Name: analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities
Uploaded: 2018-02-02T14:00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities at JoVE.com

F.S. erkänner stöd från Rhenac Green Tec AG genom delar av denna studie. J.S. och B.B. fick finansiering från DFGEN (SFB TR175).

Detta protokoll innehåller några exempel på hur att analysera tillväxt beteende av A. thaliana växter.
1. beredning
<ol><li>Innan du börjar, gör en noggrann plan på hur många växter kommer att behövas för att göra en tillförlitlig statistisk analys av experimenten och sedan förbereda lämpligt belopp av krukor. Obs: Tillåt alltid för möjligheten att vissa frön inte kan gror.</li>
	<li>Använd en klimatkammare med olika individuellt programmerbar LED för att jämföra växternas tillväxt under samma allmänna miljöförhållanden (material tabell).</li>
</ol>2. växternas tillväxt och installation av LED-lampor
<ol><li>Förbereda lämpligt antal (beroende på olika villkor och/eller mutanter analyseras) 6 x 7 cm krukor med jord och plantera ett frö i varje. Obs: I det här fallet 36 plantor per villkor såddes.</li>
	<li>Vernalize för två dagar vid 4 ° C.</li>
	<li>Ställ in den relativa luftfuktigheten på 65% och temperaturen till 22 ° C/16 ° C för dygnet 16 h / 8 h natt cykel. Justera ljuset på alla nivåer till en stödnivå på 200 µM/cm2/s1. Gör detta genom att ingå ett program respektive värden via pekskärmen på framsidan av klimatkammare. För att jämföra fyra olika ljus kvaliteter ställa lysdioderna till följande parametrar som anges i tabell 1.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Identifyier</td>
			<td>395 nm [%]</td>
			<td>440 nm [%]</td>
			<td>3 K [%]</td>
			<td>660 nm [%]</td>
			<td>770 nm [%]</td>
		</tr>
<tr>
<td>”solljus”</td>
			<td>100</td>
			<td>11</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Röd och blå (RB)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
<tr>
<td>Blå (B)</td>
			<td>100</td>
			<td>15</td>
			<td>25</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Red (R)</td>
			<td>90</td>
			<td>2</td>
			<td>25</td>
			<td>10</td>
			<td>100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: sammansättning av ljus stödnivåer som avges från lysdioder
<ol start="4"><li>Övervaka spektrala utdata kontinuerligt, t.ex. med hjälp av en inbyggd kalibrerad spektrometer.</li>
	<li>Placera växterna i klimatkammare på de olika nivåerna och hålla dem täckt med en genomskinlig topp tills välutvecklade hjärtbladen är synliga. Se till att växterna är tillräckligt vattnas.</li>
	<li>Övervaka och dokument växter av ögat och fotografiskt så ofta som lämpliga, beroende på hur snabbt växterna växer på valda villkor, t.ex. varannan dag. Se till att använda ett stativ för kameran att säkerställa lika avståndet mellan kameran och objekt för alla bilder och därmed möjliggöra jämförelser. Använd en skala bar när så är lämpligt. Anmärkning: Termen DAS (dagar efter sådd) avser faktiska plantering av fröna inklusive vernalization.</li>
</ol>3. bestämning av PSII avkastning
<ol><li>Använd en puls-modulerat fluorimeter. Ställa in kamerahuvudet på ett lämpligt avstånd från anläggningen så att komplett rosetten kan ses på fönstret live.</li>
	<li>Vid start programvaran visas ett ”Välj enhet” fönster. Markera ”MINI” och sedan ”ok”. Välja färg ”blå” i nästa popup-fönster. Klicka ”ok”. Obs: Puls-modulerat fluorescensen mäta ljuset slås automatiskt på. På skärmen visas fönstret bild visar parametern fluorescens Ft. En växt som placeras under kameran kan nu ses som en orange bild.</li>
	<li>För att fokusera bilden och/eller välja specifika regioner av anläggningen, växla till Live Video genom att kryssa i rutan ”live video” och vrid justeringsringen som av objektivet. Stäng fönstret LIVE Video genom att klicka på rutan exit i det övre högra hörnet.</li>
	<li>För att mäta fotosyntetiska parametrar, definiera ett område av intresse (AOI). Använd standardinställningen för detta, som är en cirkel som automatiskt visas i mitten av skärmen. Den röda rutan bredvid det motsvarar i genomsnitt Ft värdet av alla pixlar inom AOI. Definiera den lämpliga AOI genom att välja från rutan AOI på den högra panelen, där olika former finns. Klicka på ”Lägg till” på fliken AOI och placera cirkla inom området blad. Upprepa fem gånger per blad.</li>
	<li>Underhåll inställningar (fliken längst till höger) på de standardvärden som tillhandahålls av tillverkaren (tabell 2).</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Basenhet ljus</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Frekvens</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Agera. Ljus</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Bredd</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildkorrigeringar</td>
			<td>MINI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Bildtransformering</td>
			<td>Batteri</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>16.7V</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Vinst</td>
			<td>5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Dämpning</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Lör puls</td>
			<td>Int.</td>
			<td>Nej</td>
			<td>Intervallet s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>8</td>
