Name: analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities
Uploaded: 2018-02-02T14:00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities at JoVE.com

F.S. anerkjenner støtte fra Rhenac Green Tec AG gjennom deler av denne studien. JS og bb mottatt finansiering fra DFG (SFB TR175).

Denne protokollen inneholder eksempler på hvordan du analyserer vekst oppførsel av A. thaliana planter.
1. forberedelse
<ol><li>Før du starter, må en smart plan på hvor mange planter vil være nødvendig for å gjøre en pålitelig statistisk analyse av eksperimenter og deretter forberede den riktige mengden potter. Merk: Alltid tillate muligheten for at noen frø ikke kan spire.</li>
	<li>Bruk en klimatiske kammer med ulike individuelt programmerbare LED nivåer for å sammenligne plantevekst under de samme generelle miljømessige forholdene (materialer tabell).</li>
</ol>2. plante vekst og oppsett av LED-lys
<ol><li>Forberede riktig tall (avhengig av ulike forhold og/eller mutanter skal analyseres) 6 x 7 cm potter med jord og plante billene i hver av dem. Merk: I dette tilfellet 36 planter per betingelser ble sådd.</li>
	<li>Vernalize for to dager på 4 ° C.</li>
	<li>Angi relativ luftfuktighet til 65% og temperaturen til 22 ° C/16 ° C for døgnet 16 h / 8 h natt syklus. Justere lys av alle nivåer til en intensitet 200 µM/cm2/s1. Gjør dette ved å angi de respektive verdiene i et program via berøringsskjermen på forsiden av klimatiske kammeret. Sammenligne fire forskjellige kvaliteter satt lysdioder til følgende parametere som er angitt i tabell 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>"sollys"</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Rød og blå (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blå (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: sammensetningen av lys intensiteter slippes ut fra lysdioder
<ol start="4"><li>Overvåke spectral utdataene kontinuerlig, f.eks ved hjelp av en innebygd kalibrert spectrometer.</li>
	<li>Plassere plantene i klimatiske kammer på ulike nivåer og holde dem dekket med en transparent topp før velutviklet cotyledons vises. Kontroller at plantene er tilstrekkelig vannet.</li>
	<li>Skjermen og dokumentet planter av øyet og fotografisk så ofte som hensiktsmessig, avhengig av hvor fort plantene vokser under valgte betingelser, f.eks annenhver dag. Pass på å bruke et stativ for kameraet å sikre lik avstanden mellom kameraet og objekter for alle bilder og dermed aktivere sammenligninger. Bruk en skala bar når det passer. Merk: Begrepet DAS (dager etter såing) refererer til faktiske planting av frø inkludert vernalization.</li>
</ol>3. fastsettelse av PSII avkastning
<ol><li>Bruk en puls-modulert fluorimeter. Konfigurere kameraet hodet på en passende avstand fra anlegget slik at hele blomsten kan sees på live-vinduet.</li>
	<li>Starter programvaren vises en "Velg enhet"-vinduet. "MINI" og deretter "ok". Velg farge "blå" i neste popup-vinduet. Klikk "ok". Merk: Puls-modulert fluorescens måle lys er automatisk slått på. På skjermen vises bildevinduet med parameteren fluorescens Ft. En plante som er plassert under kameraet kan nå sees som oransje.</li>
	<li>Å fokusere på bildet og/eller velge bestemte regioner av anlegget, Bytt til Live Video ved å krysse boksen "live video" og slå justering ring av målet linsen. Avslutt vinduet LIVE Video ved å klikke Avslutt boksen i øvre høyre hjørne.</li>
	<li>For å måle fotosynteseaktiviteten parametere, kan du definere et område av interesse (AOI). Bruk standardinnstillingen for dette, som er en sirkel som automatisk vises i midten av skjermen. Den røde boksen ved siden av representerer gjennomsnitt Ft verdien av alle bildepunkter innenfor AOI. Define den aktuelle AOI ved å velge fra boksen AOI på høyre panel, der ulike former er tilgjengelige. Klikk "Legg til" i kategorien AOI og plasser sirkelen innenfor området blad. Gjenta fem ganger per blad.</li>
