Name: visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker
Uploaded: 2018-03-31T15:00:00
Duration: 13 min 26 s
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脂肪組織や研究の専門家を収集し、私たちにこのリソースを提供する研究用のドナーに感謝しております。アラガン社による支援の資金を確認したいと思います。Videoing とこの資料の提出のための編集のコストの資金調達もオークランド大学、医学部、健康科学パフォーマンス ベース研究基金に感謝しています。

1. 分化アッセイのため Asc の準備
<ol><li>組織培養試薬を準備し、滅菌のティッシュ文化フードの生きているセルを処理します。</li>
	<li>A0 メディアの準備: ダルベッコ変更イーグル培地とハムの F12 媒体 (DMEM/f12 キー)、1 x glutamax 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン。</li>
	<li>完全な ASC メディアの準備: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x ペニシリン/ストレプトマイシン, 10% 牛胎児血清。</li>
	<li>使用付着は、Asc、コート t75 フラスコ培養用フラスコで展開を精製しました。蛍光活性化セル (FACS)10を並べ替えを使用して Asc の純度を確認してください。</li>
	<li>コート t75 フラスコ培養用フラスコからすべてのメディアを削除して細胞分離酵素の 2 mL を追加してセルをデタッチします。</li>
	<li>5-10 分 (37 ° C、湿度、5% CO2) インキュベーターで培養用フラスコを残します。インキュベーター外培養用フラスコを取るし、しっかりとフラスコの側面をタップします。倒立顕微鏡を用いた培養用フラスコからセルをデタッチかどうかチェックしてください。</li>
	<li>コート t75 フラスコ培養用フラスコに A0 媒体の 13 mL を追加します。</li>
	<li>転送 15 mL 15 mL 遠心管に 400 × g で 5 分間遠心します。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、再完全 ASC 培地 1 mL の細胞ペレットを中断します。</li>
	<li>検定を使用してセル数を実行します。</li>
	<li>濃度 25,000 細胞 mL-1完全 ASC 培地での細胞懸濁液を希釈します。</li>
	<li>96 well プレート (フラットボトム) のすべての周辺井戸に A0 媒体の 200 μ L を追加します。これは、中心部の細胞を含む井戸の蒸発速度を減少します。</li>
	<li>細胞懸濁液 200 μ L をウェルあたり 5 x 10 の3セルの最終的な細胞密度を達成するためにマイクロウェル プレートに転送します。4 井戸各治療群 (帳票の技術的な繰り返しと免疫細胞化学 (ICC)、ない一次抗体制御) が必要です。</li>
	<li>リーチ合流 (3-4 日) セルまでインキュベーター (37 ° C、湿度、5% CO2) でマイクロウェル プレートを残します。</li>
</ol>2. Asc の分化を誘導します。
