Name: an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions
Uploaded: 2018-03-22T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

Bu eser evrimsel bilimi ve teknolojisi (JPMJCR12W2 (yazar)), Grant-in-Aid (Milli Eğitim Bakanlığı, kültür, spor, bilim ve Teknoloji (MEXT), Japonya yenilikçi alanlar üzerinde bilimsel araştırma için JST, PRESTO (AI), çekirdek araştırma tarafından desteklenmiştir 26119708 (yapay zeka) ve 16 H 06480 (yazar)), bilimsel araştırma (A) (Japonya toplum bilim (JSP'ler) 24240049 teşviki (yazar)) ve genç bilim adamları (A) (JSP'ler 15 H 05326 (yapay zeka)) ve yenilikçi alanlarda "floresan bilimsel araştırma için bir Grant-in-Aid Canlı MEXT, Japonya ve Platform için dinamik yaklaşımlar yaşayan için MEXT, Japonya görüntüleme sistemi".

1. nesil istikrarlı hücre hatları ile Tol2 sistemi
<ol><li>
Plazmid vektörel çizimler (şekil 1A) transposase (Tol2) ifade vektör (pCAGGS-mT2TP) ile birlikte optogenetic Tol2 tabanlı modüllerin C2C12 hücrelere transfect. Tüm adımlar, kültür hücreleri % 10 fetal sığır serum (FBS) ve penisilin-streptomisin 37 ° c (tablo 1), aksi takdirde belirtilen % 5 CO2, huzurunda ile takıma DMEM orta ile.
	<ol>
<li>Trypsinized hücreleri hücre sayacı ile v...

<ol>
	<li>Hubaud, A., Pourquie, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signalling+dynamics+in+vertebrate+segmentation.">Signalling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15, 709-721 (2014).</li><li>Maroto, M., Dale, J. K., Dequeant, M. L., Petit, A. C., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronised+cycling+gene+oscillations+in+presomitic+mesoderm+cells+require+cell-cell+contact.">Synchronised cycling gene oscillations in presomitic mesoderm cells require cell-cell contact.</a> Int. J. Dev. Biol. 49, 309-315 (2005).</li><li>Masamizu, Y., Ohtsuka, T., Takashima, Y., Nagahara, H., Takenaka, Y., Yoshikawa, K., Okamura, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+the+somite+segmentation+clock:+revelation+of+unstable+oscillators+in+the+individual+presomitic+mesoderm+cell.">Real-time imaging of the somite segmentation clock: revelation of unstable oscillators in the individual presomitic mesoderm cell.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103, 1313-1318 (2006).</li><li>Tsiairis, C., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Embryonic+Genetic+Oscillators+into+Spatiotemporal+Wave+Patterns.">Self-Organization of Embryonic Genetic Oscillators into Spatiotemporal Wave Patterns.</a> Cell. 164, 656-667 (2016).</li><li>Jiang, Y. J., Aerne, B. L., Smithers, L., Haddon, C., Ish-Horowicz, D., Lewis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+and+the+synchronization+of+the+somite+segmentation+clock.">Notch signalling and the synchronization of the somite segmentation clock.</a> Nature. 408, 475-479 (2000).</li><li>Delaune, E. A., Fran&#231;ois, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell-resolution+imaging+of+the+impact+of+Notch+signaling+and+mitosis+on+segmentation+clock+dynamics.">Single-cell-resolution imaging of the impact of Notch signaling and mitosis on segmentation clock dynamics.</a> Dev. Cell. 23, 995-1005 (2012).</li><li>Dale, J. K., Maroto, M., Dequeant, M. L., Malapert, P., McGrew, M., Pourqui&#233;, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+inhibition+by+Lunatic+Fringe+underlies+the+chick+Segmentation+Clock.">Periodic inhibition by Lunatic Fringe underlies the chick Segmentation Clock.</a> Nature. 421, 275-278 (2003).</li><li>Okubo, Y., Sugawara, T., Abe-Koduka, N., Kanno, J., Kimura, A., Saga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lfng+regulates+the+synchronized+oscillation+of+the+mouse+segmentation+clock+via+trans-repression+of+Notch+signalling.">Lfng regulates the synchronized oscillation of the mouse segmentation clock via trans-repression of Notch signalling.</a> Nat. Commun. 3, 1141 (2012).</li><li>Shimojo, H., Isomura, A., Ohtsuka, T., Kori, H., Miyachi, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+Delta-like1+in+cell+interactions+regulates+dynamic+gene+expression+and+tissue+morphogenesis.">Oscillatory control of Delta-like1 in cell interactions regulates dynamic gene expression and tissue morphogenesis.</a> Genes Dev. 30, 102-116 (2016).</li><li>Isomura, A., Ogushi, F., Kori, H., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+perturbation+and+bioluminescence+imaging+to+analyze+cell-to-cell+transfer+of+oscillatory+information.">Optogenetic perturbation and bioluminescence imaging to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information.</a> Genes Dev. 31, 524-535 (2017).</li><li>Wang, X., Chen, X., Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+control+of+gene+expression+by+a+light-switchable+transgene+system.">Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system.</a> Nat. Meth. 9, 266-269 (2012).</li><li>Imayoshi, I., Isomura, A., Harima, Y., Kawaguchi, K., Kori, H., Miyachi, H., Fujiwara, T. K., Ishidate, F., Kageyama, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oscillatory+control+of+factors+determining+multipotency+and+fate+in+mouse+neural+progenitors.">Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors.</a> Science. 342, 1203-1208 (2013).</li><li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tol2:+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates.">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, S7 (2007).</li><li>Yagita, K., Yamanaka, I., Emoto, N., Kawakami, K., Shimada, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+circadian+clock+oscillations+in+primary+cultures+of+mammalian+cells+using+Tol2+transposon-mediated+gene+transfer+strategy.">Real-time monitoring of circadian clock oscillations in primary cultures of mammalian cells using Tol2 transposon-mediated gene transfer strategy.</a> BMC Biotechnology. 10, 3 (2010).</li><li>Filonov, G. S., Piatkevich, K. D., Ting, L. -. M., Zhang, J., Kim, K., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bright+and+stable+near-infrared+fluorescent+protein+for+in+vivo+imaging.">Bright and stable near-infrared fluorescent protein for in vivo imaging.</a> Nat. Biotechnol. 29, 757-761 (2011).</li><li>Gregor, T., Fujimoto, K., Masaki, N., Sawai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+onset+of+collective+behavior+in+social+amoebae.">The onset of collective behavior in social amoebae.</a> Science. 328, 1021-1025 (2010).</li><li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs.">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160, 381-392 (2015).</li></ol>