	<li>Vedlikeholde innstillingene (kategorien høyre) på standardverdiene som gis av produsenten (tabell 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Meas. lys</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Frekvens</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Handle. Lys</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Bredde</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildekorrigeringsinnstillinger</td>
			<td>MINI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildet transformasjon</td>
			<td>Batteri</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Få</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Demping</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>SAT puls</td>
			<td>Int.</td>
			<td>nei</td>
			<td>Intervall s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Langsom induksjon</td>
			<td>Forsinkelse s</td>
			<td>Klokken s</td>
			<td>Varighet s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>Rød forsterkning</td>
			<td>Rød intensitet</td>
			<td>NIR intensitet</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Skjerm</td>
			<td>Farge</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PS Grense</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Inh. REF. AOI</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FM faktor (sjekke av)</td>
			<td>1,030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: standardinnstillinger for PAM målingene som leveres av produsenten.
<ol start="6"><li>Bruke en mette lyset blinker for å utføre en måling av fotosynteseaktiviteten parametere av fluorescerende slukke analyse (metning puls). Før det, kan du bestemme slukke koeffisientene ved å måle minimal og maksimal fluorescens avkastningen av en dark-adapted plante. Dette plasser anlegget i mørket (f.eks i en skuff eller mørke) i noen minutter. Plasser anlegget under kameraet hodet, sjekk boksene mål og ML (måle lys), i raden nedenfor bildet velger "Sluttverdi/Fm" av klokkes inn i sirkelen og klikk Fo, Fm nederst på skjermen. Merk: For/Fm representerer PSII avkastningen av en dark-adapted. Dermed er det verdien som målingen etter bruk light normaliseres. Gjeldende Fo/Fm måling forblir til ny post aktiveres. Alle F og Fm "verdiene bestemmes av metning pulser gjelder for/Fm og slukke parametere beregnes tilsvarende.</li>
	<li>Finne disse resultatene i rapporten kategorien og Merk alle på høyre side som er relevante for eksperimentet (f.eks. Y(II), qP, qN, etc.).</li>
	<li>Eksportere resultatene til en analyse programvare f.eks. Excel ved å klikke på Eksporter-knappen i øvre venstre hjørne og lagre under riktig filnavn. Generere minst fem AOIs per blad og måle flere blader av samme plante (ikke glem å like mørk tilpasse anlegget igjen etter hver måling), samt flere planter fra én tilstand, som kan deretter statistisk evalueres.</li>
	<li>For statistisk analyse generere mener verdier og standard avvik fra alle AOIs og minst tre uavhengige anlegg for alle tid poeng/forhold og utfører en student t-test evaluere Hvis dataene er betydelig12. Data evalueres som signifikant forskjellig når p-verdiene er under 0,05.</li>
</ol>4. fastsettelse av Stomata
<ol><li>Samle tre fullt utvidet rosett blader fra tre individuelle planter per betingelse til 70% etanol i et glass petri rett og trekke ut klorofyll. Inkuber i denne løsemiddel over natten i romtemperatur eller butikken på 4 ° C.</li>
	<li>For full klarering fra pigmenter, ruge i chloral hydrat løsning (chloral hydrat: vann: glyserol = 8: 2: 1 w/v/w) til blader vises helt hvit.</li>
	<li>Ta differensial forstyrrelser mikroskopi (DIC) bilder av abaxial overflaten på 40 X forstørrelse. Telle stomata i synsfeltet og ekstrapolere ved hjelp av feltet skala til stomata per mm². Gjenta denne fremgangsmåten for minst 4 blader per forhold. Utføre statistisk analyse ved å beregne middelverdien for alle bladene en betingelse og fra dette beregne bety feilen.</li>
</ol>5. fastsettelse av fersk vekt
