Name: optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material
Uploaded: 2018-08-01T12:30:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

Arbetet stöddes av (1) bröst Cancer projektet stipendium (2014 – 2016) finansieras av åtgärden för Breast Cancer Foundation och ALIVE 2013 genom forskning, Innovation & Development Trust (Temaauktionen) av Maltas universitet, (2) medicinska fakulteten & Kirurgi, Maltas universitet och (3) projektet ACT finansieras av Malta rådet för vetenskap och teknik genom FUSION: The R & I teknik utveckling för 2016. Publiceringen av detta manuskript stöds genom Jove-Luminex beviljandet.

Etiskt godkännande för användning av bröstcancer vävnadsprover i denna studie erhölls från det universitet Forskning etiska kommittén (UREC) av Maltas universitet (Ref: 22/2012).
1. vävnad förberedelse
<ol><li>Använda lämpliga H & E förfaranden14, förbereda färgade referens vävnadssnitt och digitalt Skanna bilderna för referens under lokalt.</li>
	<li>Använda en mikrotom, skära 20 µm vävnader sektioner på ett RNAse-fri vattenbad vid 40 ° C. Samla in avsnitten membran diabilder för laser lokalt med hjälp av rena, RNase-dekontamineras utrustning och material.</li>
	<li>Torka membran bilderna vid 37 ° C i en snabbtorkande inkubator över natten. Fläcken med de lämpliga H & E förfarande15 med molekylärbiologi grade lösningar och öka färgning tiden för Hematoxylin till 6 min. Om så krävs, fläcken membran bilder med lämpliga immunhistokemisk protokoll16.</li>
</ol>2. laser lokalt
<ol><li>Ange bild begränsningar och kalibrera den scen rörelsen.<ol>
<li>Flytta vyn laser på ett tomt område på en membran-bild. Kalibrera laser fokus genom bränning laser sköt öka fokus intervall (5%) tills lasern börjar att genomborra genom membranet. Rita och microdissect någon form och finjusterat laser fokus att maximera laser effektivitet under laser dissektion.</li>
		<li>Öka scenen rörelse hastigheten till en punkt där laser dissektion effektivitet inte äventyras. Kalibrera lasern på det valda objektivet och kalibrera om ändrar målen (laser hastighet på 1 – 15%), fokus på 70 – 75%, och makt på 90 – 100% när du använder den 4 X-objektiv.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Skanna de färgade membran diabilder med målsättningen 4 X.</li>
	<li>Välj och omringa målområdena för lokalt i membran bilden. Laser dissekera ett minsta område av 42 mm2. Spela in området dissekerade för att bestämma volymen av prov homogeniserande buffert som ska användas.</li>
	<li>Använda den gemensamma jordbrukspolitik lyftmekanismen för att hämta avsnittet dissekerade på diffusor mössor av märkta rör bifogas den lämpliga bihang. Om avsnittet dissekerade inte hämtas på locket, upprepa laser dissektion av området.</li>
</ol>3. vävnad Lysis
Obs: Flera lösningar och material levereras tillsammans med byggsatser som nämns i Tabell för material.
<ol><li>Förbereda den homogeniserande blandning-volymen som krävs för provet Lys med homogeniserande lösning och proteinas K i förhållandet 60:1.</li>
	<li>Pipettera 2,4 µL av homogenisering lösning i varje rör för varje 1 mm2 av tissue område, virvel för 10 s vid maximal hastighet och centrifugera vid rumstemperatur i 5 s vid 2500 x g.</li>
	<li>Inkubera i en värmeblocket vid 65 ° C under 12 – 18 h med skakningar vid 600 rpm.</li>
	<li>Centrifugera i lysates vid 21 000 x g under 5 minuter i rumstemperatur.</li>
	<li>Med pipett noggrant aspirera klara supernatanten och fördela i en märkt färska tube. Undvik att aspirera vävnad/membran fragment eftersom detta kan minska kvaliteten på resultaten.</li>
	<li>Förvaras klara supernatanten i-80 ° C frys.</li>
</ol>4. hybridisering-baserad analys
<ol><li>Utför följande preparat.<ol>
<li>Pre Värm lysis blandningen genom att placera reagensmedelsflaskan i en inkubator vid 37 ° C i 30 min och blanda försiktigt genom inversion.</li>
		<li>Om de vävnad homogenates är frysta, Tina i rumstemperatur och inkubera vid 37 ° C i 30 min. Vortex proverna vid högsta hastighet efter inkubering.</li>
		<li>Skakande inkubatorn på 54 ° C och placera sonden av temperatur validering kit en tom brunn av en plattan med 96 brunnar. Efter 2 h kontrollera temperaturen på digitala termometern och ställa delta temperatur skakar inkubator att korrigera för någon temperaturskillnad.</li>
		<li>Blidväder och vortex sonden ligger och blockerar reagens för 10 s, Centrifugera vid rumstemperatur i 5 s 2 500 x g, och hålla på is.</li>
		<li>Håll injektionsflaskan proteinas K på is under användning.</li>
		<li>Sonikera fånga pärlor på 46 KHz för 3 min, sedan virvel vid högsta hastighet för en annan 3 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Förbereda en 25 µL arbetande pärla mix per brunn genom att skala upp följande reagenser med detta: 4.25 µL Nuclease-gratis vatten, 16,65 µL av Lys blandning, 1.00 µL blockerande reagens, 0.10 µL av proteinas K, 0.50 µL av fånga pärlor, 2,50 µL av probsats.</li>
	<li>Vortex arbetande pärla mixen för 10 s på maxhastighet, sedan Pipettera 25 µL per brunn i magnetisk separering plattan.</li>