<ol><li>脂肪細胞分化培地を準備するには、1 μ M の dexamethasome、10 μ M インスリン 200 μ M インドメタシンと完全な ASC 媒体を補完します。完全な分化培地は 4 ° C、1 ヶ月で 1 アッセイに必要なだけ作る安定です。ストア 4 ° C で、必要なときは熱水浴の 37 ° C に因数。</li>
	<li>3-4 日後インキュベーターからマイクロウェル プレートを取るし、脂肪細胞分化培地培地の半分を置き換えます。</li>
	<li>中型の変更ごとに 2-3 日間を実行します。 注: 最適な脂肪細胞分化分化培地における文化の 14 日間が必要です。分化した細胞は、伝統的な染料系の汚れと遺伝子特定の汚れを使用して分析されます。</li>
</ol>3. 染色分化 - 伝統的な染料ベースの汚れ
<ol><li>4% ホルムアルデヒド溶液を準備 16% ホルムアルデヒド PBS で希釈すること。実験に必要な量と遠心チューブ内に密封ストアのみを希釈します。 注意: ホルムアルデヒド潜在的な発がん性物質は、鼻、喉、吸入により肺に炎症を引き起こすことができます。ヒューム フードのホルムアルデヒドに関するすべての手順を実行します。</li>
	<li>オイル赤 O 原液を準備するには、100 mL のイソプロパノールの中 300 mg を溶解します。</li>
	<li>インキュベーター外マイクロウェル プレートを取る。次の手順は、非無菌環境で実行することができます。</li>
	<li>井戸からすべてのメディアを削除し、30 分間 4% ホルムアルデヒドとセルを修正します。</li>
	<li>培養時間の間にオイル赤い O 作業ソリューションを準備します。実用的なソリューションには、4 部分蒸留水 (dH2O) と 6 の部品オイル赤い O 在庫が装備されています。よく混合し、0.2 μ m のフィルター ユニットを使用してフィルター処理する前に、20 分間室温で座ってみましょう。2 h の安定こそ作業ソリューションです。</li>
	<li>ピペッティングで井戸からすべてホルムアルデヒドを除去します。</li>
	<li>一度 60% イソプロパノールと井戸は、続行する前に完全に乾燥させる細胞を洗浄します。</li>
	<li>各ウェルにオイル赤い O 作業溶液 50 μ L を追加し、10 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>オイル赤 O ソリューションを削除し、すぐに dH2光学顕微鏡の下で見る前に dH2O 4 回 o. 洗浄を追加します。</li>
</ol>4. 差別化 - 遺伝子特異的抗体の染色
<ol><li>NaCl、KCl の 2 g と 30 g (pH 8) dH2O の 1 L にトリス基地の 80 g を溶解してトリス緩衝生理食塩水 (TBS) の原液を準備します。希釈 1:10 室温で dH2o ・ ストアを使用して実用的なソリューションを準備します。</li>
	<li>Immunobuffer (IB) を準備 (1% ウシ胎児血清 (FBS) tbs)。日付と 15 mL 遠心管にラベルを付けるし、4 ° C で保存IB は、作られた日付から 1 週間使用できます。</li>
	<li>カゼインと 0.195 g リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) の 200 mL のアジ化ナトリウム 0.5 g を溶解することにより、0.25% カゼイン ブロッカーを準備します。一晩攪拌によって成分が完全に溶解します。15 mL 遠沈管に-20 ° C の冷凍庫に保管因数。解凍カゼイン ソリューションは、4 ° C で 1 ヶ月保存できます。</li>