			<td>1</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>Långsam induktion</td>
			<td>Fördröjning s</td>
			<td>Klockan s</td>
			<td>Längd s</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>40</td>
			<td>20</td>
			<td>315</td>
		</tr>
<tr>
<td>Absortivity</td>
			<td>Röd ökning</td>
			<td>Röd intensitet</td>
			<td>NIR intensitet</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>340</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
<tr>
<td>Displayen</td>
			<td>Färg</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PS Gräns</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>INH. Ref. AOI</td>
			<td>1</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>FM-faktor (tickande)</td>
			<td>1 030</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 2: standardinställningar för PAM mätningarna som anges av tillverkaren.
<ol start="6"><li>Applicera en mättar ljus blixt för att utföra en mätning av fotosyntetiska parametrar av fluorescerande kylning analys (mättnad puls). Dessförinnan, fastställa de släcka koefficienterna genom att mäta minimal och maximal fluorescens avkastningen av en stjärnkartsschema växt. I detta syfte att placera anläggningen i mörkret (t.ex. i en låda eller mörk ruta) för några min. Sedan placera anläggningen under kamerahuvudet, markera rutorna åtgärd och ML (mäta ljus), på raden nedan bilden välja ”Fv/Fm” vid klocka in i cirkeln och klicka på Fo, Fm längst ned på skärmen. Notera: Fo/Fm representerar PSII avkastningen av en stjärnkartsschema växt. Därför är det värdet som mätningen efter applicering ljus är normaliserat. Den nuvarande Fo/Fm mätningen förblir tills ny post aktiveras. Alla F och Fm' värden som bestäms av mättnad pulser är relaterade till Fo/Fm och släcka parametrar beräknas med detta.</li>
	<li>Hitta dessa resultat i fliken rapport och markera alla rutorna på höger sida som är relevanta för experimentet (t.ex. Y(II), qP, qN, etc.).</li>
	<li>Exportera resultaten till en analys programvara t.ex. Excel genom att klicka på knappen Exportera i det övre vänstra hörnet och spara under ett lämpligt filnamn. Generera minst fem AOI per blad och mäta flera blad av samma planta (Glöm inte att kort mörk anpassa anläggningen igen efter varje mätning), samt flera växter från en villkora, som kan sedan statistiskt utvärderas.</li>
	<li>För statistisk analys generera medelvärden och standardavvikelser från alla AOI och minst tre oberoende växter för alla tid punkter/villkor och utföra en students t-test för att bedöma om uppgifterna är betydande12. Data utvärderas som väsentligt annorlunda när de p-värdena under 0.05.</li>
</ol>4. bestämning av Stomata densitet
<ol><li>Samla tre fullt-utökade rosett blad från tre enskilda plantor per tillstånd till 70% etanol i en glas petriskål och extrahera klorofyllet. Inkubera i detta lösningsmedel över natten vid rumstemperatur eller förvaras vid 4 ° C.</li>
	<li>För full clearance från pigment, inkubera i chloral hydrat lösning (chloral hydrat: vatten: glycerol = 8: 2: 1 w/v/w) tills bladen visas helt vit.</li>
	<li>Ta differentiell störningar mikroskopi (DIC) bilder av abaxial yta på 40 X förstoring. Räkna stomata i synfältet och extrapolera med hjälp av skalstapeln till stomata per mm². Upprepa proceduren för minst 4 lämnar per villkor. Utföra statistiska analyser genom att beräkna medelvärdet för alla blad av en villkora och från detta beräkna medelfelet.</li>
</ol>5. fastställande av färsk vikt
<ol><li>Ta bort alla blad inklusive bladskaft från rosetter från sex plantor per skick med ett rakblad. Väger alla blad omedelbart och föremål data för statistiska analyser som beskrivs ovan.</li>
</ol>6. bestämning av rosett Leaf område
<ol><li>Använd bilder från åtta plantor per tillstånd för att analysera området leaf grafiskt. Kombinera bilder för ett villkor i en enda bild och Spara som *.jpeg eller * .tiff.</li>
	<li>Ladda ner lämplig programvara (material tabell). Obs: Det är naturligtvis möjligt att tillämpa något annat program som kan utföra denna uppgift.</li>
	<li>Öppna en bildfil. Välj verktyget ”free hand urval”. Omringa blad inklusive bladskaft av en rosett. Klicka på ”Analyze - set mätningar” och kolla ”område”, ”Min & Max grå värde”, ”integrerad täthet” och ”grå medelvärdet”. Välj lämpligt decimal förlägger, bäst är två eller tre och klicka ”ok”.</li>
	<li>För att få mm Använd2 istället för pixlar kommandot ”set skala”. Tillämpa linjär markeringsverktyget för att göra en linjeval som motsvarar en uppmätt sträcka, t.ex. lämna diametern som är lätt att beräkna från skalstapeln i bilderna, och sedan öppna dialogrutan Ange skala och ange denna definierade avstånd och enheten för mätning. Gå sedan tillbaka till ”analysera” och klicka på ”åtgärd”.</li>
	<li>Ett nytt fönster visas rubriken ”resultat” som innehåller relevanta data för den aktuella rosetten. Upprepa proceduren med alla växter i bilden och initiera område mätningar för varje ny växt med Ctrl + M. Obs: För mindre växter med icke-överlappande blad verktyget ”trollspö” kan användas för att göra processen enklare och snabbare. Så snart bladen börjar täcker varandra, ger detta verktyg inte tillförlitliga resultat.</li>