	<li>Pipettera 25 µL vävnad Homogenatet plattan med 96 brunnar en magnetisk separering och 25 µL homogenisering lösning 3 brunnar som tomrummen.</li>
	<li>Försegla magnetisk separering plattan med en klar plast tryck tätning och placera plattan i inkubatorn på 54 ± 1 ° C för 18 – 22 h under omskakning vid 600 rpm.</li>
	<li>Bered 1 X tvättbuffertlösning för 24 brunnar genom att blanda 31,5 mL RNase-gratis vatten med 0,1 mL wash buffer komponent 1 och 1,67 mL wash buffer komponent 2.</li>
	<li>Avlägsna plattan från inkubator. Ställa in temperaturen av skakningar inkubator 50 ± 1 ° C.</li>
	<li>Montera magnetisk separering plattan på handhållna magnetbordet brickan och låsa på plats. Ta bort trycket förseglingen och vänta 1 min för de magnetiska pärlorna sedimentera.</li>
	<li>Tvätt steg: Vänd på magnetisk separering plattan monterad på plattan under diskbänken och blot försiktigt på ett silkespapper att ta bort kvarvarande lösning. Med hjälp av en flerkanalspipett Tillsätt 100 µL av 1 X tvättbuffertlösning i varje brunn och vänta 15 s. Upprepa detta steg för att tvätta plattan 3 gånger.</li>
	<li>Överför med pipett 50 μl av förförstärkare reagens till varje brunn. Försegla plattan med en aluminium plåt tätning och skaka plattan vid 800 rpm för 1 min i rumstemperatur. Inkubera i 1 h vid 50 ± 1 ° C under omskakning vid 600 rpm.</li>
	<li>Upprepa steg 4,9 (tvätt steg).</li>
	<li>Överför med pipett 50 μl av förstärkare reagens till varje brunn. Försegla plattan med en aluminium plåt tätning och skaka plattan som i steg 4.10.</li>
	<li>Upprepa steg 4,9 (tvätt steg).</li>
	<li>Vortex etikett sonden för 10 s med maximal hastighet. Tillsätt 50 µL av sonden etikett till varje brunn. Tätning och skaka plattan (steg 4.10).</li>
	<li>Upprepa steg 4,9 (tvätt steg).</li>
	<li>Vortex den streptividin fykoerytrin (SAPE) för 10 s med maximal hastighet. Tillsätt 50 µL av SAPE till varje brunn. Tätning och skaka plattan (steg 4.10).</li>
	<li>Upprepa steg 4,9 (tvätt steg) undantar bruk SAPE tvättlösning i stället för tvättbuffertlösning.</li>
	<li>Tillsätt 130 µL SAPE tvättbuffert i varje brunn och försegla platta med aluminium plattan plomb. Skaka plåten vid 800 rpm i rumstemperatur i 3 min.</li>
	<li>Start-up magnetiska pärla analysatorn. Utföra rutinen kalibrering och kontroll genom att följa tillverkarens instruktioner.</li>
	<li>Ställa in ett protokoll på magnetiska pärla analysatorn använder följande parametrar: provstorlek: 100 µL; DD Gate: 5000-25.000; Tidsgräns: 90 s; Bead händelse/pärla Region: 100; och klicka på Nästa. Välj respektive pärla siffrorna i panelen och definiera Regionkommittén pärla med de respektive målgener som anges av tillverkaren.</li>
	<li>Lägga till en ny analys genom att välja ”skapa Batch använder ett befintligt protokoll” från fliken batchar . I plattan layout utse brunnarna som okänd eller tomt, respektive och ange en etikett för varje prov på panelen prover .</li>
	<li>Ta bort aluminium plattan tätningen från 96 brunnar reaktion plattan. Mata ut plattan facket genom att klicka på utmatningsknappen , ladda plattan i magnetiska pärla analyzer. Klicka på dra tillbaka| Kör Batch att inleda analysatorn. Efter behandlingen, mata ut och ta bort plattan med 96 brunnar. Rengör och stänga ned den magnetiska pärla analyzer som rekommenderas av tillverkaren.</li>
</ol>5. dataanalys
<ol><li>I parti| Resultat fliken, välj filen respektive analys och klicka på knappen Exportera to.csv . Öppna the.csv filen med ett kalkylprogram.</li>
	<li>Observera den pärla räknas och utelämna några resultat med < 40 pärlor/region.</li>
	<li>I genomsnitt ut värdena av tomma brunnar och arbeta ut standardavvikelsen (SD) och gränsen för upptäckt (LOD) (tom genomsnitt + (3xSD)) per målgenen. Ange värden lägre än LOD som oupptäckt. Obs: Om någon av normaliserande uttryckets värden är oupptäckta, betrakta exempeldata som otillräcklig. Överväga uttryckets värden över 20.000 som över gränsen övre känslighet. Lysates av dessa prover bör spädas och åter analyseras.</li>
	<li>Subtrahera tom genomsnittet från rådata per genen.</li>
	<li>Beräkna det geometriska medelvärdet av de valda normaliserande generna per prov. Normalisera enskilda exempeldata till respektive geometriska medelvärdet.</li>
	<li>Analysera data på data science-plattformar eller med hjälp av definierade algoritmer.<ol>
<li>Importera data till data science plattformen genom att klicka på Lägg till Data. Dra datafilen till Processen arbetsyta och ansluta till en aktör som [Välj attribut] sedan till en Principal Komponentanalys (PCA) operatör, och sedan till result hamn.</li>