	<li>4 ° c で、光から保護 TBS. ストアで在庫の DAPI レバレッジを希釈して DAPI 溶液を調製します。</li>
	<li>滅菌 PBS でチメロサールを溶解することにより在庫チメロサール ソリューション (10 mg mL-1) を準備します。4 ° C で保存し、0.4 mg mL-1の使用のために適切な量を希釈します。</li>
	<li>修正し、氷冷メタノール (96 ウェル プレート) TBS の 200 μ L で 1 回 5 分洗浄セルとセルを permeabilize</li>
	<li>10 分間室温で 0.25% カゼインの 50 μ L でブロックし、TBS と一度洗う</li>
	<li>IB で希釈した一次抗体の 50 μ L を追加 (抗体については、表 1を参照) と 1 h の閉じ蓋 incubate。</li>
	<li>TBS および TBS と穏やかな揺動に 5 分間、3 回の 200 μ L で 1 回洗浄します。</li>
	<li>IB で希釈した二次抗体を 50 μ l 添加 (抗体については、表 2を参照) 1 h. カバー プレートの光退色を防ぐために箔で閉じた蓋と孵化各配分 DAPI と。</li>
	<li>TBS で一度洗ってから 2 回 TBS 穏やかな揺動と 15 分のため。</li>
	<li>すべて TBS を削除し、チメロサール溶液 200 μ L を追加します。</li>
	<li>4 ° c、光からイメージングまで保護プレートを格納します。</li>
</ol>5. イメージングは、スループットの高い顕微鏡を用いた細胞します。
<ol><li>制御ソフトウェアに付属高のコンテンツ スクリーニング顕微鏡を用いた共役二次抗体 (蛍光抗体法) 遺伝子特異抗体と蛍光染色細胞を分析します。</li>
	<li>マイクロウェル プレートを顕微鏡ステージに読み込みます。プレート取得コントロールで、中距離の倍率 (10 倍対物レンズ) でイメージを選択します。2 つの隣接するフィールドを 1 つのセルが表示されないことを確認する各サイト間に 50 μ m 間隔で、各ウェルのセンターから、画像を確認してください。</li>
	<li>画像に井戸を選択します。</li>
	<li>適切なチャネルの組み合わせ、露出時間、z オフセット パラメーターを選択します。(補足テーブル 2) 各フィルターの詳細情報の表 3を参照してください。</li>
	<li>(画像は自動的にデータベース サーバーに格納されている) の取得ウィザードを使用してアッセイを取得します。</li>
	<li>代替チャネルの組み合わせを使用してオイル赤い o. (補足表 3) プレートを取得します。</li>
</ol>6. 取得した画像を分析します。
注: リモート データベース サーバーを有効に迅速かつ簡単な評価取得画像の画像解析ソフトウェアの使用へのアクセスします。
<ol><li>解析ソフトウェアで開いているセル得点モジュール。</li>
	<li>ユーザー定義のパラメーターとサイズの DAPI チャネル (核マーカー) と関心のセグメントの核を使用して細胞核の検出し、その信号強度背景の上。</li>
	<li>FITC チャネルを使用して FABP4 信号を検出します。ユーザー定義パラメーターをそれぞれのイメージですべて FABP4 肯定的な領域を選択する背景の上のサイズと信号強度と分化細胞をセグメント化します。</li>
	<li>オイル赤い o. プレートを分析する解析ソフトウェアの Transfluor モジュールを開く</li>
	<li>サイズとオイル赤 O 染色 'ピット' としての地域の強さを指定します。</li>
</ol>