	<li>Alternativt skär av alla bladen och placera dem på ett sätt att en översiktsbilden kan tas och sedan använda verktyget Trollstav. Beakta att när du använder denna metod, behövs fler växter.</li>
	<li>Välj ”fil”-”Spara som” i fönstret sökresultat och generera ett lämpligt filnamn och en plats i katalogen dator. Filen sparas automatiskt i Excel-format.</li>
</ol>7. förberedelse av RNA
<ol><li>Skörda tre prover från tio enskilda växter för varje villkor. Extrahera total-RNA med hjälp av en växt RNA extraktion kit enligt tillverkarens anvisningar. Bestämma RNA koncentration, renhet och integritet med hjälp av en bioanalyzer. RNA kan sedan användas för nedströms applikationer såsom qRT-PCR eller gen uttryck analys av e.g. RNASeq13.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana.">Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>An, G., Watson, B. D., Chiang, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transformation+of+Tobacco,+Tomato,+Potato,+and+Arabidopsis+thaliana+Using+a+Binary+Ti+Vector+System.">Transformation of Tobacco, Tomato, Potato, and Arabidopsis thaliana Using a Binary Ti Vector System.</a> Plant Physiology. 81 (1), 301-305 (1986).</li><li>Schiml, S., Fauser, F., Puchta, H., Murata, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chromosome and Genomic Engineering in Plants: Methods and Protocols. , 111-122 (2016).</li><li>Rivero, L., Sanchez-Serrano, J. J., Salinas, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis Protocols. , 3-25 (2014).</li><li>Ubbens, J. R., Stavness, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+Plant+Phenomics:+A+Deep+Learning+Platform+for+Complex+Plant+Phenotyping+Tasks.">Deep Plant Phenomics: A Deep Learning Platform for Complex Plant Phenotyping Tasks.</a> Frontiers in Plant Science. 8 (1190), (2017).</li><li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Suppression+of+Growth+by+Blue+Light:+OCCURRENCE,+TIME+COURSE,+AND+GENERAL+CHARACTERISTICS.">Rapid Suppression of Growth by Blue Light: OCCURRENCE, TIME COURSE, AND GENERAL CHARACTERISTICS.</a> Plant Physiology. 67 (3), 584-590 (1981).</li><li>Seiler, F., Soll, J., B&#246;lter, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+Phenotypical+and+Molecular+Analyses+of+Arabidopsis+Grown+under+Fluorescent+and+LED+Light.">Comparative Phenotypical and Molecular Analyses of Arabidopsis Grown under Fluorescent and LED Light.</a> Plants. 6 (2), 24 (2017).</li><li>Janda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+stress+response+in+Arabidopsis+thaliana,+Nicotiana+benthamiana,+Glycine+max,+Solanum+tuberosum+and+Brassica+napus+cultivated+under+polychromatic+LEDs.">Growth and stress response in Arabidopsis thaliana, Nicotiana benthamiana, Glycine max, Solanum tuberosum and Brassica napus cultivated under polychromatic LEDs.</a> Plant Methods. 11 (1), 31 (2015).</li><li>Olle, M., Vir&#353;ile, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+light-emitting+diode+lighting+on+greenhouse+plant+growth+and+quality.">The effects of light-emitting diode lighting on greenhouse plant growth and quality.</a> Agricultural and food science. 22 (2), 12 (2013).</li><li>Lin, K. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+red,+blue,+and+white+light-emitting+diodes+on+the+growth,+development,+and+edible+quality+of+hydroponically+grown+lettuce+(Lactuca+sativa+L.+var.+capitata).">The effects of red, blue, and white light-emitting diodes on the growth, development, and edible quality of hydroponically grown lettuce (Lactuca sativa L. var. capitata).</a> Scientia Horticulturae. 150, 86-91 (2013).</li><li>Castronuovo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+spectrum+affects+growth+and+gas+exchange+of+common+dandelion+and+purple+coneflower+seedlings.">Light spectrum affects growth and gas exchange of common dandelion and purple coneflower seedlings.</a> International Journal of Plant Biology. , (2016).</li><li>Student, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=THE+PROBABLE+ERROR+OF+A+MEAN.">THE PROBABLE ERROR OF A MEAN.</a> Biometrika. 6 (1), 1-25 (1908).</li><li>Database, J. S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essentials+of+Genetics.+RNA-Seq.">Essentials of Genetics. RNA-Seq.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Klermund, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LLM-Domain+B-GATA+Transcription+Factors+Promote+Stomatal+Development+Downstream+of+Light+Signaling+Pathways+in+Arabidopsis+thaliana+Hypocotyls.">LLM-Domain B-GATA Transcription Factors Promote Stomatal Development Downstream of Light Signaling Pathways in Arabidopsis thaliana Hypocotyls.</a> The Plant Cell. 28 (3), 646-660 (2016).</li><li>Annunziata, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+back+to+nature:+a+reality+check+for+experiments+in+controlled+environments.">Getting back to nature: a reality check for experiments in controlled environments.</a> J Exp Bot. 68 (16), 4463-4477 (2017).</li><li>Palus, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Japan's+Massive+Indoor+Farm+Produces+10,000+Heads+of+Fresh+Lettuce+Every+Day.">Japan's Massive Indoor Farm Produces 10,000 Heads of Fresh Lettuce Every Day.</a> Smithonian.com. , (2014).</li></ol>

