Name: an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00
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Diese Arbeit wurde von JST, PRESTO (A.I.), Core Research für evolutionäre Wissenschaft und Technik (JPMJCR12W2 (r.k.)), Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen (Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT), Japan unterstützt. 26119708 (A.I.) und 16 H 06480 (r.k.)), wissenschaftliche Forschung (A) (Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) 24240049 (r.k.)) und Nachwuchswissenschaftler (A) (JSPS 15 H 05326 (A.I.)), und eine Beihilfe für die wissenschaftliche Forschung an innovativen Bereichen "Fluoreszenz Live Bildgebung"des MEXT, Japan, und Plattform für dynamische Ansätze zu Living System von MEXT, Japan.

1. Erzeugung von stabilen Zelllinien vom Tol2 System
<ol><li>
Transfizieren Sie Plasmid-Vektoren (Abbildung 1A) Tol2-basierte optogenetische Module zusammen mit dem Expressionsvektor Transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) in C2C12 Zellen. Bei allen Schritten, Zellkulturen mit DMEM Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und Penicillin-Streptomycin bei 37 ° C (Tabelle 1), in Anwesenheit von 5 % CO2, sonst gekennzeichnet.
	<ol>
<li>Zählen Sie trypsiniert ...

<ol>
	<li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation.">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns.">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li><li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock.">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics.">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li><li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock.">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141 (2012).</li><li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li><li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information.">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li><li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, S7 (2007).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).</li><li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging.">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li><li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae.">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li><li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs.">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li></ol>

Wir haben eine Methode zur Steuerung von gen Ausdruck Dynamik mit einer Periodizität von 2 bis 3 h gezeigt. Diese Zeitskala ist viel kürzer als die in anderen konventionellen Systemen, einschließlich der Tet-System und das Originalsystem LightOn. Wichtige Parameter, die ultradian Zeitskalen zu erreichen sind Halbwertszeiten von Foto-induzierte molekulare Produkte, mRNAs und Proteinen. Zelltypen und Arten können diese kinetische Parameter abhängen. Für die Optimierung der Kinetics, ist Hes1 3' UTR Sequenzen durch an...

Zell-Zell-Kommunikation spielen wichtige Rollen im embryonalen Musterung in Entwicklungsprozessen. In den vertebrate Embryos sind die Metamere Strukturen, so genannte Somiten entlang der anterior-posterioren Körperachse mit präzise zeitliche Genauigkeit unter der Kontrolle einer Zeitmessung Uhr, genannt die Segmentierung Uhr1gebildet. Während dieses Prozesses eine Gruppe von presomitic Mesoderm (PSM) Zellen sind in regelmäßigen Abständen umgewandelt in Somiten in einer synchronen Weise. Dieser Prozess beinhaltet das synchronisierte oszillierende Genexpression und PSM-Zellen, die in Phase schwingen bilden die gleichen Somiten. Die oszillierende Genexpression beträgt etwa 2 bis 3 h bei Mäusen und ca. 30 min im Zebrafisch. Wenn dissoziiert, PSM Zellen verlieren die Synchronität2,3, aber wenn sie neu aggregiert werden, können sie selbst zu organisieren und die Bevölkerung Synchronität4, darauf hindeutet, dass Zell-Zell-Kupplung einen Schlüssel für die synchronisierte zu erholen Schwingungen.
Umfangreiche Anstrengungen ergab, dass Signalmoleküle in den Delta-Notch-Signalweg auf die synchronisierten Schwingungen der Segmentierung Uhrengene eng verbunden sind. Pharmakologische Inhibitoren oder genetische Mutationen der Notch signaling Synchronisierung die Bevölkerung der Oszillatoren. Im Zebrafisch anzeigen Mutanten von Notch signaling Komponenten wie DeltaC, DeltaD und Notch1a, asynchrone Schwingungen5,6. Küken oder Maus-Embryonen ist nicht nur Notch-Liganden Delta-like1 (Dll1), sondern auch die Kerbe Modulator Lunatic Fringe (Lfng) erforderlich für synchronisierte Schwingungen7,8,9. Jedoch wurde es schwierig, die Funktionsfähigkeit von solchen Molekülen zur dynamischen Informationsübertragung von Zelle zu Zelle zu testen, weil zeitliche Auflösungen von konventionellen Störung gen Verordnung Dynamik nicht ausreichend zu untersuchen, wurden die Prozesse der Zeitrahmen von 2 – 3 h (ultradian Rhythmen).
Wir haben vor kurzem eine integrierte Methode zur Steuerung und Überwachung gen Expressionsmuster in Säugerzellen10entwickelt. Diese Technologie ermöglicht die Induktion der gen-Expression-Impulse durch regelmäßige Beleuchtung auf ultradian Zeitskalen. Dieses Protokoll stellt die Methoden zum lichtempfindliche Zelllinien zu etablieren und dynamische Antworten der Reporter Zellen durch live-Cell-Lumineszenz Überwachung in den Kontexten von Zelle zu Zelle Kommunikation zu beobachten. Diese Methode ist anwendbar auf die Analyse von viele andere Signalwege.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">FACS</td>
			<td style="width:237px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:180px;">FACSAriaII SORP</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iKon M-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-81 ZDC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PMT device</td>
			<td>Churitsu eletric corp.</td>
			<td>CL24B-LIC/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Blue LED illuminator</td>
			<td>OptoCode</td>
			<td>LEDB-SBOXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08459-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td>
			<td>Hi-tech</td>
			<td>303012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>20028-24&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Light meter</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>LI-250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-HA-Peroxidase antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>clone 3F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-Actin-Peroxidase antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>clone 2F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