Gen ifade dynamics periyodik olarak 2-3 h ile denetlemek için bir yöntem gösterdik. Bu zaman-ölçek Tet tarih sistemi ve özgün aydınlatacağı sistemi de dahil olmak üzere diğer geleneksel sistemleri daha çok kısadır. Ultradian zaman ölçekleri ulaşmak için anahtar parametreleri yarı-hayat moleküler ürünleri fotoğraf kaynaklı, mRNA'ların ve proteinler vardır. Bu kinetik parametrelerin hücre tipleri ve türler üzerinde bağlı olabilir. Dizileri ve hedef proteinlerin işlevlerini değiştirmez Kin...

Hücre hücre iletişim gelişim süreçlerinde embriyonik desenlendirme kritik rol oynamaktadır. Omurgalı embriyo metameric yapıları somites olarak adlandırılan bölümleme saat1adı verilen bir zaman tutma saat kontrol altında kesin bir zamansal doğruluk ile ön-arka gövde ekseni boyunca oluşur. Bu işlem sırasında bir grup presomitic mesoderm (PSM) hücre düzenli olarak dönüştürülür somites zaman uyumlu bir şekilde. Bu işlem eşzamanlı salınım gen ekspresyonu içerir ve aynı somites aşamasında salınım PSM hücreleri oluşturur. Salınım gen ekspresyonu yaklaşık 2-3 h farelerde ve yaklaşık 30 dk içinde Zebra balığı dönemidir. Ayrışmış PSM hücreleri senkronizasyonu2,3kaybetmek, ama yeniden toplanmış oldukları zaman, onlar kendi kendine organize etmek ve nüfus senkronizasyonu4hücre-hücre kaplin eşitlenmiş için bir anahtar olduğunu düşündüren, yeniden elde etmek titreşimler.
Geniş çabaları Delta-çentik yolu sinyal molekülleri segmentasyon genlerine eşitlenmiş salınım için sıkıca bağlandığından emin saptandı. Farmakolojik inhibitörleri veya çentik sinyal, Genetik mutasyonlar osilatörler nüfusu desynchronize. Zebra balığı, DeltaC, DeltaD ve Notch1a, gibi bileşenleri sinyal çentik mutantlar zaman uyumsuz salınımlarını5,6görüntüler. Eşitlenmiş salınımlarını7,8,9için piliç ya da fare embriyo, sadece çentik ligand Delta-like1 (Dll1) aynı zamanda çentik modülatör deli fringe (Lfng) gereklidir. Gen düzenlemesi dinamikler geleneksel pertürbasyon zamansal çözünürlük araştırmak için yeterli değildi çünkü ancak, hücre hücre böyle molekülleri dinamik bilgi aktarımı için fonksiyonel yeteneğini test etmek zor olmuştur zaman ölçeği 2-3 h (ultradian ritimleri) süreçleri.
Biz son zamanlarda kontrol ve monitör gen ifade desenleri memeli hücreleri10entegre bir yöntem geliştirdik. Bu teknoloji, ultradian zaman-ölçeklerde periyodik ışık aydınlatma tarafından gen ifade darbeleri indüksiyon sağlar. Bu iletişim kuralı ışığa duyarlı hücre hatları kurmak ve hücre-hücre iletişim bağlamlarda izleme canlı hücre ışıldama tarafından muhabiri hücre dinamik yanıtlar gözlemlemek için yöntemleri gösterir. Bu yöntem diğer birçok sinyal yolları analiz için geçerlidir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="695">
	<tbody>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:207px;">FACS</td>
			<td style="width:237px;">Becton, Dickinson and Company</td>
			<td style="width:180px;">FACSAriaII SORP</td>
			<td style="width:71px;"></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>iKon M-934</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX-81 ZDC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">PMT device</td>
			<td>Churitsu eletric corp.</td>
			<td>CL24B-LIC/B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Blue LED illuminator</td>
			<td>OptoCode</td>
			<td>LEDB-SBOXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DMEM</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>08459-35&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>26253-84</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>172012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">KRYSTAL24 (black 24 well plate )</td>
			<td>Hi-tech</td>
			<td>303012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">D-Luciferin Potassium Salt</td>
			<td>Nacalai</td>
			<td>20028-24&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Light meter</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>LI-250A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-HA-Peroxidase antibody</td>
			<td>Roche</td>
			<td>clone 3F10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">anti-Actin-Peroxidase antibody</td>
			<td>Wako</td>
			<td>clone 2F3</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an optogenetic method to control and analyze gene expression patterns in cell-to-cell interactions