Författarna har något att avslöja.

Det första steget i att studera växternas tillväxt är att inrätta klimatkammare enligt de önska villkor. Detta görs enkelt genom att skriva in alla variabler i programmet masken av respektive programvaran (figur 1A). I detta steg, kan många ändringar implementeras genom att ändra den lättreglering eller temperatur. Se till att ständigt övervaka temperatur, luftfuktighet och ljusförhållanden (figur 2) för att förhindra tekniskt fel från förstör experimentet. Detta är en kritisk punkt för att erhålla reproducerbara resultat. Även detta upplägg erbjuder många variabler och kan anpassas flexibelt, har den sina begränsningar. För närvarande finns LED-lampor kan inte härma solljuset hundra procent och klimatförhållandena inuti en klimatkammare kan aldrig helt återspeglar vad som händer utanför15.
Jämfört med den utbredda lysrör LED lampor är mer mångsidig, behöver mindre energi och Visa praktiskt taget ingen värmestrålning. Dessa fördelar har lett stora industrin för inomhus odling för att utrusta climatic chambers och växthus med lysdioder16. Med tanke på de enorma framgångarna rapporterade i det här fältet LED tekniken hittar säkert många fler tillämpningar.
När observerar fenotypen och särskilt för bestämning av leaf området är det viktigt att ta hänsyn till lämnar som i äldre anläggningar överlappningen (figur 3). Således, grafisk utvärdering av hela rosetter tenderar att vara oprecisa. I så fall är det mycket mer exakt att skära av alla bladen och gå därifrån.
Utvärdering av tillväxt beteende och särskilt skillnader i tillväxt och utveckling under olika förhållanden är beroende av en tillräcklig urvalsstorlek. I denna studie, minst sex växter användes för bestämning av t ex photosynthetic kapacitet (figur 5), färsk vikt (figur 7), och blad området (figur 8A) men 30 enskilda frön planterades i början av studien för att säkerställa att första, tillräckliga fröna gror, och för det andra, ett val av ”typiska” växter kan göras. Även inom samma population, dvs växter i enda krukor i samma fack på exakt samma villkor, visade varierande fenotyper. Detta då naturligtvis återspeglas i standardavvikelsen under statistisk analys, men tolkningen av data är i allmänhet mer tillförlitliga när små statistiska fel observeras (figur 8B).
Mätning av fotosyntetiska prestanda av PAM (figur 4, figur 5) kan göras för flera parametrar. I detta fall fokus var på PSII avkastning Y(II) som exempel men det är möjligt att också fastställa t.ex. icke-fotokemiska snabbkylning, quantum avkastningen av reglerade och icke-reglerade energiupptagning eller ljus eftergift. Viktigt här är att välja minst fem AOI per blad jämnt fördelad över den blad-ytan och sedan mäta minst sex blad från olika växter. Nackdelen med denna metod är att eventuella effekter på PSI inte kan upptäckas; för detta ändamål, som olika utrustning behövs.

