Name: an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

Detta arbete stöddes av JST, PRESTO (AI), Core forskning för blickar vetenskap och teknik (JPMJCR12W2 (R.K.)), bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (undervisningsministeriet, kultur, sport, vetenskap och teknik (MEXT), Japan 26119708 (AI) och 16 H 06480 (R.K.)), vetenskapliga forskning (A) (Japan Society för främjande av vetenskap (JSPS) 24240049 (R.K.)), och unga forskare (A) (JSPS 15 H 05326 (AI)), och ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden ”fluorescens Live imaging ”av MEXT, Japan och plattform för dynamiska metoder till Living System från MEXT, Japan.

1. generering av stabil cellinjer av systemet för Tol2
<ol><li>
Transfect plasmid vektorer (figur 1A) av Tol2-baserade optogenetic moduler tillsammans med transposase (Tol2) uttryck vektorn (pCAGGS-mT2TP) i C2C12 celler. I alla steg, kultur celler med DMEM medium kompletteras med 10% fetalt bovint serum (FBS) och penicillin-streptomycin vid 37 ° C (tabell 1), i närvaro av 5% CO2, annars betecknas.
	<ol>
<li>Räkna trypsinized celler med en cell-räknare och p...

<ol>
	<li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation.">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns.">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li><li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock.">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics.">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li><li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock.">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141 (2012).</li><li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li><li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information.">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li><li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, S7 (2007).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).</li><li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging.">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li><li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae.">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li><li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs.">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li></ol>

Vi visade en metod att styra gen uttryck dynamics med en periodicitet på 2 till 3 h. Denna tidsplan är mycket kortare än de i andra konventionella system, inklusive det Tet-On-systemet och den ursprungliga LightOn. Viktiga parametrar att nå ultradian tidsfristerna är halveringstider för foto-inducerad molecular produkter, mRNA och proteiner. Dessa kinetiska parametrar kan bero på celltyper och arter. För trimning kinetik, är ersätter Hes1 3' UTR sekvenser med andra ett okomplicerat sätt, eftersom det inte änd...

Cell-till-cell kommunikation spelar avgörande roller i embryonala mönstring i utvecklingsprocesser. I ryggradsdjur embryon bildas de Metamera strukturer som kallas thoraxsegmenten längs främre-bakre kroppen axeln med en exakt temporal noggrannhet under kontroll av en tidsangivning klocka, kallas segmentering klockan1. Under denna process, en grupp presomitic mesoderm (PSM) celler omvandlas regelbundet till thoraxsegmenten i ett synkront sätt. Denna process omfattar synkroniserade oscillerande genuttryck och PSM celler som svänger i fas bildar de samma thoraxsegmenten. Det oscillerande genuttrycket är cirka 2 till 3 h i möss och ca 30 min i zebrafiskar. När dissocierade, PSM celler förlorar den sömnapparater2,3, men när de är åter samlade, de kan själv ordna och återställa den befolkning synchrony4, tyder på att cell-cell-koppling är en nyckel för den synkroniserade svängningar.
Omfattande insatser avslöjade att signalmolekyler i Delta-Notch väg är tätt anslutna till synkroniserade svängningarna av segmentering klocka generna. Antingen farmakologiska hämmare eller genetiska mutationer av Notch signalering desynchronize befolkningen av oscillatorerna. Mutanter av Notch signalering komponenter, såsom DeltaC, DeltaD och Notch1a, Visa i zebrafiskar, asynkron svängningar5,6. Chick eller mus embryon krävs inte bara Notch liganden Delta-like1 (Dll1) men också den Notch Modulator Lunatic fringe (Lfng) för synkroniserade svängningar7,8,9. Men det har varit svårt att testa den funktionella kapaciteten hos molekylerna för dynamisk informationsöverföring från cell till cell, eftersom temporal resolutioner av konventionella störning av genen förordning dynamics inte var tillräckliga för att undersöka den processer för tidsskalor på 2 – 3 h (ultradian rytmer).
Vi har nyligen utvecklat en integrerad metod för att kontrollera och övervaka gen uttrycksmönster i däggdjursceller10. Denna teknik möjliggör induktion av gen uttryck pulser av periodiska ljus belysning på ultradian tid-skalor. Detta protokoll representerar metoderna att upprätta ljuskänslig cell-linjer och respektera dynamiska svar av reporter cellerna genom live-cell luminiscens övervakning i sammanhang av cell-till-cell kommunikation. Denna metod är tillämplig till analysen av många andra signalvägar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">FACS</td>
			<td style="width:237px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:180px;">FACSAriaII SORP</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iKon M-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-81 ZDC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PMT device</td>
			<td>Churitsu eletric corp.</td>
			<td>CL24B-LIC/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Blue LED illuminator</td>
			<td>OptoCode</td>
			<td>LEDB-SBOXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08459-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td>
			<td>Hi-tech</td>
			<td>303012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>20028-24&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Light meter</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>LI-250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-HA-Peroxidase antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>clone 3F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-Actin-Peroxidase antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>clone 2F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