<ol>
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著者は利益相反を宣言しません。

本稿は、ユーティリティと正確に検出し、成熟脂肪細胞に由来する間葉系間質細胞を定量化する FABP4 immunolabelling の利点を示します。FABP4 は血統で、特定の蛋白質3,4,5その他一般的に反して成熟した脂肪細胞に発現の変化使用高分子どちらのラベル変更13,14 染料を検出することがオイル赤い O15、Nile Red16スーダン ブラック17など。FABP4 immunolabelling 可視化や細胞の形態変化の解析ができます。これは定量的逆転写 PCR (RT qPCR) 任意視覚化5,18,19 せずトラン スクリプト レベルでの変更を分析するを使用して上記の方法で特徴的な利点 ,20、またはフローサイトメトリー懸濁液20、または西部にしみが付くことにする細胞が必要なタンパク質19,20を分離する分離するセルが必要です。FABP4 immunolabelling 固定セルが安定している、ソリューションに漏れないが、ゾル性細胞質蛋白質の細胞付着性単分子膜のラベルとされて、容易な視覚化を可能にする、自動化された分析の精度を追加核と重複。
高コンテンツ スクリーニングは、高速、正確、再現性のある客観的だから便利です。画像集録および解析を最小限の手動操作を必要とする、計測器の自動処理に依存は試薬と研究時間の費用効果が大きい使用のためにプラットフォームを提供します。いくつかの要因が決定的な要素として識別された、再現性高いコンテンツ スクリーニングの試金31。抗原の発現の定量化は、画像の品質に依存します。成功画像解析、ウェルあたり各チャネルからの画像する必要がある焦点になるし、グレー値の最適なダイナミック レンジ内に収まる (自動公開の設定が理想的)。フォーカスまたは誤った結果へ飽和画像鉛のアウト。
この資料で説明する方法のいくつかの潜在的な制限は次のとおりです。専門的なイメージング機器と解析ソフトウェアの要件。類似画像の領域分割を実行する、この資料の範囲外にいて代替オープン ソース ソフトウェア オプション (たとえば、ImageJ32,33, フィジー34, CellProfiler32,35) を使用できます。タスク;ただし、ダウンロードしオンライン使用可能なマクロを調整またはその特定の解析パイプラインのマクロ/コマンドを記述するスキルが不要します。バック グラウンド ノイズのレベルはすべての自動イメージング解析パイプラインに固有のものです。これは主の破片に起因することができます悪いイメージ品質または解析エラー、注意して試料調製及び画像処理および解析プラットフォームの注意セットアップ必要性を強調します。30未分化前駆細胞を検出するマウス FABP4 ラベルが見つかりました(これは未分化細胞から成っている) 本研究でコントロールしながら特定 FABP4 の染色を欠いています。このアンダー スコアは、FABP4 式をチェックインの必要性未分化前駆細胞アッセイの採用、各生物学的文脈で。
ため、FABP4 ラベリング及びオイル赤 O 染色、生物学的に関連する必要な画像解析からの出力測定値間の有効な比較を描画します。したがって、FABP4、使用された測定、'% 陽性細胞' と 'セルあたり染色の領域' だったオイル赤い o. に使用オイル赤 O 標識脂肪滴を与えられた核; 正確に原因はなかったので我々 の研究で細胞を標識にメジャー '% 陽性細胞' が使用されて注目すべきです。脂肪滴は細胞体のサイズ、数、流通にかなり変化し、核とほとんど重なります。オイル赤 O 染色可変性が異なる組織源由来の細胞間に存在します。% 陽性細胞測定が現在の研究のため適当ではない、別のグループが正常に使用して脂肪細胞に由来する人間の腺細胞22を定量化するため、スパン 1 つの大きな脂肪滴として登場オイル赤 O 染色、細胞質と核と % 陽性細胞として提示される有効にするデータ。
対照的に、FABP4 の immunolabelling の形態は脂肪細胞に由来する様々 な組織のソース23,24,25の範囲で一貫しました。細胞分化のことができる文化の中での比率を数値化することで、アプリケーションの数。大人の間葉系間質細胞は、多様な治療上の使用の重要な約束を保持します。臨床の翻訳で生じている重要な問題は患者26間、分離27,28, サイト間分離12 法およびこれらの細胞の能力に固有の変動とセル番号12治療上の使用の拡大。付着性間質細胞の培養は頻繁に異種、ASC 文化のアッセイを示していくつかの細胞分化およびいくつかは12,17私たち FABP4 としてことができる、それは以前示されています。このような試金、濃縮技術と組み合わせて、異種文化系統固有の分化の能力内のサブ集団を特定しやすくなります。この FABP4 アッセイなど、定量化が可能な標準化されたアッセイを持つすべてのこれらの変数と臨床試験と内治療成果を評価する電位との比較のための簡単な方法を提供します。
半自動化された方法で FABP4 の定量化は、多くのドナーの場合とサンプルの間で客観性と分析の再現性をできます。さらにラベルは細胞質、それすることができます潜在的肥満研究のかなりの重要性のある区別過形成 (脂肪細胞数の増加) に加え肥大 (脂肪細胞サイズの拡大) を分析するため、肥大が強く脂肪肥満個人21障害に関連付けられて。肥満の伝染病はかなりの量の脂質ストレージを制御することができる薬剤を識別するの関心に拍車をかけています。この FABP4 アッセイは、何千もの脂肪蓄積を抑制する機能のための化合物のスクリーニングのため単純な読み出しを提供します。