Arabidopsis thaliana har varit modell organismen för växt forskare av den molekylära eraen för mer än två decennier. Flera egenskaper gör denna lilla representativt av Brassica familjen en idealisk kandidat för genetiska och molekylära studier: den har en relativt liten genomet med endast fem kromosomer (jämfört med t.ex. Nicotiana tabacum med 24 kromosomer) och dess genomet sekvenserades helt i 20001. A. thaliana kan vara enkelt genetiskt modifierade av Agrobacterium infektion2 och är mottagliga för även de senaste genetiska verktyg såsom CRISPR Cas3. Även om små, är tillväxtcykeln snabb nog att göra biokemiska experiment genomförbart där en högre mängd material behövs. Växterna växa på agarplattor eller på marken och kan även odlas som flytande kulturer4. Arabidopsis kan odlas i climatically kontrollerade skåp, e.g. från Percival, climatic kammare eller i växthus. För att kunna jämföra tillväxt beteende och analysera fenotyper av mutants är det viktigt att ge reproducerbara och på samma tid flexibel tillväxt villkor5. Man kan behöva olika temperaturer och konstant ljusförhållanden, skiftande ljus intensitet eller olika ljus kvaliteter vid samma temperatur beroende på den vetenskapliga problem som ska åtgärdas. Ljus är en mycket kritisk parameter i växternas tillväxt och dess inflytande är ofta studerade i olika strategier6. För att säkerställa reproducerbarhet och jämförbarheten av uppgifterna är det viktigt att säkerställa en stabil och tillämpa samma typ av ljuskällor.
De vanliga ljuskällorna i växthus och climatic kammare består av natrium vapor eller lysrör, som främjar tillfredsställande växternas tillväxt men har flera nackdelar. Först, de åldras över tiden som ändrar spektrala produktionen inte bara i intensitet men i kvalitet (egna observationer). Dock är oftast bara intensiteten övervakas kontinuerligt så att en förändring i ljuskvalitet kan gå obemärkt förbi men fortfarande har betydande effekter. För det andra, båda typerna av lampor genererar värme högre ljus stödnivåer, som själv har en djupgående fysiologisk inverkan på växternas tillväxt och kan maskera eventuella beroende ljuseffekt. Tredje, spektrala produktionen av dessa ljuskällor är oföränderlig och helt olik naturligt solljus7. Alla dessa nackdelar har övervunnits vid lysdioder)8,9,10,11. De har lång livslängd med knappt någon förändring i utsläpp, inte producerar avfall värme även vid mycket hög ljus intensitet och de är mycket flexibla angående deras spektrala produktion.
Här visar vi hur du ställer in en klimatkammare med separat LED lampor för rött, blått och vitt ljus och följa olika parametrar för växternas tillväxt över tiden. Vi mäter färsk vikt, leaf område, stomata densitet och fotosyntetiska prestanda. Samtidigt visar vi vikten av korrekt ställa in statistiska utvärderingar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Climatic chamber equipped with LED panels</td>
			<td>Rhenac Green Tec AG</td>
			<td></td>
			<td>These chambers are custom made.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrometer&#160;</td>
			<td>OceanOptics</td>
			<td>USB-650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging PAM</td>
			<td>Walz</td>
			<td>IMAGING-PAM M-Series</td>
			<td>There are several suitable models depending on the broader use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope+ 40x objective</td>
			<td>Leica&#160;</td>
			<td>DM1000</td>
			<td>Other companies also produce suitable microscopes.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Free download from website</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plant RNA extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bioanalyser</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td>Needs an additional computer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of arabidopsis thaliana growth behavior in different light qualities

