fiabilidad hemos combinado clásico tejido de coloración con los métodos de generación de perfiles moleculares multiplexores. Como una prueba del principio, dos clones de cáncer de mama diferentes se han definido por su firma mesenquimal epitelial y potencial metastático. El flujo de trabajo del protocolo descrito puede ser fácilmente traducido a la actual configuración clínica y utilizar selectivamente aislar y caracterizar los subtipos de tejido usando perfiles de mRNA específicos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatoxylin Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS16-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Aquaeous solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT110216-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Monosan</td>
			<td>MONX10963</td>
			<td>Working dilution: 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rabbit anti-mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0354</td>
			<td>Working dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER antibody (6F11)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>VPE614</td>
			<td>Working dilution: 1/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2 antibody (CB11)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>CB11-L-CE</td>
			<td>Working dilution: 1/325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody (MIB-1)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7240</td>
			<td>Working dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin Biotin Complex kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>4x, 10x, 20x and 40x objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection membranes</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>S0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi CellCamera 1.4</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>MX4285c-ACK07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Cellcut Plus</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffuser caps</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>50210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>52056A-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX200 100/200</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic bead analyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermaseal RTS Sealing Film</td>
			<td>Thermaseal</td>
			<td>765246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit</td>
			<td>Affymetrix/Panomics</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (50&#181;g/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Speed Vortex</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MSV-3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Silvercrest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASEZAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium 96-well plate seal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z721549-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Validation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td>
			<td>RapidMiner</td>
			<td></td>
			<td>Data Science Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation oven</td>
			<td>Hybaid (Thermo Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Amplificación del gene y la expresión diagnóstico pruebas utilizando material de archivo o material que requiere transporte al servicio de laboratorios, necesita una prueba más robusta y precisa, adaptada a flujos de trabajo clínicos actuales. Nuestro equipo de investigación ha optimizado el uso del ensayo de Plex de Invitrogen™ QuantiGene™ (Thermo Fisher Scientific) cuantificar RNA en material de archivo utilizando la tecnología de ADN ramificado (bDNA) en granos magnéticos de Luminex xMAP® . El análisis de expresión génica se describe en este manuscrito es un método rápido y múltiplex de novela, que puede clasificar con precisión el cáncer de mama en los diferentes subtipos moleculares, omitiendo la subjetividad de la interpretación de técnicas de imagen. Además, debido a la entrada de material requerido, tumores heterogéneos pueden ser microdissected de láser con hematoxilina y eosina (H & E) secciones manchadas. Este método tiene una amplia gama de aplicaciones incluyendo clasificación tumor con potencial diagnóstico y medición de biomarcadores en líquido biopsias, que permitirían mejor gestión paciente y control de la enfermedad. Además, la cuantificación de biomarcadores en material de archivo es útil en investigación oncológica con acceso a las bibliotecas de material clínico anotado, en el que los estudios retrospectivos pueden validar biomarcadores potenciales y su evolución clínica correlación.