		<li>I Välj attribut föraren välja en delmängd av de normaliserade gen data och en nominell variabel till exempel bröst cancer subtyp. Kör processen genom att klicka på spela. I fliken diagram väljer du den ”Scatter 3D färg” i internationell stil och den nominella variabeln i fältet färg . Bedöma PCA data variabiliteten på en 3-dimensionell tomt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Abrahamsen, H. N., Steiniche, T., Nexo, E., Hamilton-Dutoit, S. J., Sorensen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+quantitative+mRNA+analysis+in+paraffin-embedded+tissues+using+real-time+reverse+transcriptase-polymerase+chain+reaction:+a+methodological+study+on+lymph+nodes+from+melanoma+patients.">Towards quantitative mRNA analysis in paraffin-embedded tissues using real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction: a methodological study on lymph nodes from melanoma patients.</a> J Mol Diagn. 5 (1), 34-41 (2003).</li><li>Macabeo-Ong, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+duration+of+fixation+on+quantitative+reverse+transcription+polymerase+chain+reaction+analyses.">Effect of duration of fixation on quantitative reverse transcription polymerase chain reaction analyses.</a> Mod Pathol. 15 (9), 979-987 (2002).</li><li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+quantification+of+gene+expression+in+homogenates+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">Direct quantification of gene expression in homogenates of formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Biotechniques. 40 (4), 481-486 (2006).</li><li>Flagella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multiplex+branched+DNA+assay+for+parallel+quantitative+gene+expression+profiling.">A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling.</a> Anal Biochem. 352 (1), 50-60 (2006).</li><li>Goldhirsch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+subtypes--dealing+with+the+diversity+of+breast+cancer:+highlights+of+the+St.+Gallen+International+Expert+Consensus+on+the+Primary+Therapy+of+Early+Breast+Cancer+2011.">Strategies for subtypes--dealing with the diversity of breast cancer: highlights of the St. Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2011.</a> Ann Oncol. 22 (8), 1736-1747 (2011).</li><li>Schnitt, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+and+prognosis+of+invasive+breast+cancer:+from+morphology+to+molecular+taxonomy.">Classification and prognosis of invasive breast cancer: from morphology to molecular taxonomy.</a> Mod Pathol. 23, S60-S64 (2010).</li><li>Bae, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+expression+in+carcinoma+cells+correlates+with+tumor+aggressiveness+and+poor+clinical+outcome+in+patients+with+invasive+breast+cancer.">Fibronectin expression in carcinoma cells correlates with tumor aggressiveness and poor clinical outcome in patients with invasive breast cancer.</a> Hum Pathol. 44 (10), 2028-2037 (2013).</li><li>Park, J., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+epithelial+cell+interactions+with+fibronectin+stimulate+epithelial-mesenchymal+transition.">Mammary epithelial cell interactions with fibronectin stimulate epithelial-mesenchymal transition.</a> Oncogene. 33 (13), 1649-1657 (2014).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MRI+detection+of+breast+cancer+micrometastases+with+a+fibronectin-targeting+contrast+agent.">MRI detection of breast cancer micrometastases with a fibronectin-targeting contrast agent.</a> Nat Commun. 6, 7984 (2015).</li><li>Antonyak, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+cell-derived+microvesicles+induce+transformation+by+transferring+tissue+transglutaminase+and+fibronectin+to+recipient+cells.">Cancer cell-derived microvesicles induce transformation by transferring tissue transglutaminase and fibronectin to recipient cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (12), 4852-4857 (2011).</li><li>Moon, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+on+circulating+extracellular+vesicles+as+a+liquid+biopsy+to+detect+breast+cancer.">Fibronectin on circulating extracellular vesicles as a liquid biopsy to detect breast cancer.</a> Oncotarget. 7 (26), 40189-40199 (2016).</li><li>Parker, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supervised+risk+predictor+of+breast+cancer+based+on+intrinsic+subtypes.">Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes.</a> J Clin Oncol. 27, (2009).</li><li>Nielsen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+validation+of+the+PAM50-based+Prosigna+Breast+Cancer+Prognostic+Gene+Signature+Assay+and+nCounter+Analysis+System+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+breast+tumor+specimens.">Analytical validation of the PAM50-based Prosigna Breast Cancer Prognostic Gene Signature Assay and nCounter Analysis System using formalin-fixed paraffin-embedded breast tumor specimens.</a> BMC Cancer. 14, 177-177 (2014).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematoxylin+and+Eosin+Staining+of+Tissue+and+Cell+Sections.">Hematoxylin and Eosin Staining of Tissue and Cell Sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li><li>Lin, F., Prichard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Practical Immunohistochemistry: Frequently asked questions. , (2011).</li><li>Grech, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Classification+of+Breast+Cancer+Patients+Using+Formalin-fixed+Paraffin-embedded+Derived+RNA+Samples.">Molecular Classification of Breast Cancer Patients Using Formalin-fixed Paraffin-embedded Derived RNA Samples.</a> Journal of Molecular Biomarkers &amp; Diagnosis. 7 (S8), (2016).</li></ol>

The Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay ägs av Thermo Fisher Scientific.

En pärla-baserade multiplex bDNA assay var optimerad för att kvantifiera genuttryck på försämrade RNA härrör från FFPE cancer bröstvävnad och normala bröstet kanaler. Optimera analysen, normalisera inblandade utveckla en algoritm för att klassificera bröstcancer tumörer i luminala och basala subtyper utnyttja 8 kända biomarkörer och 5 potentiella gener. Datanormalisering skedde med hjälp av permutationer av generna som normaliserande. Urvalet av normaliserande generna på bästa förutsägelse av receptor status med hjälp av Luminal/basala klassificerare generna. För att klassificera Luminal/basala subtyper från FFPE-vävnad, var normaliserande generna valt Beta-aktin (ACTB), glyceraldehyd 3-fosfat dehydrogenas (GAPDH) och hypoxantin Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Metoden kan anpassas för användning i andra diagnostiska och forskningsområden efter lämpligt urval av den normaliserande gen-uppsättningen. En viktig tillämpning av denna metod på forskningsområdet är mätning av biomarkörer i arkivmaterial som är väl kommenterad med kliniska resultat. Detta kunde validera potentiella prediktiva markörer i retrospektiva studier, snabbt och korrekt och undvika långsiktiga framtidsstudier väntar på Sjukdomsfri överlevnad och total överlevnadsdata. Vår grupp är för närvarande undersöker användningen av analysen att upptäcka hormonreceptor-positiv exosomes, som kräver utveckling av en ny algoritm använder alternativa normalisera gener för datanormalisering. Användningen av flytande biopsier och robust gen uttryck analyser kan hög genomströmning multiplex analyser anpassad för patienthantering under behandling och tillhandahålla ett sätt att följa behandlingseffekt, potentiella återfall på grund av resistens mot behandling, och metastaserande kapacitet av tumören.
Denna metod har ett brett utbud av möjliga tillämpningar för diagnos av tumörer och är anpassad till det aktuella diagnostiska arbetsflödet. De främsta fördelarna med denna metod i fältet diagnostiska inkluderar: (1) genomförandet av hög genomströmning analyser, (2) exklusive subjektivitet och tvetydiga resultat med ursprung från image-baserad mätningar, (3) korrekt upptäckt av flera mål samtidigt som förbättra noggrannhet och minimera användningen av dyrbara patientprover och (4) inget krav för högt specialiserad utrustning och mänskliga resurser. Optimal provtagning processen, tillsammans med låg tillförsel av material som krävs för den pärla-baserade multiplex assay, tillåter ytterligare utredning av tumör heterogenitet; genom att noggrant skilja flera foci av malign vävnad från samma patient avsnitt med laser lokalt, är det möjligt att jämföra flera genuttryck mellan dem samt med matchade normal vävnad (figur 4). Låg materialinsatsen är avgörande för diagnostiska program på tumör biopsier som ger begränsad tumörvävnad. Analysens kapacitet att mäta genuttryck från försämrade RNA-prover tillåter enkel transport av prover för analys inom en institution eller till underhåll laboratorier. Hela avsnitt analys var dessutom också möjligt med H & E färgade material (figur 1).
För att lyckas med detta protokoll, är det viktigt att: (1) säkerställa korrekt provtagning av tumören webbplats/s som är lyserat för analysen och (2) utvecklas väl optimerad och validerade data normalisering algoritmer, för varje gen uttryck panel eller enskilda prognostiska eller Prediktiva biomarkörer. Den förstnämnda beror på den tekniska erfarenheten av tekniker/forskaren utför provtagning. Det rekommenderas att ta en ytterligare kärna och förbereda en tissue microarray (TMA) i samma format multiplex magnetiska pärla analysens (96 brunnar-format). Detta ger ett arkiv av tumör platser som en replik av prover som används för RNA-baserade analysen. TMAs kan också bedömas med andra metoder för uppföljande forskning eller validering av resultat. Utveckling av normalisering algoritmer är beroende på materialet som utreds och normaliserande generna valts för normalisering. Olika paneler i normalisera gener är utvalda utifrån nivå och variation av uttryck i de prov som analyseras och detta varierar mellan cancer vävnader från olika ursprung, exosomes från plasma eller cirkulerande tumörceller. Validering av analysen innehåller provet bearbetning eftersom olika preparat kommer också att resultera i olika normalisering algoritmer.
För att sammanfatta, bDNA teknik i kombination med magnetiska pärla teknik och val av korrekt panelen av målgener, ger den extra fördelen av att mäta genuttryck direkt i vävnad lysates härrör från små mängder patientmaterial, inklusive microdissected material, exosomes och cirkulerande tumörceller. Förutom identifiering av tumör heterogenitet har korrekt användning av paneler potential att upptäcka tumören härrör exosomes för tidig diagnostik och tidig upptäckt av skov. Eftersom det finns ingen anledning för ett steg för amplifiering av nukleinsyra, signal förstärkning med bDNA teknik, kombinerat med den pärla-baserade multiplex, mäter flera genuttryck i kliniskt-annotated arkivmaterial och ge en resurs för biomarkör validering.

