Name: an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها JST، المعزوفة (بالنيابة)، والبحوث الأساسية افولوشونال العلوم والتكنولوجيا (JPMJCR12W2 ())، معونات "البحث العلمي" في "مجالات مبتكرة" (وزارة التربية والتعليم والثقافة، والرياضة، والعلوم والتكنولوجيا (يأمرون)، اليابان 26119708 (بالنيابة) و 16 ح 06480 ())، والعلمية البحث (أ) (جمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) 24240049 ())، والعلماء الشباب (A) (JSPS ح 15 05326 (بالنيابة))، ومعونات للبحث العلمي في مجالات مبتكرة "الأسفار لايف "يأمرون، واليابان، ومنهاج للتصوير" النهج الديناميكي "" النظام الذين يعيشون "من يأمرون، اليابان.

1-جيل خطوط الخلايا مستقرة بنظام Tol2
<ol><li>
ترانسفيكت بلازميد ناقلات (الشكل 1A) من الوحدات النمطية المستندة إلى Tol2 أوبتوجينيتيك إلى جانب ناقلات التعبير ترانسبوساسي (Tol2) (بكاجس-mT2TP) إلى الخلايا C2C12. في كل الخطوات، خلايا الثقافة مع دميم المتوسطة وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS...

<ol>
	<li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation.">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns.">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li><li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock.">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics.">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li><li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock.">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141 (2012).</li><li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li><li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information.">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li><li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, S7 (2007).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).</li><li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging.">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li><li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae.">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li><li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs.">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li></ol>

لقد أظهرنا أسلوب لمراقبة ديناميات التعبير الجيني مع دورية ح 2 إلى 3. هذا الجدول الزمني أقصر بكثير من تلك الموجودة في النظم التقليدية الأخرى، بما في ذلك تيت في النظام ونظام ليتون الأصلي. المحددات الأساسية للوصول إلى المقاييس الزمنية أولتراديان إنصاف المستحثة بصور المنتجات الجزيئية ومرناس ?...

خلية إلى خلية الاتصالات تلعب أدواراً حاسمة في الزخرفة الجنينية في العمليات الإنمائية. في أجنة الفقاريات، تتشكل هياكل ميتاميريك يسمى سميتس على طول المحور الأمامي الخلفي الجسم مع دقة زمنية دقيقة تحت مراقبة على مدار الساعة حفظ الوقت، يسمى تجزئة عقارب الساعة1. أثناء هذه العملية، يتم تحويل مجموعة من الخلايا بريسوميتيك mesoderm (PSM) دورياً إلى سميتس على نحو متزامن. تنطوي هذه العملية على التعبير الجيني متذبذبة متزامنة والخلايا PSM أن يتذبذب في مرحلة تشكل سميتس نفسه. وفترة التعبير الجيني متذبذبة حوالي 2 إلى 3 ح في الفئران وحوالي 30 دقيقة في الزرد. عند فصله، تفقد الخلايا PSM التزامن2،3، ولكن عندما تكون إعادة تجميعها، يمكن تنظيم ذاتي واسترداد السكان تتسق4، مما يوحي بأن اقتران خلية خلية مفتاح متزامنة ذبذبات.
كشفت الجهود المكثفة أن إشارات الجزيئات في مسار دلتا-الدرجة متصلة محكم بذبذبات متزامنة من الجينات على مدار الساعة تجزئة. أما مثبطات الدوائية أو طفرات وراثية من الدرجة الأولى مما يشير إلى لﻻستخدام سكان التذبذب. في الزرد، عرض طفرات من الدرجة الأولى مما يشير إلى عناصر، مثل ديلتاك وديلتاد و Notch1a، ذبذبات غير متزامن5،6. في الأجنة الفرخ أو الماوس، يجند الشق دلتا-like1 (Dll1) ليس فقط، بل أيضا هامش "حز المغير مجنونة" (لفنج) مطلوب لذبذبات متزامنة7،،من89. ومع ذلك، كان من الصعب لاختبار القدرة الوظيفية لهذه الجزيئات لنقل المعلومات الحيوية من خلية إلى أخرى، نظراً لأن قرارات مؤقتة من اضطراب التقليدية لديناميات تنظيم الجينات لم تكن كافية للتحقيق العمليات لفترات زمنية من 2-3 ح (إيقاعات أولتراديان).
قمنا مؤخرا بتطوير أسلوب متكامل لمراقبة ورصد أنماط التعبير الجيني في خلايا الثدييات10. هذه التكنولوجيا تمكن الاستقراء البقول التعبير الجيني بالإضاءة الخفيفة دورية على جداول زمنية أولتراديان. ويمثل هذا البروتوكول الأساليب إنشاء خطوط الخلايا حساس ومراقبة ردود دينامية للخلايا مراسل التﻷلؤ خلية يعيش الرصد في السياقات من خلية إلى خلية الاتصالات. هذا الأسلوب المنطبق على تحليل العديد من مسارات الإشارات الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">FACS</td>
			<td style="width:237px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:180px;">FACSAriaII SORP</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iKon M-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-81 ZDC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PMT device</td>
			<td>Churitsu eletric corp.</td>
			<td>CL24B-LIC/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Blue LED illuminator</td>
			<td>OptoCode</td>
			<td>LEDB-SBOXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08459-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td>
			<td>Hi-tech</td>
			<td>303012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>20028-24&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Light meter</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>LI-250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-HA-Peroxidase antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>clone 3F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-Actin-Peroxidase antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>clone 2F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