<ol><li>Fjern alle bladene inkludert petioles fra rosetter fra seks planter per tilstand med et barberblad. Veie alle bladene umiddelbart og underlagt dataene statistiske analyser som beskrevet ovenfor.</li>
</ol>6. fastsettelse av rosett blad
<ol><li>Bruke bilder fra åtte planter per betingelse for å analysere området blad grafisk. Kombinere bilder for ett vilkår i et enkelt bilde og lagre som *.jpeg eller * .tiff.</li>
	<li>Last ned riktig programvare (materialer tabell). Merk: Det er, selvfølgelig, bruke andre programmer i stand til å utføre denne oppgaven.</li>
	<li>Åpne en bildefil. Velg "Frihånd valg." Omslutter blader inkludert petioles av en rosett. Klikk på "Analysere - angi mål" og sjekk "Området," "Min og Max gråtoneverdi," "Integrert tetthet" og "Betyr grå verdi." Velg passende desimal steder, best er to eller tre og klikk "ok."</li>
	<li>For å få mm Bruk2 i stedet for piksler kommandoen "set skala". Bruk lineær markeringsverktøyet for å gjøre en linjevalg som tilsvarer en kjent distanse, f.eks la diameter som er lett å beregne fra skala bar bilder, så åpne dialogboksen Angi skala og oppgi dette bestemt avstand og enhet mål. Så gå tilbake til "analysere" og klikk "tiltak."</li>
	<li>Et nytt vindu vises rett "resultater" som inneholder den relevante data for gjeldende rosette. Gjenta dette med alle planter i bildet og initialisere området mål for hver nye anlegg med Ctrl + M. Merk: For mindre planter med ikke-overlappende blader "wand verktøyet" kan brukes å gjøre prosessen enklere og raskere. Bladene starter dekker hverandre, gir denne verktøyet ikke pålitelige resultater.</li>
	<li>Alternativt, kuttet alle bladene og plassere dem på en måte som en oversikt bilde kan tas og bruker deretter wand verktøyet. Ta hensyn til at når du bruker denne metoden, mer planter er nødvendig.</li>
	<li>Velg "Fil"-"Lagre som" i resultatvinduet og generere en riktig filnavn og en plassering i mappen datamaskin. Filen lagres automatisk i Excel-format.</li>
</ol>7. utarbeidelse av RNA
<ol><li>Høste tre prøvene fra ti individuelle planter for hver tilstand. Pakk ut totalt RNA bruker en plante RNA utvinning utstyr i henhold til produsentens instruksjoner. Finne RNA konsentrasjon, renhet og integritet ved hjelp av en bioanalyzer. RNA kan deretter brukes for nedstrøms programmer som qRT PCR eller gene expression analyse av f.eks RNASeq13.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Tobacco,+Tomato,+Potato,+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System.">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li><li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. , 111-122 (2016).</li><li>Rivero, L., Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis Protocols. , 3-25 (2014).</li><li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Plant+Phenomics:+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks.">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light:+OCCURRENCE,+TIME+COURSE,+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS.">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li><li>Seiler, F., Soll, J., B&#246;lter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light.">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24 (2017).</li><li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana,+Nicotiana+benthamiana,+Glycine+max,+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs.">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).</li><li>Olle, M., Vir&#353;ile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+light-emitting+diode+lighting+on+greenhouse+plant+growth+and+quality.">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).</li><li>Lin, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+red,+blue,+and+white+light-emitting+diodes+on+the+growth,+development,+and+edible+quality+of+hydroponically+grown+lettuce+(Lactuca+sativa+L.+var.+capitata).">The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata).</a> Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).