Name: visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker
Uploaded: 2018-03-31T15:00:00
Duration: 13 min 26 s
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Somos gratos aos doadores de tecidos adiposo e os profissionais de pesquisa que coletam e nos fornecem este recurso para pesquisa de uso. Nós gostaríamos de reconhecer o apoio pela Allergan financeiro. Agradecemos também à Universidade de Auckland, da faculdade de medicina e saúde ciências desempenho baseado fundo de investigação para financiamento do custo de videoing e edição para apresentação deste artigo.

1. preparar ASCs para ensaios de diferenciação
<ol><li>Preparar reagentes de cultura de tecidos e lidar com células vivas em uma capa de cultura de tecido estéril.</li>
	<li>Prepare o suporte de A0: o meio Eagle modificado Dulbecco e do presunto F12 médio (DMEM/F12), 1 glutamax de x, 1 x penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Preparar o meio ASC completo: DMEM/F12, 1 x glutamax, 1 x penicilina/estreptomicina, 10% de soro fetal bovino.</li>
	<li>Aderente de uso purificado ASCs, expandidas-se em um frasco de cultura T75. Confirme a pureza da ASCs usando fluorescência-ativado da pilha (FACS)10de classificação.</li>
	<li>Separe células removendo todos os meio do frasco de cultura T75 e adicionar 2 mL de enzima de dissociação de célula.</li>
	<li>Deixe o frasco de cultura na incubadora (37 ° C, humedecidas, 5% CO2) por 5-10 min. Pegue o frasco de cultura fora da incubadora e bata firmemente do lado do balão. Verifica se as células têm retirado o frasco de cultura usando um microscópio invertido.</li>
	<li>Adicione 13 mL de meio de A0 a um frasco de cultura T75.</li>
	<li>Transferi 15 mL para um tubo de centrífuga de 15 mL e centrifugar 400 x g por 5 min.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 1 mL de meio ASC completo.</li>
	<li>Realize uma contagem de células usando hemocytometer.</li>
	<li>Dilua a suspensão de células para uma concentração de 25.000 células mL-1 no meio ASC completo.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de meio de A0 a todos os poços de periferia da placa bem 96 (fundo plano). Isso reduz a taxa de evaporação dos poços contendo células no centro.</li>
	<li>Transferi 200 µ l de suspensão de células para uma placa de micropoços para atingir uma densidade de célula final de 5 x 103 células por poço. Quatro poços são necessários para cada grupo de tratamento (repetições de técnicas triplicadas e um sem controle de anticorpo primário por imunocitoquímica (ICC)).</li>
	<li>Deixe a placa de micropoços na incubadora (37 ° C, humedecidas, 5% CO2) até as células alcance confluência (3-4 dias).</li>
</ol>2. induzir a diferenciação de ASCs
<ol><li>Prepare o suporte de diferenciação de adipogenic completando meio ASC completo com 1 µM dexamethasome, 10 insulina µM e 200 indometacina µM. O meio de diferenciação completa é estável em 4 ° C, durante 1 mês, fazer tão somente como necessário para 1 ensaio. Loja a 4 ° C e quando necessário aquecer uma alíquota para 37 ° C em banho-maria.</li>
	<li>Após 3-4 dias, pegue a placa de micropoços fora da incubadora e substitua metade do meio de cultura por meio de diferenciação de adipogenic.</li>
	<li>Realizar uma alteração de médio a cada 2-3 dias. Nota: Diferenciação de adipogenic ideal requer 14 dias de cultura em meio de diferenciação. Células diferenciadas são analisadas usando tintura tradicional baseada manchas e manchas de gene-específico.</li>
</ol>3. coloração para diferenciação - tintura tradicional à base de manchas
<ol><li>Preparar a solução de formol 4% por diluir a 16% de formaldeído com PBS. Dilua somente a quantidade necessária para o experimento e loja hermeticamente fechado num tubo de centrífuga. Cuidado: O formaldeído é um potencial cancerígeno e pode causar irritação de nariz, garganta e pulmões após a inalação. Execute todos os procedimentos relativos ao formaldeído em uma coifa.</li>
	<li>Prepare solução estoque de óleo vermelho O dissolvendo 300 mg em 100 mL de isopropanol.</li>
	<li>Leve o prato de microplacas fora da incubadora. As seguintes etapas podem ser executadas em um ambiente não-estéril.</li>
	<li>Remover todos os meio de poços e reparar células com formol 4% durante 30 min.</li>