El método descrito ha sido aplicado para la medición simultánea de 40 transcripciones en H & E tinción (figura 1), microdissected (figura 2) altamente degradado material FFPE. Usando este método, se muestra la caracterización precisa del estado del receptor (Figura 3A), clasificación de tumores en subtipos moleculares luminal y basal17y expresión diferencial del marcador mesenquimal, FN1, al comparar el tumor y tejido de control emparejado (figura 3B), en los diversos subtipos del receptor de positivos y negativos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Figura 1: expresión génica usando H & E tinción material. Correlación entre un perfil de la expresión derivado de una sección del tumor sin mancha en comparación con una sección de tumor manchadas. [Pearson correlación p-valor = 5.34E-26]. Reproducido con permiso de17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Figura 2: láser microdisección de tejidos FFPE. (A) H & E tinción de diapositiva; (B) coloración Immunohistochemical para la expresión de ER; (C) la coloración de immunohistochemical HER2; (D) sección de 20 μm sin manchas en las diapositivas de membrana de Microdisección láser. La flecha amarilla indica una zona de tumor invasivo que no está demarcada claramente debido a la falta de coloración. (E) A 20 μm sección teñida con H & E para la mejor delineación de áreas de interés. Flechas blancas indican camino de disección laser mientras que la flecha roja muestra el enfoque de láser durante la disección. Todas las ilustraciones fueron capturadas con 10 aumentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Figura 3: expresión de estatus (A) del receptor y (B) mesenquimal marcador FN1, en tumor de mama en comparación con emparejado normal. Los subtipos de cáncer de mama diagnóstico clásicos se definen según el resultado de diagnóstico usando immunohistochemistry y fluorescencia en situ del hibridación (pescado) para la coloración de immunohistochemical equívoca de HER2. Se ilustra la expresión normalizada de (A) HER2 y ER, FN1 (B) medido por el ensayo de hibridación en HER2 positivo, ER positivo y casos TNBC en comparación con el paciente emparejado tejido mamario normal. La estadística de prueba de Kruskal Wallis (K-W χ2) muestra que la expresión de HER2 es significativamente (p < 0.05) más alta en el tejido del tumor en comparación con los tejidos normales igualados en la cohorte de HER2 positivo y significativamente menor en la cohorte TNBC. No se encontró expresión de ER a ser significativamente mayor en el tejido del tumor en comparación con el normal emparejado en el ER positivo y cohortes TNBC. FN1 es significativamente mayor en el tejido del tumor en los subtipos HER2 y ER positivo y muestra una tendencia a ser elevados perceptiblemente en el tejido del tumor también en la cohorte TNBC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Figura 4: estudio de caso: heterogeneidad tumoral. Tumores morfológicamente distintos fueron microdissected y trataron como muestras distintas. (A) el maestro de exploración de la sección de H & E. (B, C) Un 10 x y 40 x aumentos, respectivamente para cada morfología del tumor identificado. (D) coloración Immunohistochemical para ER con 10 aumentos. (E) coloración Immunohistochemical para Ki67 en 10 aumentos que muestran una actividad mitótica mayor en tumor 1. (F) normalizó los niveles de expresión del gen ESR1 en cada tumor que muestra expresión relativamente alta e igual entre los tumores como se espera de los resultados de immunohistochemical. (G) normalizó los niveles de expresión de FN1, un marcador mesenquimal, donde mayor expresión FN1 es acompañada de Ki67 alta coloración que muestran una firma para un tumor más invasivo. El inverso se observa en tumor 2, que parece ser un tumor de lenta proliferación con un potencial maligno menor representado por la expresión reducida de FN1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Degradación de ácidos nucleicos en el tejido archival, la heterogeneidad del tumor y la falta de muestras de tejido fresco congelado puede afectar servicios de diagnóstico de cáncer en laboratorios de patología en todo el mundo. Este manuscrito describe la optimización de un panel de biomarcadores utilizando un ensayo multiplex grano magnético para clasificar los cánceres de mama.

Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Perfiles de microARN de alto rendimiento: Multiplex Optimizado QRT-PCR en la escala de nanolitros de la IFC Fluidigm dinámica ArrayTM

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

Investigación

Bioingeniería

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

La fabricación de una memoria de forma &quot;Auto-ajuste&quot; basado en PCL Bioactivos, Polymer Andamios

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Protocolo genérico para la optimización de la producción de proteína heteróloga utilizando tecnología Microbioreactor automatizada

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Un análisis de la virulencia bacteriana rápida basada en imágenes usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

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Un nuevo modelo Ex Vivo para la evaluación de la ejecución Material de la inyección Submucosal endoscópica

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

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Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Formación material de la araña recombinante sedas a través de la Solvación acuosa utilizando calor y presión

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genoma Edición de Saccharomyces cerevisiae y la creación de Arte de píxeles de levadura

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...