</li><li>Castronuovo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+spectrum+affects+growth+and+gas+exchange+of+common+dandelion+and+purple+coneflower+seedlings.">Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings.</a> International Journal of Plant Biology. , (2016).</li><li>Student, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+PROBABLE+ERROR+OF+A+MEAN.">THE PROBABLE ERROR OF A MEAN.</a> Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Genetics.+RNA-Seq.">Essentials of Genetics. RNA-Seq.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Klermund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LLM-Domain+B-GATA+Transcription+Factors+Promote+Stomatal+Development+Downstream+of+Light+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis+thaliana+Hypocotyls.">LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls.</a> The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).</li><li>Annunziata, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+back+to+nature:+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments.">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li><li>Palus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japan's+Massive+Indoor+Farm+Produces+10,000+Heads+of+Fresh+Lettuce+Every+Day.">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Det første trinnet i å studere plantevekst konfigurerer klimatiske kammeret i henhold til ønsket vilkårene. Dette gjøres enkelt ved å skrive alle variablene i programmet maske av respektive programvaren (figur 1A). På dette trinnet, kan mange endringer implementeres ved å endre lyset regimet og/eller temperatur. Kontroller at du overvåker konstant temperatur, fuktighet og lys (figur 2) hindre teknisk svikt i å ødelegge eksperimentet. Dette er et kritisk punkt for å få reproduserbar resultater. Selv om dette oppsettet tilbyr mange variabler og kan justeres fleksibelt, har sine begrensninger. Tilgjengelig lys kan ikke etterligne sollyset hundre prosent og de klimatiske forholdene i en klimatiske kammer kan aldri helt reflekterer hva som skjer utenfor15.
Sammenlignet med de brukte lysrør LED lys er mer allsidig, trenger mindre energi og vise nesten ingen varme stråling. Disse fordelene har ført den store industrien av innendørs oppdrett å utruste klimatiske kamre og drivhus med lysdioder16. Vurderer store suksesser rapportert i dette feltet LED teknikken vil sikkert finne mange flere programmer.
Når observere fenotypen og spesielt for fastsettelse av blad området er det viktig å ta hensyn forlater som i eldre planter overlapping (Figur 3). Dermed pleier grafisk evaluering av hele rosetter å være upresis. I så fall er det mye mer nøyaktig å kutte av alle bladene og gå derfra.
Vurderingen av vekst atferd og spesielt forskjeller i vekst og utvikling under ulike forhold, avhenger av en tilstrekkelig utvalgsstørrelsen. I denne studien minst seks planter ble brukt for fastsettelse av f.eks fotosynteseaktiviteten avkastning (figur 5), frisk vekt (figur 7), og blad området (figur 8A) men 30 personlige frø ble plantet i begynnelsen av studien å bekrefte at første, nok frø germinate, og andre, et utvalg av "typisk" planter kan gjøres. Selv innenfor samme populasjon, dvs planter i enkelt potter i samme skuffen nøyaktig oppstiller, viste varierende fenotyper. Dette er så selvfølgelig reflektert i standardavviket i statistisk analyse, men tolkningen av data er generelt mer pålitelig når små statistiske feil er observert (figur 8B).
Måling av fotosynteseaktiviteten ytelse av PAM (Figur 4, figur 5) gjøres for flere parametere. I dette tilfellet fokus var på PSII gir Y(II) som et eksempel, men det er mulig å også bestemme f.eks ikke-fotokjemisk slukke, quantum avkastningen regulert og ikke regulert energi ødsling eller lys remisjon. Viktige her er å velge minst fem AOIs per blad jevnt fordelt over blad overflaten og deretter måle minst seks blader fra ulike planter. Ulempen med denne metoden er at eventuelle effekter på PSI ikke kan oppdages; for dette formålet, er annet utstyr nødvendig.