Hücreleri düzgün geçici hücreleri çevreleyen gelen çeşitli faktörler tarafından etkilenmiştir ortamlar değişen yanıt vermesi. Yol sinyal çentik gibi temel moleküler makine normal embriyo gelişiminde önemli roller oynayan hücre hücre iletişim için biridir. Bu yolu bir hücre hücre transfer ultradian ritimleri ile salınım bilgi içerir, ancak moleküler biyoloji teknikleri ilerlemeye rağmen bu çok hücreli etkileşimler salınım gen üzerinde etkisini aydınlatmak için zor oldu dinamiği. Burada, optogenetic kontrol ve canlı gen ifade şekillerinin kesin bir zamansal biçimde izleme izin veren bir protokol mevcut. Bu yöntem başarıyla çentik sinyal, hücre içi ve hücreler arası periyodik giriş frekans ayarlama ve tek hücreli çözünürlükte değişen faz tarafından iç salınımlar trene binmek ortaya koydu. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlayan çeşitli sinyal yolları dinamik özelliklerini analiz için geçerlidir.

Biz fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu ile 2 - 3 h periodicity genetik osilatörler çalışma memeli hücrelerinde sağlayan aydınlatacağı sistemi11,12, uyarlanmış. Bu sistemi iki bölümden oluşur: fotoğraf-indüklenebilir transkripsiyon harekete geçirmek hGAVPO ve sürücü transkripsiyon ilgi rasgele genlerin için UAS organizatörü kaset. Fotoğraf kaynaklı gen ekspresyonu pulsatil Kinetik hızlandırmak için UAS ...

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions at JoVE.com

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Burada, salınım bilgi hücre hücre aktarımı optogenetic denetimi tarafından analiz ve gen ifadesi izleme yaşamak için bir protokol mevcut. Bu yaklaşım çok hücreli sistemlerinde fonksiyonel önemini dinamik gen ifade programları test etmek için benzersiz bir platform sağlar.

Bir Optogenetic kontrol etmek ve hücre-hücre etkileşimleri gen ifade desenleri analiz yöntemi

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Genetic Manipulation of the Plant Pathogen Ustilago maydis to Study Fungal Biology and Plant Microbe Interactions

Bitki patojeni olarak genetik manipülasyonu<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Mantar Biyoloji ve Bitki Mikrop Etkileşimleri Eğitim için

Gene deletion plays an important role in the analysis of gene function. One of the most efficient methods to disrupt genes in a targeted manner is the ...

Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

İnsan Primer Hücre Kültürleri içinde Sirkadyen Saat Gen İfade ve Hormon salgısını Paralel Ölçümü

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Optogenetic Random Mutagenesis Using Histone-miniSOG in C. elegans

Histon-miniSOG Kullanılan optogenetic rastgele mutagenez<em&gt; C. elegans</em

Forward genetic screening in model organisms is the workhorse to discover functionally important genes and pathways in many biological processes. In most ...

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

Multiplex RT-qPCR kullanarak tek hücreli Gen İfadesi Nadir Lenfoid Populasyonlarının Farklılıkları karakterize etmek

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

Numune hazırlama ve analiz RNASeq tabanlı gen ifadesi verileri Zebra balığı

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

Gen ifadesinin artan işlem hacmi ile alı arpa Aleurone katmanlarında ölçme

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

A Method to Study the C924T Polymorphism of the Thromboxane A2 Receptor Gene

Thromboxane A2 reseptör gen C924T polimorfizmi çalışmak için bir yöntem

The thromboxane A2 receptor (TBXA2R) gene is a member of the G-protein coupled superfamily with seven-transmembrane regions. It is involved in ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Bir Ecdysone reseptör tabanlı tekil Gene anahtarı Transgene sağlamlık, Reversibility ve ihmal edilebilir Leakiness kasıtlı ifade

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...