Name: an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

עבודה זו נתמך על ידי JST, פרסטו (מלאכותית), ליבת המחקר אבולוציונית למדע וטכנולוגיה (JPMJCR12W2 (ר. ק)) מענק הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים (משרד החינוך, תרבות, ספורט, מדע, טכנולוגיה (MEXT), יפן 26119708 (אינטליגנציה מלאכותית) ו- 16 H 06480 (ר. ק)), מדעי מחקר (א) (יפן החברה לקידום המדע (JSPS) 24240049 (ר. ק)), מדענים צעירים (א) (JSPS H 15 05326 (אינטליגנציה מלאכותית)), ואת מענק של הסיוע למחקר מדעי בתחומים חדשניים "זריחה חי הדמיה"של MEXT, יפן, פלטפורמה עבור גישות דינאמיות למערכת חיים מ MEXT, יפן.

1. דור של שורות תאים יציב על ידי מערכת Tol2
<ol><li>
Transfect פלסמיד וקטורים (איור 1 א') של מודולים optogenetic מבוססי Tol2 יחד עם וקטור ביטוי transposase (Tol2) (pCAGGS-mT2TP) לתוך התאים C2C12. בכל השלבים, התרבות תאים בינונית DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו פניצילין-סטרפטומיצין ב 37 מעלות צלזיוס (טבלה 1), ב?...

<ol>
	<li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation.">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns.">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li><li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock.">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics.">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li><li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock.">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141 (2012).</li><li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li><li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information.">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li><li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, S7 (2007).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).</li><li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging.">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li><li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae.">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li><li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs.">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li></ol>

. הראנו שיטה לשליטה dynamics ביטוי גנים עם תקופתיות של 2-3 h... סרגל הזמן הזה הוא הרבה יותר קצר מאשר אלה במערכות אחרות המקובלת, כולל מערכת ט'-על מערכת בכוכב המקורי. פרמטרים מרכזיים כדי להגיע בזמן ultradian-המאזניים הם מחצית החיים של צילום-induced מוצרים מולקולרית, mRNAs חלבונים. פרמטרים אלה קינטי עשוי תלויים ?...

תקשורת לתא לשחק תפקידים חיוניים המתבנת עובריים בתהליכים התפתחותיים. ב העוברים בעלי. החוליות, המבנים metameric הנקרא somites נוצרות לאורך הציר הקדמי-אחוריים הגוף עם דיוק טמפורלית מדויק תחת השליטה של שעון זמן, קרא את השעון של פילוח1. במהלך תהליך זה, קבוצה של תאים presomitic והמזודרם (PSM) מעת לעת מומרים somites באופן סינכרוני. תהליך זה דורש ביטוי גנים מתנדנדות מסונכרן ויוצרים תאים PSM נעים בשלב של somites אותו. התקופה של ביטוי גנים מתנדנדות היא בסביבות 2-3 h בעכברים, בערך 30 דקות של דג זברה. הפומבית, PSM התאים מאבדים את2,synchrony3, אך כאשר הם צבורים מחדש, הם יכולים לארגן את עצמי, לשחזר את האוכלוסייה synchrony4, רומז תא-תא צימוד הוא מפתח מסונכרן תנודות.
המאמצים חשף כי מולקולות איתות בשביל חריץ דלתא מחוברים בחוזקה תנודות מסונכרן של גנים שעון פילוח. מעכבי תרופתי או מוטציות גנטיות של חריץ איתות בטל סינכרון האוכלוסייה מתנדים. דג זברה מוטנטים של חריץ איתות רכיבים, כגון DeltaC, DeltaD, Notch1a, להציג תנודות אסינכרוני5,6. עוברי צ'יק או עכבר, לא רק של ליגנד חריץ דלתא-like1 (Dll1), אלא גם הציצית החריץ אפנן המטורף (Lfng) נדרש תנודות מסונכרן7,8,9. עם זאת, זה קשה לבחון את יכולת תפקודית של מולקולות כאלה להעברת מידע דינאמי מתא לתא, כי החלטות הטמפורלי של ההפרעות המקובלת של ג'ין תקנה דינמיקה לא היו מספיק כדי לחקור תהליכים של צירי זמן של 2-3 h (מקצבים ultradian).
לאחרונה פיתחנו שיטה משולבת כדי לשלוט ולפקח ג'ין ביטוי תבניות תאים בתרבית של10. טכנולוגיה זו מאפשרת אינדוקציה של פולסים ביטוי הגן על ידי תאורה אור תקופתיים על פרקי זמן ultradian. פרוטוקול זה מייצג את שיטות ליצור שורות תאים פוטוסנסיטיבית ולבחון תגובות דינמי של הכתב תאים על ידי הפריה חוץ גופית לחיות תאים ניטור בהקשרים של התקשורת לתא. שיטה זו ישימה על הניתוח של רבים אחרים איתות המסלולים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">FACS</td>
			<td style="width:237px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:180px;">FACSAriaII SORP</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iKon M-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-81 ZDC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PMT device</td>
			<td>Churitsu eletric corp.</td>
			<td>CL24B-LIC/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Blue LED illuminator</td>
			<td>OptoCode</td>
			<td>LEDB-SBOXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08459-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td>
			<td>Hi-tech</td>
			<td>303012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>20028-24&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Light meter</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>LI-250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-HA-Peroxidase antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>clone 3F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-Actin-Peroxidase antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>clone 2F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