ينبغي أن تستجيب الخلايا بشكل صحيح للبيئات، التي تتأثر بعوامل مختلفة من المحيطة بالخلايا المتغيرة وقتيا. الشق مما يشير إلى المسار هو واحد من هذه الآلية الجزيئية الأساسية للاتصالات خلية إلى خلية، والذي يلعب دوراً رئيسيا في التطور الطبيعي للأجنة. هذا المسار ينطوي نقل خلية إلى خلية المعلومات متذبذبة مع إيقاعات أولتراديان، ولكنه على الرغم من التقدم المحرز في تقنيات البيولوجيا الجزيئية، وقد تم تحديا لتوضيح أثر التفاعلات متعددة الخلايا في الجينات متذبذبة ديناميات. نقدم هنا، على بروتوكول يسمح بالتحكم أوبتوجينيتيك ويعيش رصد أنماط التعبير الجيني بطريقة زمنية محددة. وكشف هذا الأسلوب بنجاح أن مدخلات دورية داخل الخلايا وبين الخلايا مما يشير إلى درجة انترين ذبذبات الجوهرية بمرحلة تحول في القرار خلية واحدة وضبط التردد. وهذا النهج ينطبق على تحليل السمات الدينامية لمختلف مسارات الإشارات، توفير منصة فريدة لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.

علينا تكييف ليتون النظام11،12، الذي يتيح التعبير الجيني الناجمة عن الصور في خلايا الثدييات، لدراسة التذبذب الوراثية مع تواتر ح 2 إلى 3. ويتألف هذا النظام من جزئين: هجافبو صور إيندوسيبلي المنشط النسخي وكاسيت UAS-مروج لمحرك أقراص النسخ من جينات ...

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

نقدم هنا، بروتوكول تحليل خلية إلى نقل المعلومات متذبذبة بالتحكم أوبتوجينيتيك والعيش الرصد للتعبير الجيني. هذا النهج يوفر منبرا فريداً لاختبار دلالة وظيفية البرامج تعبير الجينات الحيوية في أنظمة متعددة الخلايا.

أسلوب أوبتوجينيتيك لمراقبة وتحليل أنماط التعبير الجيني في تفاعلات الخلية للخلية

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

التلاعب الجيني للمسببات الأمراض النباتية<em&gt; السوادية الذروية</em&gt; لدراسة علم الأحياء الفطرية النباتية وميكروب التفاعلات

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

قياس موازية التعبير الإيقاعية جين ساعة وهرمون إفراز في مزارع الخلايا الأولية البشرية

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

علم البصريات الوراثي الطفرات عشوائية عن طريق هيستون-miniSOG في<em&gt; C. ايليجانس</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

وحيدة الخلية التعبير الجيني عن طريق المتعددة RT-QPCR لتوصيف عدم التجانس من السكان اللمفاوية نادر

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

وحيدة الخلية التعبير الجيني التنميط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية وQPCR مع المعايير الداخلية

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

نموذج إعداد وتحليل البيانات التعبير الجيني على أساس رناسيق من الزرد

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

قياس التعبير الجيني في طبقات الارون الشعير قصفت مع زيادة الإنتاجية

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

أسلوب لدراسة تعدد الأشكال C924T الجينات مستقبلات A2 ثرومبوكاني

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone المستندة إلى مستقبلات فريدة الجينات التبديل للتعبير المتعمد للتحوير مع المتانة وإمكانية الرجوع ويجتازها لا يعتد بها

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...