多能性間葉系間質細胞を定義するために、細胞療法 (ISCT) の国際協会によって確立された重要な要件の 1 つは細胞、脂肪細胞、骨と軟骨細胞系統に分化する能力が必要です。1。 これら 3 つに分化を測定の従来の方法は化学染料1を使用して高分子製品の検出に依存します。(これは脂肪細胞形成を経た細胞における脂肪滴を汚れ) オイル赤い O などの染料が安くて使いやすい。しかし彼らは、各それぞれのリネージュ2に間葉系細胞が分化するときに発生する遺伝子の特定の変化を検出する失敗します。ここでは、脂肪細胞の系統特異マーカー、脂肪酸結合タンパク質 4 (FABP4)3,4、5の発現を定量化する分化アッセイを開発しました。FABP4 は、マウス 3T3 ‐ L1 脂肪細胞3で発見された当初とひと皮下脂肪組織6で表される発見された後。ゾル性細胞質蛋白質、細胞による脂肪酸取り込みをガイドするシャペロンとして機能し脂肪分解4過程で関与しているです。
前駆細胞の分化アッセイに使用された脂肪派生間葉系間質細胞 (Asc)7,8。Asc は、骨髄由来間葉系幹細胞 (BM MSCs)、大人8,9の主要な間葉系幹細胞の人口の多くのプロパティを共有します。Asc は、細胞の大きな収率はより容易にアクセス可能な組織ソース8,9から分離でき、臨床応用に BM MSCs 上いくつかの利点を提供しています。孤立セル人口は、Asc として定義される特定の条件を満たす必要があります。まず、標準的な文化の条件1でプラスチックの組織培養容器への付着を見せなければなりません。また、表面抗原式1を表示する必要があります。難の Asc は CD45 と HLA の10の否定的表現、低発現 CD105 CD90 CD73 CD34 の肯定的な表面抗原の発現によって特徴付けられます。プラスチック (付着精製 Asc) 28 日間培養精製 Asc は CD105、CD90 CD73 の肯定的な表現と CD34、CD45、HLA-DR の10の否定的表現を示しています。最後に、細胞は様々 な系統1,7、8に分化する能力を保持する必要があります。
脂肪細胞分化プロトコル FABP4 の細胞内でタンパク質の視覚化に検体を使用し、単一セルのレベルで FABP4 式を定量化、FABP4 式他の脂肪細胞系列遺伝子の中の印象的なアップレギュレーションを誘発します。自動蛍光高コンテンツ スクリーニング顕微鏡を使用します。この方法は伝統的な染料上有利な脂肪細胞系列の分化過程の非常に特定可能です。スクリーニング法も高いコンテンツと組み合わせるような遺伝子特定の血統のアッセイは、特定系統に分化可能な異種セル準備内のセルの割合の定量化を有効にします。私たちの研究では細胞培養後新鮮単離 Asc の脂肪細胞の微分の潜在性の損失を確認する FABP4 アッセイを使用されます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:419px;">Tris Base</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15504-020</td>
			<td style="width:237px;">Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064041000</td>
			<td>Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360500</td>
			<td>Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Azide</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>SO0091</td>
			<td>Casein blocker solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td>Casein blocker solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091-148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate (flat bottom)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>FAL353072</td>
			<td>Cell culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 culture flask, with filter cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658175</td>
			<td>Cell culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>19278-5ML</td>
			<td>Adipogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915-100MG</td>
			<td>Adipogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">indomethacin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>I7378-5G</td>
			<td>Adipogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil-Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td>Classic stain for adipogenesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td>Classic stain for adipogenesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% formaldehyde</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28908</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti rabbit IgG alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thimerosal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5125-10G</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>10004944</td>
			<td>Marker of adipogenesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Centrifuge tubes (15mL)</td>
			<td style="width:124px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">GR188271</td>
			<td>General</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Centrifuge tubes (50mL)</td>
			<td style="width:124px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">GR227261-P</td>
			<td>General</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">ImageXpress Micro XLS</td>
			<td style="width:124px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>high content screening machine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">MetaXpress</td>
			<td style="width:124px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>high content screening software, version 5.4.01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker

いくつかの染料は、間葉系細胞の脂肪細胞への分化を検出するに使用するため現在利用します。オイル赤 O などの染料は間葉系細胞の脂肪分化能の分析研究所、安い、使いやすい、広く利用。しかし、彼らは遺伝子のトランスクリプションの変更に固有ではありません。間葉系細胞が脂肪細胞系列にその運命を切り替えを分析する遺伝子特異的分化アッセイを開発しました。脂肪酸結合タンパク質 4 (FABP4)、脂肪細胞分化の系統特異マーカーに対して免疫ラベルには可視化と分化細胞の定量化が有効になります。96 よくマイクロ プレート フォーマットでの間葉系細胞の脂肪細胞分化を定量化することは、アプリケーションの数の有望な意味を持ちます。何百もの臨床試験を含む成人間葉系間質細胞の使用と現在内と特にそのような臨床試験の治療結果を関連付けることは困難です。この単純な高スループット FABP4 アッセイ患者由来細胞の微分の潜在性を評価するための定量的アッセイを提供、さまざまな分離と拡張方法を比較するための強力なツールです。間葉系細胞製品で患者に投与されている細胞の多様性の増加の認識を与え、これは特に重要です。アッセイ肥満と糖尿の研究で特に、高スループット薬物スクリーニングの潜在的効用があります。