Optimering av RNA baserat analyser med hjälp av formalin-fast paraffin-inbäddat (FFPE) arkivmaterial är utmanande beror på variabiliteten hos kirurgiska vävnad behandling och nedbrytning av RNA som orsakas av formalin används för vävnad integritet bevarande1, 2. För att övervinna begränsning av utför korrekt gen uttryck studier från arkivmaterial, används vår grupp bDNA multiplex magnetiska pärla analysen. I stället för enzymatisk amplifiering av en mål-mall använder bDNA tekniken hybridisering av särskilda sonder och förstärkning av en reporter signal3. Den korta erkännande sekvenser av avskiljning och upptäckt sonderna är utformade för att hybridisera till korta fragment av målet RNA4. Dessutom, övervinner användning av vävnad homogenates som direkt utgångsmaterial i denna analys, oundvikliga förlusten av RNA som resultat från analyser som kräver föregående RNA-extraktion och rening. Signalen förstärkning, användning av kort erkännande sekvenser och uteslutandet av en reningssteg, bidra till att minska i teknisk variation av analysen. Tekniken ger möjlighet att multiplex analysen (upp till 80 RNA mål) och mäta uttrycket av en panel av mål från låga material ingång. Det här protokollet beskriver beredning och färgning av vävnadsprover för laser lokalt. Färgning i membran bilderna underlätta bildtagning av tumör och histologiska arkitekturen att tillhandahålla korrekt urval och profilering av: (1) tumör och normala kanaler i bröstvävnad, och (2) maligna cellen kloner inom heterogen tumörer.
Molekylära klassifikationen av bröstcancer är en process som förhör molekylära markörer för att kategorisera patientens tumörer i tre Molekylär klasser, dvs, luminala, human epidermal tillväxtfaktor receptor 2 (HER2)-berikad, och basala subtyp. Undertypen HER2-berikad är väldefinierade, med högt uttryck av HER2-receptorn, på grund av ERBB2 genen förstärkning, kombinerat med låg eller frånvarande östrogenreceptor (ER)- och progesteronreceptor (PgR). Luminala undertypen är allmänt positivt för ER och basala undertypen är i allmänt negativa för tre receptorer (HER2, ER, PgR) och betydligt överlappningar med trippel negativ bröstcancer cancer (TNBC) diagnostiska undertyp5,6. Andra markörer används för att bestämma epitelial och mesenkymala egenskaper. Fibronektin (FN1) är en huvudkomponent i bröst vävnad mesenkymala facket. Ökat FN1 uttryck åtföljs av högt Ki67 färgning, och visar en signatur för en mer invasiv tumör7,8 och är associerad med metastaser9. Intressant, befanns FN1 vara närvarande i microvesicles med ursprung från tumörcellerna, som inducerad aktivering av mitogena signaler i mottagarens fibroblaster10. Därför cirkulerar microvesicles såsom exosomes är potentiella markör för tidig upptäckt eller metastas och återfall11.
Tumör areal utväljande för bröstcancer cancer transkriptionell subtypning har återkommande utförts av macrodissection12,13. För att övervinna vävnad heterogenitet och öka känsligheten, har vi tillförlitligt kombinerat klassisk vävnad färgning med multiplex molekylär profilering metoder. Som ett bevis på principen, har två distinkta breast cancer kloner definierats av deras epitelial mesenkymala signatur och metastatisk potential. Arbetsflödet för protokollet beskrivs kan lätt översättas till den nuvarande kliniska setup och används för att selektivt isolera och karakterisera vävnad subtyper med riktade mRNA profilering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heamatoxylin Mayer&#39;s</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>MHS16-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eosin Y Aquaeous solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT110216-500mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Rabbit Serum</td>
			<td>Monosan</td>
			<td>MONX10963</td>
			<td>Working dilution: 1/40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated Rabbit anti-mouse</td>
			<td>Dako</td>
			<td>E0354</td>
			<td>Working dilution: 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ER antibody (6F11)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>VPE614</td>
			<td>Working dilution: 1/45</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HER2 antibody (CB11)</td>
			<td>Novocastra</td>
			<td>CB11-L-CE</td>
			<td>Working dilution: 1/325</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67 antibody (MIB-1)</td>
			<td>Dako</td>
			<td>M7240</td>
			<td>Working dilution: 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avidin Biotin Complex kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon Eclipse Ti-E Inverted microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>Ti-E</td>
			<td>4x, 10x, 20x and 40x objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Microdissection membranes</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>S0103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi CellCamera 1.4</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>MX4285c-ACK07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Cellcut Plus</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diffuser caps</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td>50210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mmi Celltools Software v.4.01rcl</td>
			<td>Molecular Machines &#38;Industries</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355000038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5mL heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate heating block for Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22670565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Labnet Vortemp 56 Shaking incubator</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>52056A-220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LX200 100/200</td>
			<td>Luminex</td>
			<td></td>
			<td>Magnetic bead analyser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Sample Processing Kit - FFPE Tissues</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Assay Kit (Magnetic Separation)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermaseal RTS Sealing Film</td>
			<td>Thermaseal</td>
			<td>765246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand-Held Magnetic Plate Washer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QP1011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Incubator Temperature Validation Kit</td>
			<td>Affymetrix/Panomics</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K (50&#181;g/&#181;L)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen QuantiGene Plex 2.0 Sets</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi Speed Vortex</td>
			<td>Kisker Biotech</td>
			<td>MSV-3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Silvercrest</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNASEZAP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium 96-well plate seal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z721549-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature Validation Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>QS0517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RapidMiner Studio Community 7.1.001</td>
			<td>RapidMiner</td>
			<td></td>
			<td>Data Science Platform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridisation oven</td>
			<td>Hybaid (Thermo Scientific)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization of a multiplex rna-based expression assay using breast cancer archival material