Anläggningen biologer behöver ofta Observera tillväxt beteendet hos deras valda arter. Därför behöver växterna konstant miljö- och stabila ljusförhållanden, som är företrädesvis variabel kvantitet och kvalitet så att studier under olika uppställningar kan utföras. Dessa krav uppfylls av climatic chambers featuring emitting dioder (LED) lyser, som – till skillnad från lysrör – kan anges för olika våglängder. Lysdioder är energi bevara och avger nästan ingen värme även vid ljus intensitet, som ofta utgör ett problem med andra ljuskällor. Presenterade protokollet ger en steg för steg-vägledning i hur man programmerar en klimatkammare utrustad med variabel LED-lampor samt beskriva flera metoder för fördjupad analys av tillväxt fenotyper. Beroende på den experimentella set-up kan olika egenskaper plantor observeras och analyseras. Här beskriver vi hur man bestämmer färsk vikt, leaf område, fotosyntetiserande aktivitet och stomatala densitet. Vi visar att för att erhålla tillförlitliga uppgifter och dra välgrundade slutsatser är det obligatoriskt att använda ett tillräckligt antal individer för statistisk utvärdering. Att alltför få växter för denna typ av analysresultat i höga statistiska fel och därmed mindre tydliga tolkningar av data.

Observation och analys av växternas tillväxt och särskilt fenotyper från muterade växter är beroende av stabila och reproducerbara miljöförhållanden. Dessa kan ges i climatic chambers. Ljus kvantitet och särskilt kvaliteten är kritiskt beroende av sysselsatta ljuskällan, som i denna studie gavs av LED-lampor.
Figur 1 visar ett exempel på en klimatkammare utrustad med LED-paneler. Figur 1A visar en skärmdump av Kontrollpanelen där alla klimatiska och ljus villkor kan justeras. Tjugo olika tidsramar kan ställas in inom 24 h. I det här exemplet har lång dag villkor med 16 ljus/8 h mörka programmerats. Denna kammare har fyra nivåer som kan programmeras separat så att växternas tillväxt på fyra olika ljusinställningar kan studeras under exakt samma miljöförhållanden. Den övre vänstra nivå är inställd på en spektral utgång härma solljuset som tekniskt möjligt, den övre höger nivå representerar förhöjda röda (660 nm) och blått ljus (440 nm) med reducerad vitt ljus (3K). Vänster nedre plan var inställd på förhöjda blått ljus och lägre rätt nivå till övervägande rött ljus. Figur 1B visar lysdioderna på de olika inställningarna som en översikt (mellersta panelen) och respektive zoom-moduler (yttre små paneler). Skillnaden i ljus kvaliteter kan lätt ses med ögat.
En inbyggd spektrometer ständigt mäter, övervakar och justerar den spektrala. Figur 2 visar spektrumet från övre vänstra nivå 1.1, som var satt att efterlikna solens ljus. Portion av UV och blått ljus jämfört med en standard fluorescerande lampa och är mycket högre7.
I figur 3 exempel på A. thaliana växter från alla fyra villkor 10, 13 och 17 dagar, respektive, efter sådd är avbildad. Alla växter fotograferades från samma avstånd genom att montera kameran på ett stativ. Skalstapeln representerar 1 cm. Efter 10 dagar, ingen större skillnad i storlek eller färg kan skönjas, men efter 17 dagar en snabbare tillväxt under rött ljus är uppenbart. Utöver detta visuell analys utfördes flera fysiologiska analyser.
Figur 4 följer de olika stegen i PAM mätningar, som analyserar t.ex. photosynthetic kapacitet. I figur 4A visas en skärmdump av livevideon, vilket är inställningen för att föra växten i fokus att säkerställa optimal kvalitet på mätningarna. Istället för att fokusera på hela anläggningen, kan man också välja ett enda blad att analysera. Figur 4B visar nuvarande fluorescerande avkastningen Ft av en stjärnkartsschema växt innan den faktiska mätningen startade. I det här fallet valdes fem cirkulär intresseområden (AOI). Siffrorna i rutorna Röd bredvid varje AOI ger direkt det numeriska resultat, som kan sparas i form av en tabell. För att inleda en mätning av fotosyntetiska parametrar Fo, måste Fm in. En skärmdump av Ft efter gör den här avbildas i figur 4 c. Observera att nu knappen ”Fo, Fm” inte är aktivt längre. För att starta en ny mätning, behöver ”ny post” klickas för att radera tidigare normalisering. Slutligen visar figur 4 d den effektiva PSII kvantutbyte Y(II) efter ger en mättar ljuspuls (”SAT-Pulse”). Kvantifiering av exemplarisk data visas i figur 5. Växter som odlas i solljus på 200 µM/cm2/s1 (figur 5A) analyserades 12, 21 och 28 dagar efter sådd, respektive. Våra data visar att PSII avkastning är betydligt högre i blad från växter som odlas för tre veckor än i 12 dagar. Skillnaden mellan 28 och 12 dagar är fortfarande betydande, men p-värdet är högre. I figur 4Bjämfördes PSII avkastning från växter som odlas i två veckor från olika ljus kvaliteter. Intressant, leder permanent tillväxt under ljus innehållande en kick portionr av blått ljus till en betydligt större avkastning av PSII. En liknande effekt observerades för växter som odlas under berikad rött ljus, men ökningen var lite lägre.
Olika ljus kvaliteter visades effekten stomata utveckling14. Därför undersöktes stomatala tätheten. Figur 6 visar hur ett löv efter pigment utvinning ser ut. Enstaka epidermala celler kan väl särskiljas och stomi kan enkelt räknas. I figuren markeras enskilda stomata med en asterisk. Detaljerade uppgifter om stomatala tätheten av växter från olika ljusinställningarna kan hittas någon annanstans9.