この研究では、3 つの異なる方法で Asc の脂肪分化分化能を測定しました。分化した細胞、このマーカーが細胞質にローカライズされたことを示した、FABP4 の蛍光ラベルとラベル (図 1 a) DAPI ラベル核とオーバー ラップします。自動画像解析では、後半の一節細胞 (図 1 b) は 6.9 倍に増加と比較して初期の通路細胞で分化したグループにおける FABP4 陽性細胞 %24.6 倍を明らかにしました。オイル赤 O 染色は分化した細胞の細胞質に分散している脂肪滴にローカライズされ、ほとんど DAPI ラベル核; とオーバー ラップ表示ただし目視検査からオイル赤い O 初期一節細胞 (図 2 a) と比較して後半の通路細胞における脂肪滴と関連付けられた少数の細胞核があります。自動画像解析では、オイル赤 O 染色初期一節細胞のセルと後半の一節細胞 (図 2 b) のセル面積を染色で 53.9 倍あたりのエリアで 11.1 倍を明らかにしました。両方の汚れのイメージングを行ったソフトウェア (補足図 1、補足表 2-5) セル得点 (FABP4) または Transfluor (オイル赤い O) モジュールを使用して量を示される..FABP4 式のアップレギュレーションは西部のしみの分析 (図 3図 5 の補足) によって確認されました。すべて 3 解析方法では、初期の通路 Asc がある後半の一節細胞よりも潜在的な高い脂肪細胞分化を明らかにしました。脂肪細胞分化は、(補足図 2 3) ウェルあたりの細胞数には影響しなかった。しかし、FABP4 陽性分化細胞の核の大きさは後半通路 Asc のみの制御の細胞に比べ大幅に小さく (補足の図の 3).
細胞が培養、または継代、脂肪細胞分化の減少、以前発行したデータ11と一貫性のあることができる文化の中で細胞の割合としました。年齢、ボディマス指数、以前の病歴12などの要因、本研究での制御し、異なるドナー サンプル (補足表 1) 間観測された変動に貢献した可能性がありますはないに注意してくださいすることが重要です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig1.jpg"> 図 1: FABP4 immunolabelling 初期一節細胞がある後通路細胞よりも大きい分化の能力を示しています。初期と後期の通路、コントロール、DAPI (核染色) と FABP4 ラベル分化細胞の A) 代表的なイメージは、マージと分割画像と一緒に表示されます。画像表示領域分割は、緑のオーバーレイを使ってセルと赤のオーバーレイの未分化細胞に区別されます。初期と後期の一節細胞における脂肪細胞分化と発現細胞 FABP4 の B) の大幅な増加を認め、初期一節細胞が後半の一節細胞 (マン ・ ホイットニーよりも分化の有意に高い増加を実証するただし、テスト * P を表す < 0.05 と * * * P を表す < 0.001)。表示されるデータは、平均早期成立 (p4; n = 8) または後半の一節 (p10; n = 4) ドナーのサンプル、SEM. ±<a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig2.jpg"> 図 2: 初期一節細胞がある後通路細胞よりも大きい分化の能力を示していますオイル赤 O 染色します。DAPI (核染色) とオイル赤い O (灰色、脂質液滴染色) の A) の代表的なイメージは、マージと分割画像と一緒に表示されます。画像の領域分割を描く緑のオーバーレイのすべての核とオイル赤 O 染色赤のオーバーレイで脂質液滴。オイル赤 O 染色領域の B) の大幅な増加は、脂肪細胞分化と観察されました。初期一節細胞は、後半の一節細胞と比較して細胞 1 個あたりオイル赤 O 染色の大きい領域を示した。オイル赤 O 染色 (μ2) 細胞 1 個あたりの面積を使用ここでは潜在的な脂肪細胞分化の指標として。表示されるデータは、平均早期成立 (p4; n = 8) または後半の一節 (p10; n = 4) ドナーのサンプル、± SEM (マン ホイットニー テスト * P を表します = < 0.05 と * * * P を表します = < 0.001)。<a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig3.jpg"> 図 3: 分化初期と後期の通路 Asc の FABP4 タンパク質発現レベルの西部のしみの分析。総蛋白負荷制御、ベータ アクチン (ACTB) 早期成立と区別される低い度後半通路 FABP4 immunolabelling が大幅に増加を示したの比率として FABP4 バンドの光学密度の半定量的解析セルです。表示されるデータは、平均早期成立 (p4; n = 8) または後半の一節 (p10; n = 4) ドナーのサンプル、± SEM (マン ホイットニー テスト * P を表します = < 0.05 と * * * P を表します = < 0.001)。<a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット抗原</td>
			<td>アイソタイプ (クローン)</td>
			<td>種</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
<tr>
<td>FABP4</td>
			<td>ポリクローナル</td>
			<td>ウサギ</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1: 一次抗体
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>ターゲット抗体</td>
			<td>蛍光ラベル</td>
			<td>種</td>
			<td>希釈</td>
		</tr>
<tr>
<td>ウサギ IgG します。</td>
			<td>Alexa フッ素 488</td>
			<td>ヤギ</td>
			<td>1: 200</td>
		</tr>
</tbody></table>表 2: 二次抗体