Nukleinsyra nedbrytning i arkivens vävnad, tumör heterogenitet och brist på färsk fryst vävnadsprover kan negativt påverka cancer diagnostiska tjänster i patologi laboratorier över hela världen. Gen förstärkning och uttryck diagnostiska tester med arkivens material eller material som kräver transport till underhåll laboratorier, behöver ett mer robust och exakt test anpassas till aktuella kliniska arbetsflöden. Vår forskargrupp optimerad användning av Invitrogen™ QuantiGene™ Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) att kvantifiera RNA i arkivmaterial med Grenade-DNA (bDNA)-teknik på Luminex xMAP® magnetiska pärlor. Gen uttryck analysen beskrivs i detta manuskript är en roman, snabb och multiplex metod som kan klassificera bröstcancer i de olika molekylära subtyper, utelämna subjektivitet tolkningen inneboende i imaging tekniker. Dessutom, på grund av låg input av material krävs, heterogena tumörer kan vara laser microdissected med Hematoxylin och Eosin (H & E) färgade sektioner. Denna metod har ett brett utbud av möjliga tillämpningar inklusive tumorklassifikation med diagnostiska potential och mätning av biomarkörer i flytande biopsier, vilka skulle möjliggöra bättre patientbehandling och sjukdom övervakning. Kvantitativ mätning av biomarkörer i arkivmaterial är dessutom användbar i onkologi forskning med tillgång till bibliotek av kliniskt annotated material, där retrospektiva studier kan validera potentiella biomarkörer och deras kliniska resultat korrelation.