תאים צריך להגיב כראוי חנותם לסביבות משתנות, אשר מושפעים על ידי גורמים שונים של תאים המקיפים אותם. החריץ איתות הוא אחד כזה מכונות מולקולריות חיוני עבור תקשורת לתא, אשר ממלא את תפקידי המפתח בהתפתחות נורמלית של העוברים. מסלול זה כרוכה לתא העברה של מידע מתנדנדות עם מקצבים ultradian, אך למרות ההתקדמות בטכניקות ביולוגיה מולקולרית, זה מאתגר התירי את ההשפעה של אינטראקציות multicellular על ג'ין מתנדנדות דינמיקה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המאפשר optogenetic בקרה ופיקוח בשידור חי דפוסי ביטוי גנים באופן זמני מדויק. שיטה זו חשף בהצלחה תשומות תקופתיים תאיים, המערכת של חריץ איתות entrain תנודות מהותי על ידי תדר כוונון שלב הסטה ברזולוציה תא בודד. גישה זו ישימה על הניתוח של המאפיינים דינמי של איתות המסלולים השונים, מתן פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות multicellular.

שינינו את בכוכב מערכת11,12, המאפשרת ביטוי גנים צילום-induced בתאי יונקים, במחקר של מתנדים גנטי עם 2 - 3 h תקופתיות. מערכת זו מורכבת משני חלקים: את hGAVPO activator תעתיק צילום-inducible ואת קלטת UAS-יזם כדי לכונן שעתוק של גנים שרירותי של עניין. כדי להאיץ את קינטיק?...

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתח-לתא בהעברת מידע מתנדנדות על ידי שליטה optogenetic ולחיות ניטור של ביטוי גנים. גישה זו מספקת פלטפורמה ייחודית לבחון את משמעות תפקודית של תוכניות ביטוי גנים דינמי במערכות רב תאיים.

שיטת Optogenetic לשלוט ולנתח ג'ין תבניות ביטוי באינטראקציות לתא

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

מדידה במקביל של ביטוי גנים השעון הביולוגי ואת הפרשת הורמון בתרביות תאים ראשוניים אדם

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic mutagenesis אקראי באמצעות היסטון-miniSOG ב<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

ביטוי גנים תא בודד באמצעות Multiplex RT-qPCR לאפיון הטרוגניות של אוכלוסיות הלימפה נדירים

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

לימוד מחזור גנים ביטוי מוסדר על ידי שני פרוטוקולי סינכרון התא

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

מדידת ביטוי גנים בשכבות Aleurone שעורה מופגז עם תפוקה מוגברת

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

שיטה ללמוד את פולימורפיזם C924T של הגן לקולטן של Thromboxane A2

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Ecdysone המבוסס על קולטן מיוחד במינו ג'ין מתג עבור הביטוי מכוון של Transgene עם חוסן, הפיכות Leakiness זניח

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...