Arabidopsis thaliana har vært modell organismen for plante forskere av molekylære epoken i mer enn to tiår. Flere egenskaper gjør denne lille representant av Brassica familien en ideell kandidat for genetiske og molekylære studier: det har en relativt liten genomet med bare fem kromosomene (i forhold til f.eks Nicotiana tabacum med 24 kromosomer) og dens Genova var helt sekvensert i 20001. A. thaliana kan endres enkelt genetisk Agrobacterium infeksjon2 og er mottakelig for selv de nyeste genetiske verktøyene som CRISPR/Cas3. Men lite er vekstsyklusen rask nok til å gjøre biokjemiske eksperimenter mulig der en høyere mengde materiale er nødvendig. Plantene vokser på agar plater eller jord og kan også være dyrket som flytende kulturer4. Arabidopsis kan dyrkes i klimatisk kontrollert skap, f.eks fra Percival, klimatiske kamre eller i veksthus. For å kunne sammenligne vekst atferd og analysere fenotyper mutanter er det avgjørende å gi reproduserbare og på samme tid fleksibel vekst forhold5. Avhengig av vitenskapelige problemet sendes kan man trenger forskjellige temperaturer og konstant lys, forskjellige lys intensiteter eller forskjellige kvaliteter ved samme temperatur. Light er en svært kritisk parameter i plantevekst og dens innflytelse er ofte studert i ulike tilnærminger6. Reproduserbarhet og sammenlignbarhet innhentet data er det avgjørende å sikre en stabil produksjon og bruke samme type lyskilder.
Vanlige lyskilder i veksthus og klimatiske chambers består av natrium damp eller lysstoffrør, som fremmer tilfredsstillende plantevekst, men har flere ulemper. Først alder de over tid som endrer spectral utdataene ikke bare i intensitet, men kvalitet (egne observasjoner). Imidlertid overvåkes bare intensiteten vanligvis kontinuerlig slik at en endring i lyskvalitet kan ubemerket, men fortsatt har betydelige effekter. Andre begge typer lamper genererer varme ved høyere lys intensiteter, som selv har en dyp fysiologiske påvirker plantevekst og kan maskere eventuelle avhengige lyseffekt. Tredje er spectral produksjon av disse lyskilder uforanderlig og helt ulikt naturlig sollys7. Alle disse ulempene har blitt overvunnet ved lysdioder)8,9,10,11. De har lang levetid med knapt noen endring i utslipp, produserer ikke avfall varme selv ved svært høy lett intensitet og de er svært fleksibel om spectral produksjonen.
Her viser vi hvordan du setter opp en klimatiske kammer med egen LED-lys for rødt, blått og hvitt lys og følge ulike parametere i plantevekst over tid. Vi måler frisk vekt, tropene, stomata tetthet og fotosynteseaktiviteten ytelse. Samtidig viser vi viktigheten av riktig innfatning opp statistiske evalueringer.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Climatic chamber equipped with LED panels</td>
			<td>Rhenac Green Tec AG</td>
			<td></td>
			<td>These chambers are custom made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>OceanOptics</td>
			<td>USB-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PAM</td>
			<td>Walz</td>
			<td>IMAGING-PAM M-Series</td>
			<td>There are several suitable models depending on the broader use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope+ 40x objective</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM1000</td>
			<td>Other companies also produce suitable microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download from website</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Needs an additional computer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities

Anlegget biologer trenger ofte å observere atferden vekst av utvalgte arter. Dette trenger planter konstant miljømessige og stabilt lys betingelser som helst variabel i kvantitet og kvalitet slik at studier under forskjellige installasjoner kan utføres. Disse kravene er oppfylt av klimatiske chambers med utslipp dioder (LED) lyser, som kan-i motsetning til lysstoffrør-være satt til forskjellige bølgelengder. Lysene er energi bevaring og avgir nesten ingen varme selv på lett intensitet, som ofte utgjør et problem med andre lyskilder. Presentert protokollen gir en trinnvis veiledning i hvordan program en klimatiske kammer utstyrt med variabel lys samt beskriver flere metoder for grundig analyse av vekst fenotyper. Avhengig av den eksperimentelle set-up kan ulike egenskapene til de voksende anleggene observert og analyseres. Her beskriver vi fastslå frisk vekt, tropene, fotosynteseaktiviteten aktivitet og øverst tetthet. Vi viser at for å få pålitelige data og gyldige konklusjoner er det obligatorisk å bruke et tilstrekkelig antall personer for statistiske evalueringer. Tar for få planter for denne typen analyseresultater høy statistiske feil og dermed i mindre klart tolkninger av dataene.

Observasjon og analyse av plantevekst og spesielt fenotyper fra mutant planter er avhengige av stabil og reproduserbar miljøforhold. Dette kan angis i klimatiske kamre. Lys kvantitet og særlig kvalitet avhenger kritisk næringsdrivende lyskilden, som i denne studien ble levert av lysdioder.
Figur 1 viser et eksempel på en klimatiske kammer utstyrt med LED-paneler. Figur 1A viser et skjermbilde av kontrollpanelet der alle klimatiske og lys forhold kan justeres. Tjue forskjellige tidsperioder kan settes innen 24 timer. I dette eksemplet har lang dag forhold med 16 lys/8 h mørke blitt programmert. Dette kammeret har fire nivåer som kan programmeres separat slik at plantevekst på fire forskjellige lys innstillinger kan studeres under nøyaktig de samme miljøforholdene. Øvre venstre nivå er satt til en spektral utgang mimicking sollyset som teknisk mulig, de øvre høyre nivå representerer hevet røde (660 nm) og blått lys (440 nm) med redusert hvitt lys (3K). Venstre lavere nivå ble satt til opphøyet blått lys og lavere rett til hovedsakelig rødt lys. Figur 1B illustrerer lysdioder på de forskjellige innstillingene som en oversikt (midten panel) og de respektive zoom-ins (ytre små paneler). Forskjellen i kvaliteter kan lett sees av øyet.
En innebygd spectrometer stadig måler, overvåker, og justerer spectral utdataene. Figur 2 viser spekteret fra øvre venstre nivå 1.1, som ble satt til å etterligne sollys. Sammenlignet med en standard fluorescent lyset blomsterløk er delen av UV og blått lys mye høyere7.
I Figur 3 et eksempel på A. thaliana planter fra alle fire betingelsene 10, 13 og 17 dager, henholdsvis etter såing er avbildet. Alle planter ble fotografert fra samme avstand ved å montere kameraet på et stativ. Baren skala representerer 1 cm. Etter 10 dager, ikke mye forskjell i størrelse eller farge kan skjelnes, men etter 17 dager en raskere vekst under rødt lys er åpenbart. I tillegg til dette visuell analyse, ble flere fysiologiske analyser utført.
Figur 4 følger de ulike trinnene av PAM målinger, som analyserer f.eks fotosynteseaktiviteten kapasitet. I figur 4A vises et skjermbilde av videoen, som er innstillingen for å bringe anlegget i fokus å sikre optimal kvalitet av målinger. I stedet for hele anlegget, kan du også velge et enkelt blad å analysere. Figur 4B viser gjeldende fluorescerende avkastningen Ft av en dark-adapted før den faktiske målingen ble startet. I dette tilfellet ble fem sirkulær interesseområder (AOIs) valgt. Tallene i boksene røde ved hver AOI gir direkte numeriske resultatet, som kan lagres i form av en tabell. For å starte en måling av fotosynteseaktiviteten parametere for, må Fm angi. Et skjermbilde av Ft etter dette er avbildet i figur 4C. Merk at nå knappen "Fo, Fm" ikke er aktiv lenger. For å starte et nytt mål, må "Ny post" klikkes for å slette forrige normalisering. Til slutt, viser Figur 4 d effektiv PSII quantum avkastningen Y(II) etter å gi et mette lys pulsen ("SAT-Pulse"). Kvantifisering av eksemplarisk data er vist i figur 5. Planter som vokser under sollys på 200 µM/cm2/s1 (figur 5A) ble analysert 12, 21 og 28 dager etter såing, henholdsvis. Våre data viser at PSII avkastning er betydelig høyere i blader fra planter dyrket i tre uker enn i 12 dager. Forskjellen mellom 28 og 12 dager er fortsatt betydelig, men den p-verdien er høyere. Figur 4Bble PSII avkastning fra planter dyrket for to uker fra forskjellige kvaliteter sammenlignet. Interessant, fører permanente vekst under lys som inneholder en høy del av blått lys til en betydelig større avkastning på PSII. En lignende effekt ble observert for planter dyrket under beriket rødt lys, men økningen var litt lavere.
Ulike kvaliteter ble vist effekt stomata utvikling14. Derfor ble øverst tetthet undersøkt. Figur 6 viser hvordan et blad etter pigment utvinning ser ut. Epidermal enkeltceller kan også skilles, og stomi lett kan telles. I figur, er personlige stomata angitt med en stjerne. Detaljerte data om øverst tettheten av planter fra ulike lys innstillinger kan finnes andre steder9.