Utöver visuell inspektion (figur 3) ger färsk vikt ett bra mått på framsteg som tillväxt. I det här exemplet vägdes bladen från växter som odlas under ”solljus” efter 8, 10 och 12 dagar efter sådd, respektive. Statistisk utvärdering av dessa uppgifter kan ses i figur 7. Som förväntat, ökar den färska vikten med tiden.
Förutom färsk vikt är leaf området ett bra mått för tillväxt. Här, följdes växt utveckling från 10, 13 och 17 dagar efter sådd (figur 8A). Minst sex enskilda växter utvärderades rutinmässigt för att erhålla tillförlitliga statistiska uppgifter. För att demonstrera vikten av en hög provstorlek, procentuella felet av medelvärdet, från att analysera två och sex växter, respektive beräknades (figur 8B). Det innebär att procentuella standardavvikelsen när det gäller medelvärdet bestämdes. Det är mycket tydligt att felet vid en liten provstorlek är 5-10% högre än vid en högre provstorlek. Genom att öka antalet plantor som utvärderas, kan felet minimeras, vilket gör tolkningen av data mycket tydligare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig1.jpg"> Figur 1: olika ljus kvaliteter tillhandahålls av lysdioder. (A) skärmdump från Kontrollpanelen på LED kammaren. Dagslängd är inställd på 16 h (övre högra hörnet) och ljusstyrkan är inställd på 200 µmol cm-2 s-1. Ljuskvaliteten är olika på alla fyra nivåer: 1.1 representerar ett spektrum som liknar solljuset som tekniskt möjligt, 1.2 representerar en hög andel av röda och blå våglängder (RB) ljus, 2.1 ligger huvudsakligen till blå (B), 2.2 representerar främst röda ljus (R). B) den mellersta panelen visar en översikt över alla nivåer. den yttre panelen visar de individuella nivåerna i en högre zoom. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig2.jpg"> Figur 2: våglängd spektrumet från simulerat solljus inställningar. En skärmdump från inbyggd spektrometern i LED kammaren visas, som var placerad på nivå 1.1. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig3.jpg"> Figur 3: plantera utveckling över en vecka. Representativa A. thaliana växter från alla fyra ljusförhållanden från 10, 13 och 17 DAS. Växter har fotograferats med en digital reflex kamera på ett stativ. Skalstapeln representerar 1 cm för alla bilder. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig4.jpg"> Figur 4: Skärmdumpar från representativa steg PAM mätningar av A. thaliana växter. A) skärmdump från vyn ”Live video” där bilden fokus kan justeras. B) nuvarande fluorescens avkastning Ft före tillämpning av några ljuspulser. C) nuvarande fluorescens avkastning Ft efter inställning av Fo/Fm. D) verkställer PSII kvantutbyte efter inställning en mättar ljuspuls. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig5.jpg"> Figur 5: grafisk representation av verkställer PSII kvantutbyte (YII). (A) Data från växter 12, 21 och 28 dagar efter sådd och odlas under 200 µmol/cm2/s1 under simulerade solen ljus (”solljus”) utsätts för PAM analys utvärderades statistiskt. Visas medelvärdena för fem växter och fem AOI per dag. En asterisk indikerar en signifikant skillnad med ett p-värde < 0,05 jämfört med dag 12 och två asterisker visar mycket betydande skillnader med ett p-värde < 0,02 enligt studenternas t-test. B) Data från växter som odlas på 200 µmol/cm 2/s1 under simulerade solljus (SL), berikad blå (B) eller röd (R) ljus, respektive utvärderades statistiskt. Visas medelvärdena för fem växter och fem AOI per dag. Signifikanta skillnader beräknades i jämförelse med ”solljus”.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig6.jpg"> Figur 6: representativ bild av stomata på abaxial sidan av en A. thaliana blad. Bladen bereds enligt anvisningarna ovan och analyserades visuellt under ett ljusmikroskop med DIC inställningar på 40 X förstoring. Stomata räknas i det synliga området minst 4 blad per tillstånd. Bilden är tagen med en digitalkamera ansluten till Mikroskop Tubusen. Antalet stomata per mm² beräknas med hjälp av skalstapeln. Stjärnor indikerar en enda stomi. Skalstapeln representerar 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig6large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig7.jpg"> Figur 7: grafisk representation av färsk vikt från A. thaliana växter som odlas på simulerat solljus/200 µmol/cm2/s1. Rosett bladen sänktes från växter åtta, tio och tolv dagar efter sådd. Medelvärden i mg från sex plantor per dag är avbildade. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57152/57152fig8.jpg"> Figur 8: Statistisk utvärdering av A. thaliana blad, från växter som odlas under olika ljusförhållanden. A) Leaf området från A. thaliana odlas för 10, 13 och 17 dagar bestämdes grafiskt med ImageJ och data från n = 6 växter utvärderades statistiskt. Leaf området från alla sex rosetter från varje villkor var sammanfattade och dividerat med sex att erhålla medelvärdet. Standardavvikelsen beräknas med detta värde, och detta representeras av felstaplar. B) Leaf området fastställdes grafiskt med ImageJ och data från antingen n = 2 eller n = 6 växter, respektive, analyserades statistiskt som beskrivs för panel A. Sedan felet i procent av medelvärdet beräknades och skildras grafiskt. Gröna staplar Visa procent fel från analys av n = 6, blå barer från n = 2 växter. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57152/57152fig8large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities at JoVE.com