Zellen sollten richtig reagieren, sich zeitlich ändernden Umgebungen, die durch verschiedene Faktoren aus den umliegenden Zellen beeinflusst werden. Der Notch-Signalweg ist eine solche wesentliche molekularen Maschinerie für Zell-Zell-Kommunikation, die Schlüsselrollen in der normalen Entwicklung der Embryonen spielt. Dieser Weg beinhaltet eine Zelle zu Zelle Informationsübertragung oszillierende mit ultradian Rhythmen, aber trotz der Fortschritts in den Techniken der Molekularbiologie, es ist schon eine Herausforderung, die Auswirkungen der vielzelligen Interaktionen auf oszillierende gen aufzuklären Dynamik. Hier präsentieren wir eine Protokoll, die optogenetische Steuerung und live-Überwachung des Gens Expressionsmuster präzise zeitliche ermöglicht. Diese Methode zeigte erfolgreich, dass intrazellulären und interzellulären regelmäßige Eingänge der Notch signaling innere Schwingungen durch Frequenz-tuning und Phasenverschiebung bei einzelligen Auflösung mitzureißen. Dieser Ansatz gilt für die Analyse der dynamischen Eigenschaften von verschiedene Signalwege, bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Wir haben die LightOn System11,12, wodurch Foto-induzierte Genexpression in Säugerzellen, zur Erforschung der genetischen Oszillatoren mit 2 - 3 h Periodizität angepasst. Dieses System besteht aus zwei Teilen: die Foto-induzierbaren transcriptional Aktivator hGAVPO und eine UAS-Promotor-Kassette zu Laufwerk Transkription von willkürlichen Gene von Interesse. Um die pulsatile Kinetik der Foto-induzierte Genexpression zu beschleu...

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An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu analysieren von Zelle zu Zelle Übertragung der oszillierenden Informationen durch optogenetische Kontrolle und Überwachung der Genexpression zu leben. Dieser Ansatz bietet eine einzigartige Plattform, um eine funktionale Bedeutung der dynamischen Ausdruck Genprogramme in mehrzelligen Systeme zu testen.

Eine optogenetische Methode zu kontrollieren und analysieren gen Expressionsmuster in Zell-Zell-Interaktionen

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

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Genetische Manipulation der Pflanze Pathogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Zu Pilzbiologie und Pflanzen Mikroben-Interaktionen Studie

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Forschung

Genetik

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Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

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Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

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