	<li>Durante o tempo de incubação, prepare a solução de óleo vermelho O trabalho. Solução de trabalho é composto por 6 peças estoque de óleo vermelho O com 4 partes de água destiladas água (dH2O). Misture bem e deixe descansar em temperatura ambiente por 20 min, antes da filtragem usando a unidade de filtro 0,2 µm. Solução de trabalho só é estável por 2 h.</li>
	<li>Remova todos os formaldeído de poços pipetando.</li>
	<li>Lave as células uma vez com 60% de isopropanol e deixe que os poços secar completamente antes de prosseguir.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de solução de óleo vermelho O trabalho a cada poço e incubar a temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>Remover a solução de óleo vermelho O e imediatamente adicionar dH2O. Wash com dH2O 4 vezes antes de visualização sob microscópio de luz.</li>
</ol>4. coloração para diferenciação - anticorpos específicos do Gene
<ol><li>Prepare uma solução estoque de Tris-buffered saline (TBS) dissolvendo-se 80 g de NaCl, 2 g de KCl e 30 g de Tris Base para 1 L de dH2O (pH 8). Prepare a solução de trabalho diluindo 01:10 usando dH2O. armazenar em temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar immunobuffer (IB) (1% fetal de soro bovino (FBS) em TBS). Tubo de centrífuga de 15 mL, com data de rotular e armazenar a 4 ° C. IB pode ser usado por 1 semana a partir da data em que fez.</li>
	<li>Prepare o bloqueador de caseína 0,25% dissolvendo-se 0,5 g de caseína e 0,195 g de azida de sódio em 200 mL de soro de tampão fosfato (PBS). Dissolva completamente os ingredientes agitando a noite. Alíquota em tubos de centrífuga de 15 mL e guarde no congelador a-20 ° C. Soluções de caseína descongelado podem ser mantidas a 4 ° C por 1 mês.</li>
	<li>Prepare a solução DAPI diluindo estoque DAPI 1: 200 em TBS loja a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Prepare solução estoque timerosal (10 mg mL-1), dissolvendo o timerosal em PBS estéril. Armazenar a 4 ° C e diluir quantidades apropriadas para 0,4 mg mL-1 para uso.</li>
	<li>Corrigir e permeabilize células com metanol gelada (96 placa bem) para células de 5 min. Lave uma vez com 200 µ l de TBS.</li>
	<li>Bloco com 50 µ l de caseína 0,25% à temperatura ambiente por 10 min e lave uma vez com TBS.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de anticorpos primários diluído em IB (ver tabela 1 para obter detalhes do anticorpo) e incube-os com as tampas fechadas por 1h.</li>
	<li>Lave uma vez com 200 µ l de TBS e depois de 3 vezes com TBS por 5 min com balanço suave.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de anticorpos secundários diluído em IB (ver tabela 2 para obter detalhes de anticorpo) com 1: 2000 DAPI em cada um, incubar com tampas fechadas por 1 h. tampa a placa com papel alumínio para evitar o branqueamento de foto.</li>
	<li>Lave uma vez com TBS e duas vezes com TBS por 15 min com balanço suave.</li>
	<li>Remover todos os TBS e adicionar 200 µ l de solução de timerosal.</li>
	<li>Armazenar a placa a 4 ° C, protegido da luz, até de imagem.</li>
</ol>5. imagem de células usando um microscópio de alta produtividade
<ol><li>Analise as células coradas com fluoróforo e anticorpos específicos do gene anticorpos secundarios conjugados (imunofluorescência) usando um microscópio de alta seleção de conteúdo controlado com que acompanha software.</li>
	<li>Carrega a placa de micropoços em fase de microscópio. Sobre o controle de aquisição de placa, selecione imagem na ampliação de médio alcance (10 X da lente objetiva). Certifique-se de imagens são tiradas do centro de cada poço, com espaçamento de 50 µm entre cada local para garantir que uma célula não aparece em dois campos adjacentes.</li>
	<li>Selecione os poços para a imagem.</li>
	<li>Selecione as combinações de canal adequado, tempo de exposição e parâmetros z-deslocamento. Consulte a tabela 3 para obter informações mais detalhadas de cada filtros (complementar a tabela 2).</li>
	<li>Adquira o ensaio usando o assistente de aquisição (imagens são armazenadas automaticamente ao servidor de banco de dados).</li>
	<li>Use combinações de canais alternativos para adquirir placas manchadas com óleo vermelho O. (complementar a tabela 3).</li>
</ol>6. analisar a imagem adquirida
Nota: Acesso remoto ao banco de dados servidor permite fácil e rápida avaliação das imagens adquiridas e uso do software de análise de imagem.