Cellerna bör svara ordentligt på temporally förändrade miljöer som påverkas av olika faktorer från omgivande celler. Skåran signaling pathway är en av sådan grundläggande molekylära maskineri för cell-till-cell kommunikation som spelar viktiga roller i den normala utvecklingen av embryon. Denna väg innebär en cell till cell överföring av oscillerande information med ultradian rytmer, men trots framsteg i molekylärbiologiska tekniker, det har utmanande för att belysa effekterna av flercelliga interaktioner på oscillerande gen Dynamics. Här presenterar vi ett protokoll som tillåter optogenetic kontroll och live övervakning av genen uttrycksmönster temporal preciserad. Denna metod avslöjade framgångsrikt att intracellulära och intercellulära periodiska ingångar av Notch signalering stiga på tåg inneboende svängningar av frekvensinställning och fas skiftande med encelliga upplösning. Detta synsätt är tillämpligt på analysen av de dynamiska funktionerna i olika signalvägar, som ger en unik plattform för att testa en funktionell betydelse av dynamiska gen uttryck program i flercelliga system.

Vi anpassade den LightOn system11,12, vilket gör att foto-inducerade genuttryck i däggdjursceller, att studera genetiska oscillatorer med 2 - till 3-h periodicitet. Detta system består av två delar: den foto-inducerbara transkriptionell aktivator hGAVPO och ett UAS-promotorn kassett till drive transkription av godtyckliga gener av intresse. För att påskynda den pulserande kineticsen av foto-inducerade genuttryck, ersattes po...

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Här presenterar vi ett protokoll för att analysera cell till cell överföring av oscillerande information av optogenetic kontroll och live övervakning av genuttryck. Detta tillvägagångssätt ger en unik plattform för att testa en funktionell betydelse av dynamiska gen uttryck program i flercelliga system.

En Optogenetic metod för att kontrollera och analysera gen uttrycksmönster i Cell-till-cell interaktioner

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genmanipulation av växtpatogen<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Att studera Svamp biologi och växt mikrobinteraktioner

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Parallell Mätning av dygnsrytm klocka genuttryck och hormon i mänskliga primära cellkulturer

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Slumpmässig mutagenes med användning Histon-miniSOG i<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Encelliga genuttryck Använda Multiplex RT-qPCR att karaktärisera Heterogena Sällsynta Lymfoida populationer

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Encelliga profilering av genuttryck med FACS och qPCR med interna standarder

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Studierande cellcykelreglerade genuttryck av två komplementära cellsynkroniseringsprotokoll

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Provberedning och analys av RNASeq-baserade gen uttryck Data från zebrafisk

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Mäta genuttryck i bombarderade korn Aleurone lager med ökad genomströmning

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

En metod att studera den C924T polymorfism av tromboxan A2 receptorn gen

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

En Ecdysone Receptor-baserade Singular gen omkopplare för avsiktlig uttryck för transgenens med robusthet, reversibilitet och försumbar Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...