I tillegg til visuell inspeksjon (Figur 3) gir frisk vekten et godt mål på vekst fremdriften. I dette eksemplet ble blader fra planter dyrket under "sollys" etter 8, 10 og 12 dager etter såing, henholdsvis veid. Statistiske evalueringer av disse dataene kan ses i figur 7. Som forventet, øker frisk vekten med tiden.
Foruten frisk vekt er blad området et godt mål for vekst. Her, ble plante utvikling fulgt fra 10, 13 og 17 dager etter såing (figur 8A). Minst seks individuelle planter ble rutinemessig vurdert for å få pålitelige statistiske data. For å demonstrere viktigheten av en høy utvalgsstørrelsen, prosentandel feil middelverdien, fra analysere to og seks planter, henholdsvis ble beregnet (figur 8B). Det betyr at andelen standardavviket med hensyn til middelverdien ble bestemt. Det er veldig klart at i en liten utvalgsstørrelsen feilen er 5-10% høyere enn ved en høyere utvalgsstørrelsen. Ved å øke antall anlegg som vurderes, kan feilen minimeres, og som gjør tolkningen av dataene mye klarere.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> Figur 1: forskjellige kvaliteter er levert av lysdioder. A) skjermbilde fra kontrollpanelet på LED kammeret. Dagens lengde er satt til 16 h (øverst til høyre) og lysintensiteten er satt til 200 µmol cm-2 s-1. Lys kvaliteten er forskjellige på alle fire nivåer: 1.1 representerer et spekter som ligner på sollyset som teknisk mulig, 1.2 representerer en høy andel av røde og blå bølgelengder (RB) lys, 2.1 ligger hovedsakelig til blå (B) 2.2 representerer hovedsakelig rød lys (R). B) i midtre panelet viser en oversikt over alle nivåer; ytre panelene viser individuelle nivåer i en høyere zoom. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> Figur 2: bølgelengde spekteret fra simulert sollys innstillinger. Et skjermbilde fra den innebygde spectrometer i LED kammeret er vist, som var plassert på nivå 1.1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> Figur 3: plante utvikling over en uke. Representant A. thaliana planter fra alle fire lysforhold fra 10, 13 og 17 DAS. Planter ble fotografert med en digital refleks kameraet på et stativ. Skala linjen representerer 1 cm for alle bilder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> Figur 4: Skjermbilder fra representant trinnene av PAM målinger av A. thaliana . A) skjermbilde fra visningen "Live video" der bildet fokus kan justeres. B) gjeldende fluorescens avkastning Ft før påføring av noen lyspulser. C) gjeldende fluorescens avkastning Ft etter innstillingen for/Fm. D) påvirker PSII quantum avkastning etter et mette lys pulsen. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> Figur 5: grafisk representasjon av påvirker PSII quantum avkastning (YII). A) Data fra planter 12, 21 og 28 dager etter såing og dyrket under 200 µmol/cm2/s1 under simulert sollys ("sollys") utsatt for PAM analyse var statistisk vurdert. Vises mener verdiene av fem planter og fem AOIs per dag. En stjerne angir en betydelig forskjell med p-verdien < 0,05 sammenlignet med dag 12, og to stjernene indikerer svært betydelige forskjeller med p-verdien < 0,02 alt etter elevenes t-test. B) Data fra planter dyrket på 200 µmol/cm 2/s1 under simulert sollys (SL), beriket blå (B) eller rød (R) lys, henholdsvis var statistisk evalueres. Vises mener verdiene av fem planter og fem AOIs per dag. Betydelige forskjeller ble beregnet i forhold til "sollys."
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> Figur 6: representativt bilde av stomata på abaxial side av en A. thaliana blad. Blader forberedt som beskrevet ovenfor og visuelt ble analysert under lys mikroskop med DIC innstillinger på 40 X forstørrelse. Stomata regnes i det synlige området i minst 4 forlater per betingelse. Bildet er tatt med et digitalt kamera koblet til mikroskopet tubus. Antall stomata per mm² beregnes med hjelp av baren skala. Stjernene angir en enkelt stomi. Baren skala representerer 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> Figur 7: grafisk representasjon av fersk vekt fra A. thaliana planter dyrket på simulert sollys/200 µmol/cm2/s1. Rosett blader ble kuttet fra planter åtte, ti, og tolv dager etter sår. Mean verdier i mg fra seks planter per dag er avbildet. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> Figur 8: Statistiske evalueringer av A. thaliana blad området fra planter dyrket under forskjellige lysforhold. A) blad området fra A. thaliana vokst for 10, 13 og 17 dager identifiserte grafisk med ImageJ og data fra n = 6 planter ble statistisk vurdert. Området blad fra alle seks rosetter fra hver betingelse var oppsummerte og delt av seks å få middelverdien. Med denne verdien, standardavviket ble beregnet og er dette representert ved feilfeltene. B) tropene identifiserte grafisk med ImageJ og data fra enten n = 2 eller n = 6 planter, henholdsvis ble statistisk analysert som panelet A. Så ble feilen i prosent av middelverdien beregnet og avbildet grafisk. Viser grønne stolper prosent feilen analyse av n = 6, blå stolper fra n = 2 planter. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities at JoVE.com