<ol><li>Módulo de célula marcando aberto sobre o software de análise.</li>
	<li>Detectar núcleos de célula usando o canal DAPI (marcador nuclear) e núcleos de segmento de interesse com parâmetros definidos pelo usuário para o tamanho e intensidade acima do plano de fundo do sinal.</li>
	<li>Detecta o sinal de FABP4 usando o canal FITC. Segmento de células diferenciadas com parâmetros definidos pelo usuário para intensidade de sinal e tamanho acima do fundo para selecionar todas as regiões positivas FABP4 em cada imagem.</li>
	<li>Abra o módulo de Transfluor sobre o software de análise para analisar placas manchadas com óleo vermelho O.</li>
	<li>Especifica o tamanho e intensidade de óleo vermelho manchado de regiões como 'boxes'.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Este artigo demonstra a utilidade e vantagens de FABP4 encontrava para detectar com precisão e quantificar adipócitos maduros derivados de células estromais mesenquimais. FABP4 é capaz de detectar mudanças na expressão de uma linhagem específica de proteína3,4,5 em adipócitos maduros, ao contrário de outros comumente utilizados corantes qual rótulo macromolecular muda13,14 como óleo vermelho O15, Nilo vermelho16 e Sudan Black17. FABP4 encontrava permite a visualização e análise das alterações na morfologia celular. Esta é uma vantagem distinta sobre métodos anteriormente descritos usando quantitativa transcrição reversa PCR (RT-qPCR) que analisa as alterações a nível de transcrição, sem qualquer visualização5,18,19 ,20, ou citometria de fluxo que requer células em suspensão20, ou que mancha ocidental requer células para ser lysed para isolar proteínas19,20. FABP4 encontrava é estável em células fixas, não vazar na solução e sendo uma proteína citosólica quando rotulados em um monolayer aderente das células, se sobrepõem com o núcleo, permitindo a fácil visualização e adicionado a precisão na análise automatizada.
Triagem de alto teor é vantajosa porque é rápido, exato, reprodutível e objetiva. Fornece uma plataforma para custo efetivo uso de reagentes e tempo de pesquisador, desde análise e aquisição de imagem exigem a mínima manipulação manual e dependem do processamento automático do instrumento. Vários fatores foram identificados como críticos para a precisão e reprodutibilidade o inquérito de alto teor de ensaios de31. A quantificação da expressão do antígeno baseia-se na qualidade da imagem. Para a análise de imagem bem sucedida, imagens de cada canal por bem devem estar em foco e cair dentro de um alcance dinâmico ideal para valores de cinza (Auto expor configurações são ideais). Fora de foco ou de imagens saturadas conduzir a resultados erróneos.
Algumas possíveis limitações dos métodos descritos neste artigo incluem o seguinte. O requisito de software especializado de equipamentos e análise de imagens. Enquanto fora do escopo deste artigo, opções de software de fonte aberta alternativa (por exemplo, ImageJ32,33, Fiji34, CellProfiler32,35) podem ser usadas para executar a segmentação de imagens semelhantes tarefas; no entanto eles exigem as habilidades para baixar e adaptar as macros disponíveis on-line ou gravar macros/comandos para as tubulações de análise específicos. Inerente a tudo automatizado pipelines de análise de imagens é um nível de ruído de fundo. Em grande parte, isto pode ser atribuído aos restos, erro de qualidade ou análise imagem pobre, enfatizando a necessidade de preparação da amostra de cuidado e cuidado set-up da plataforma de imagem e análise. O rótulo de FABP4 em ratos foi encontrado para detectar progenitoras indiferenciadas30; enquanto os controles neste estudo (que consistem em células indiferenciadas) são desprovidas de coloração específica de FABP4. Este golo sob a necessidade de verificar a expressão FABP4 indiferenciados progenitores em cada contexto biológico onde o ensaio é empregado.