Den beskrivna metoden har tillämpats för samtidig mätning av 40 avskrifter i H & E målat (figur 1), microdissected (figur 2) försämrad mycket FFPE material. Med den här metoden visar vi korrekt karakterisering av receptor status (figur 3A), klassificering av tumörer i luminala och basala molekylära subtyper17och differentiell uttryck av mesenkymala marker, FN1, när man jämför tumör och matchad kontroll vävnad (figur 3B), i de olika receptor positiva och negativa undertyperna.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig1.jpg"> Figur 1: genuttryck med H & E färgade material. Korrelation mellan en uttryck-profil som härrör från en ofärgade tumör avsnitt jämfört med en betsad tumör avsnitt. [Pearson korrelation p-värde = 5.34E-26]. Reproducerad med tillstånd17. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig2.jpg"> Figur 2: Laser lokalt av FFPE vävnader. (A) H & E färgade bilden. (B) immunhistokemisk färgning för ER uttryck; (C) HER2 immunhistokemisk färgning; (D) ofärgade µm 20 avsnitt på laser lokalt membran bilder. Den gula pilen anger ett område med invasiv tumör som inte är klart avgränsat på grund bristande färgning. (E) A 20 µm avsnitt färgad med H & E för bättre avgränsning av områden av intresse. Vita pilar indikerar laser dissektion spår medan den röda pilen visar laser fokus under dissektion. Alla illustrationer fångades vid 10 x förstoring. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig3.jpg"> Figur 3: uttryck för (A) receptor status och (B) mesenkymala markör FN1, i bröstet tumör jämfört med matchade normala. De klassiska diagnostiska breast cancer undertyperna definieras enligt diagnostiska resultat med hjälp av immunohistokemi och fluorescens i situ hybridisering (FISH) för HER2 tvetydiga immunhistokemisk färgning. Normaliserade uttrycket av (A) HER2 och ER, (B) FN1 mäts av hybridisering-baserade analysen illustreras i HER2 positiv, ER positiva och TNBC fall jämfört med patienten matchade normal bröstvävnad. Kruskal Wallis provutfallets (K-W χ2) visar att uttrycket av HER2 är signifikant (p < 0,05) högre i tumörvävnad i motsats till den matchade normal vävnaden i HER2 positiv kohorten och betydligt lägre i den TNBC kohorten. ER uttrycket befanns inte vara betydligt högre i tumörvävnad i motsats till den matchade normalt i ER positiva och TNBC kohorter. FN1 är betydligt högre i tumörvävnad i de HER2 och ER positiva subtyperna och visar en tendens att vara kraftigt förhöjda i tumörvävnad också i TNBC kohorten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57148/57148fig4.jpg"> Figur 4: Fallstudie: tumör heterogenitet. Morfologiskt skilda tumörer var microdissected och behandlas som olika prover. (A) befälhavaren genomsökning av avsnittet H & E. (B, C) En 10 x och 40 x förstoring, respektive för varje tumör morfologi identifieras. (D) immunhistokemisk färgning för ER vid 10 x förstoring. (E) immunhistokemisk färgning för Ki67 vid 10 x förstoring visar en högre mitotiska aktivitet i tumör 1. (F) normaliserad uttrycksnivåerna för den ESR1 genen i varje tumör visar relativt höga och lika uttryck mellan tumörer som förväntat från immunhistokemisk resultatet. (G) normaliserad uttrycksnivåerna för FN1, mesenkymala markör, där ökad FN1 expression åtföljs av högt Ki67 färgning visar en signatur för en mer invasiv tumör. Inversen observeras i tumör 2, som verkar vara en långsammare prolifererande tumör med lägre malign potential representeras av minskad FN1 uttryck. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57148/57148fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material at JoVE.com