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Här presenterar vi ett protokoll för att studera växt tillväxt beteende och särskilt fenotyper på ett reproducerbart sätt. Vi visar hur du ger variabel och på samma gång stabila ljusförhållanden. Korrekta analyser beror på tillräckligt prov nummer och giltiga statistiska utvärderingar.

Analys av Arabidopsis thaliana tillväxt beteende i olika ljus kvaliteter

Plant biologists often need to observe the growth behavior of their chosen species. To this end, the plants need constant environmental and stable light ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Analysis of Arabidopsis thaliana Growth Behavior in Different Light Qualities

Plant Biology

Plant Responses to the Environment

SCIENTISTS IN ACTION

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Metabola Märkning och Membrane Fraktione för jämförande proteomik analys av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Fjädring cellkulturer

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Histokemisk fargning av<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Sekundär cell Väggelement

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Quantitative Analysis of Aspergillus nidulans Growth Rate using Live Microscopy and Open-Source Software

Kvantitativ analys av Aspergillus nidulans tillväxttakt med hjälp av livemikroskopi och programvara med öppen källkod

It is well established that colony growth of filamentous fungi, mostly dependent on changes in hyphae/mycelia apical growth rate, is macroscopically ...

Spatiotemporal Investigation of ERL1 Dynamics via Confocal Imaging

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells

Image-Based Methods to Study Membrane Trafficking Events in Stomatal Lineage Cells (Video) | JoVE 

In eukaryotic cells, membrane components, including proteins and lipids, are spatiotemporally transported to their destination within the endomembrane ...

An Improved Method to Measure Pollen Hydration Profiles in Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana

A High-Resolution, Single-Grain, In Vivo Pollen Hydration Bioassay for Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

En högupplöst, enkelkornig, in vivo pollenhydreringsbioassay för Arabidopsis thaliana

Sexual reproduction in flowering plants requires initial interaction between the pollen grain and the stigmatic surface, where a molecular dialog is ...

Growth of Arabidopsis thaliana Plants and Preparation of Flowers for Pollen Hydration Assay

Growth of Arabidopsis thaliana Plants and Preparation of Flowers for Pollen Hydration Assay  (Video) | JoVE 

Tillväxt av Arabidopsis thaliana växter och beredning av blommor för pollenhydreringsanalys

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition and its Measurements

Pollen Hydration Assay in Arabidopsis thaliana: Raw Data Acquisition and its Measurements (Video) | JoVE 

Pollenhydreringsanalys i Arabidopsis thaliana: Rådatainsamling och dess mätningar

﻿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

ï»¿Preparation of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana (Video) | JoVE 

Beredning av dubbelfärgad F1 transgen Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Pharmacological Analysis of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  (Video) | JoVE 

Farmakologisk analys av dubbelfärgad F1 transgen Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana

Sample Preparation and Confocal Imaging of Dual-Colored F1 Transgenic Arabidopsis thaliana  (Video) | JoVE 

Provberedning och konfokal avbildning av dubbelfärgad F1 transgen Arabidopsis thaliana