補足図 1: 仮想環境イメージ解析の概要。バイアスの任意のソースを避けるために高スループットの自動蛍光顕微鏡を用いた染色細胞をイメージしました。画像は、ImageXpress マイクロ XLS を使用して取得、MDCStore データ マネージャー データベースに直接保存されに最適化し、特定の分析パラメーターをテスト ユーザーを使用して仮想デスクトップ接続を介して表示できます。画像を自動実行キューに 'ジョブ' を送信する複数の異なるユーザーを可能にする専用 '自動' インスタンスに行った。ユーザーは、彼らの '仕事' が完了したら、仮想インスタンスを介して各自のデータを取得できます。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 2: 合計の比較細胞/ウェル コントロールの数と初期と後期の通路 Asc、FABP4 ステンド グラス プレートを使用してのための井戸を区別します。表示されるデータは、平均早期成立 (p4; n = 8) または後半の一節 (p10; n = 4) ドナーのサンプル、SEM. ±コントロールと初期と後期の両方の通路 Asc の分化した細胞の統計的に有意な違いはなかった。まあ、後半の一節細胞と比較して初期の一節細胞あたりより多くの細胞があった。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_2.tif" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 3: 合計の比較細胞/ウェル コントロールの数と初期と後期の通路 Asc、オイル赤 O 染色プレートを使用してのための井戸を区別します。表示されるデータは、平均早期成立 (p4; n = 8) または後半の一節 (p10; n = 4) ドナーのサンプル、SEM. ±コントロールと初期と後期の両方の通路 Asc の分化した細胞の統計的に有意な違いはなかった。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_3.tif" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 4: 後通路にいた FABP4 肯定的な分化細胞いた細胞よりも大幅に小さい核領域制御井戸で。早期成立にコントロール、分化した細胞の核領域に統計的に有意な違いはなかった。表示されるデータは、平均早期成立 (p4; n = 8) または後半の一節 (p10; n = 4) ドナーのサンプル、± SEM. (対になっていない t テスト * * * P を表します = < 0.001)。平均 ± SEM を示します)。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_4.tif" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足図 5: 画像の西部のしみのゲル。赤のチャネルは、β-アクチンを示しています。緑のチャネルは、FABP4 immunolabelling を示しています。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_5.tiff" target="_blank">この図をダウンロードするここをクリックしてください</a>。
補足表 1: ドナーの臨床病理学的情報<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_1.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足テーブル 2: 画像設定 (FABP4)<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_2.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足テーブル 3: 画像設定 (オイル赤い O)<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_3.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足表 4: 解析パラメーターの使用 (FABP4) のテーブル。セル スコアリング モジュール。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_4.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。
補足表 5: 解析パラメーターの使用 (オイル赤い O) のテーブル。トランス蛍光モジュール。<a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_5.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするにはここをクリックしてください</a>。

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Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

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Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells (Video) | JoVE 

HeLa細胞におけるライブイメージングを用いたミトコンドリア膜電位およびスーパーオキシドレベルの蛍光ベースの定量

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Artificial Cartilage Implants for Bone Regeneration via Endochondral Ossification

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration (Video) | JoVE

間葉系幹細胞を用いた In vivo 軟骨内骨化による統合骨形成

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...