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nukleinsyra nedbrytning i arkivens vävnad, tumör heterogenitet och brist på färsk fryst vävnadsprover kan negativt påverka cancer diagnostiska tjänster i patologi laboratorier över hela världen. Detta manuskript beskriver optimering av en panel av biomarkörer med en multiplex magnetiska pärla-analys för att klassificera bröstcancer.

Optimering av en Multiplex RNA-baserade uttryck analysen använder Breast Cancer arkivmaterial

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

High Throughput MicroRNA Profiling: Optimized Multiplex qRT-PCR at Nanoliter Scale on the Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCs

Hög genomströmning MikroRNA Profilering: Optimerad Multiplex QRT-PCR vid metod i nanoliter Skala på Fluidigm Dynamic ArrayTM IFCS

The broad involvement of miRNAs in critical processes underlying development, tissue homoeostasis and disease has led to a surging interest among the ...

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Hög genomströmning Protein Expression Generator Med en mikroflödessystem plattform

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Protokoll för Biofilm Streamer Bildning i ett mikroflödessystem enhet med Micro-stolparna

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Fabrication of a Bioactive, PCL-based "Self-fitting" Shape Memory Polymer Scaffold

Tillverkning av ett bioaktivt, PCL-baserade &quot;Självpassande&quot; formminne polymerskelettet

Tissue engineering has been explored as an alternative strategy for the treatment of critical-sized cranio-maxillofacial (CMF) bone defects. Essential to ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

Generiskt protokoll för optimering av heterologa proteinproduktion med hjälp av automatiserad Microbioreactor teknik

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

En snabb Image-baserad bakteriell virulens analys med hjälp av amöba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

A New Ex Vivo Model for the Evaluation of Endoscopic Submucosal Injection Material Performance

En ny Ex Vivo -modell för utvärdering av endoskopisk submukosala injektion Material prestanda

Increasing the performance of submucosal injection materials (SIMs) is important for endoscopic therapy of early gastrointestinal cancer. It is essential ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Material bildning av rekombinant Spider Silks genom vattenhaltiga Solvation med hjälp av värme och tryck

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a Multiplex Genome Editing of Saccharomyces cerevisiae and the Creation of Yeast Pixel Art

CRISPR/Cas12a multiplex genom redigering av Saccharomyces cerevisiae och skapandet av jäst pixel art

High efficiency, ease of use and versatility of the clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) ...