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Her presenterer vi en protokoll for å studere anlegget vekst atferd og spesielt fenotyper i en reproduserbar måte. Viser vi hvordan du gir variabel og på samme tid stabil lysforholdene. Riktig analyser, avhenger av tilstrekkelig utvalg tall og gyldige statistiske evalueringer.

Analyse av Arabidopsis thaliana vekst atferd i ulike lys kvaliteter

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolsk Merking og Membran Fraksjone for komparativ proteomikk analyser av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Suspension cellekulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Farging av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundær Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Kvantitativ analyse av Aspergillus nidulans vekstrate ved hjelp av live mikroskopi og programvare med åpen kildekode

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells (Video) | JoVE 

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

An Improved Method to Measure Pollen Hydration Profiles in Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

En høyoppløselig, enkeltkornet, in vivo pollenhydreringsbioassay for Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Growth of Arabidopsis thaliana Plants and Preparation of Flowers for Pollen Hydration Assay

Growth of Arabidopsis thaliana Plants and Preparation of Flowers for Pollen Hydration Assay  (Video) | JoVE 

Vekst av Arabidopsis thaliana planter og forberedelse av blomster for pollenhydreringsanalyse

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition and its Measurements

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition and its Measurements (Video) | JoVE 

Pollenhydreringsanalyse i Arabidopsis thaliana: Rådatainnsamling og dens målinger

﻿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

ï»¿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

Fremstilling av dobbeltfarget F1 transgen arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  (Video) | JoVE 

Farmakologisk analyse av dobbeltfarget F1 transgen arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  (Video) | JoVE 

Prøvepreparering og konfokal avbildning av dobbeltfarget F1 transgen arabidopsis thaliana