A fim de estabelecer comparações válidas entre o FABP4 rotulagem e óleo vermelho O mancha, as medições de saída da análise de imagem precisava ser biologicamente relevantes. Consequentemente, a medição, '% de células positivas' foi usada para FABP4 e 'área de coloração por célula' foi utilizada para óleo vermelho O. Vale ressaltar que a medida '% de células positivas' não foi usada para o óleo vermelho O rotulados células em nosso estudo, porque não foi possível atribuir as gotículas de gordura rotuladas com precisão para um determinado núcleo; as gotículas de gordura variaram consideravelmente no tamanho, número e distribuição em todo o corpo da célula e raramente sobrepunham com o núcleo. Óleo vermelho O manchando a variabilidade existente entre as células derivadas de tecidos diferentes fontes; enquanto o % positivo medida de células não era apropriada para o atual estudo, outro grupo usou com sucesso para quantificar adipócitos derivados de células-tronco humanas glândula22 onde a mancha de óleo vermelho O apareceu como uma grande gota de gordura que medidos a citoplasma e sobreposta com núcleos e permitindo dados para ser apresentado como % de células positivas.
Em contraste, a morfologia da FABP4 encontrava é consistente em adipócitos derivados de uma variedade de tecidos diferentes fontes23,24,25. A capacidade de quantificar a proporção de células dentro de uma cultura capaz de diferenciação tem um número de aplicações. Células estromais mesenquimais adultas segura promessa significativa para uma variada gama de usos terapêuticos. Uma questão importante que surgiu com tradução clínica é a variabilidade inerente a capacidade dessas células entre pacientes26, entre os locais de isolamento27,28e entre os métodos para isolamento12 e expansão da célula números12 para uso terapêutico. Ficou demonstrado anteriormente que as culturas de células do estroma aderentes são frequentemente heterogêneas, com algumas células capazes de diferenciação e alguns não 12,17 como nosso FABP4 ensaio demonstra para culturas ASC. Ensaios como este, combinados com técnicas de enriquecimento, ajudará a identificar subpopulações dentro de culturas heterogêneas capazes de diferenciação da linhagem específica. Ter um ensaio padronizado e quantificável como este ensaio FABP4 fornece um método simples para comparação entre todas essas variáveis e o potencial para avaliar os resultados terapêuticos dentro e entre os ensaios clínicos.
A quantificação de FABP4 em um modo semi automatizado permite que a objetividade e reprodutibilidade em análise em muitos casos de doador e amostras. Além disso como o rótulo é citoplasmático, que pode potencialmente ser usado para analisar a hipertrofia (aumento do tamanho dos adipócitos) Além de hiperplasia (aumento no número de adipócitos), uma distinção que é de grande importância na pesquisa da obesidade, onde hipertrofia é fortemente associada com disfunção adiposa em indivíduos obesos,21. A epidemia de obesidade tem estimulado uma quantidade significativa de interesse na identificação de drogas capazes de controlar o armazenamento de lipídios. Este ensaio FABP4 também fornece uma leitura simples para a seleção de milhares de compostos por sua capacidade de inibir o acúmulo de lipídios.

Um dos principais requisitos estabelecidos pela sociedade internacional para terapia celular (ISCT) para definir uma célula estroma mesenquimal multipotent é que as células têm a capacidade de se diferenciarem no adipogenic, osteogênico e linhagens de chondrogenic 1. os métodos convencionais de diferenciação nestes três linhagens de medição dependem a detecção de produtos macromoleculares usando corantes químicos1. Corantes, tais como O óleo de vermelho (que manchas de gotículas de gordura nas células que sofreram adipogenesis), são baratos e fáceis de usar; no entanto eles não conseguem detectar alterações específicas na expressão gênica que ocorrem quando as células mesenquimais diferenciarem em cada respectiva linhagem2. Aqui, nós desenvolvemos um ensaio de diferenciação que quantifica a expressão da proteína para um marcador de linhagem específica de adipogenic, ácido graxo ligação proteína-4 (FABP4)3,4,5. FABP4 foi inicialmente encontrado em de adipócitos 3T3-L1 murino3 e mais tarde foi descoberto para ser expressos no tecido adiposo subcutâneo humano6. É uma proteína citosólica, que atua como um acompanhante para orientar a captação de ácidos graxos pelas células e está envolvido no processo de Lipólise4.
As células precursoras utilizadas para os ensaios de diferenciação foram adiposa células estromais mesenquimais derivadas (ASCs)7,8. ASCs compartilham muitas propriedades com medula óssea derivados mesenquimais células-tronco (BM-MSCs), uma população de grandes células-tronco mesenquimais em adultos8,9. ASCs oferecem várias vantagens sobre BM-MSCs em uma aplicação clínica, como maior rendimento de células pode ser isolado de tecido mais prontamente acessíveis fontes8,9. Uma população de células isoladas precisa atender a determinados critérios sejam definidos como ASCs. Primeiro, eles devem mostrar adesão aos vasos de plástico de cultura de tecidos em condições de cultura padrão1. Eles também devem mostrar de expressão do antígeno de superfície específica1. Incultos ASCs caracterizam-se pela expressão do antígeno de superfície positiva de CD34, CD73, CD90, baixa expressão de CD105 e expressão negativa de CD45 e HLA-DR10. ASCs purificados pelo cultivo em plástico para 28 dias (aderente purificado ASCs) mostram expressão positiva de CD73, CD90 e CD105 e expressão negativa de CD34, CD45 e HLA-DR10. Finalmente, as células devem manter a capacidade de se diferenciar em várias linhagens1,7,8.
Protocolos de diferenciação Adipogenic induzem upregulation marcante de expressão FABP4 entre outros genes de linhagem dos adipócitos, então usamos imunoquímica Visualizar FABP4 proteína dentro das células e em seguida quantificado FABP4 expressão no nível da célula única usando um microscópio de triagem automatizada de alto teor fluorescente. Este método é vantajoso sobre corantes tradicionais, como permite a confirmação altamente específica de diferenciação dos adipócitos-linhagem. Tais ensaios de linhagem específica do gene combinados com alto teor de métodos de triagem também permitem a quantificação da proporção de células dentro de uma preparação de células heterogêneas que são capazes de diferenciação para baixo uma linhagem particular. Em nossos estudos usamos o ensaio FABP4 para confirmar a perda do potencial de diferenciação de adipogenic de ASCs recentemente isolados após a cultura de células.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:419px;">Tris Base</td>
			<td style="width:124px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15504-020</td>
			<td style="width:237px;">Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1064041000</td>
			<td>Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1049360500</td>
			<td>Tris buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Azide</td>
			<td>Scharlau</td>
			<td>SO0091</td>
			<td>Casein blocker solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Casein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7078-500G</td>
			<td>Casein blocker solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS tablet</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11330-032</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10091-148</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-029</td>
			<td>Cell dissociation enzyme</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">96 well plate (flat bottom)</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>FAL353072</td>
			<td>Cell culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">T75 culture flask, with filter cap</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>658175</td>
			<td>Cell culture equipment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Insulin</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>19278-5ML</td>
			<td>Adipogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">dexamethasone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2915-100MG</td>
			<td>Adipogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">indomethacin</td>
			<td>sigma</td>
			<td>I7378-5G</td>
			<td>Adipogenic differentiation media</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oil-Red O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O-0625</td>
			<td>Classic stain for adipogenesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isopropanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09634</td>
			<td>Classic stain for adipogenesis</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">16% formaldehyde</td>
			<td>Pierce</td>
			<td>28908</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetone</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td>Cell fixation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti rabbit IgG alexa 488</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thimerosal</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5125-10G</td>
			<td>Immunocytochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rabbit anti-human fatty acid binding protein 4 (FABP4) antibody</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>10004944</td>
			<td>Marker of adipogenesis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Centrifuge tubes (15mL)</td>
			<td style="width:124px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">GR188271</td>
			<td>General</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Centrifuge tubes (50mL)</td>
			<td style="width:124px;">Greiner</td>
			<td style="width:119px;">GR227261-P</td>
			<td>General</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">ImageXpress Micro XLS</td>
			<td style="width:124px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>high content screening machine</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:419px;">MetaXpress</td>
			<td style="width:124px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>high content screening software, version 5.4.01</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and quantification of mesenchymal cell adipogenic differentiation potential with a lineage specific marker

Vários corantes estão disponíveis atualmente para uso na detecção de diferenciação das células mesenquimais em adipócitos. Corantes, tais como O de óleo vermelho, são mais barato, fácil de usar e amplamente utilizada pelos laboratórios, analisando o potencial de adipogenic das células mesenquimais. No entanto, eles não são específicos para alterações na transcrição do gene. Nós desenvolvemos um ensaio de diferenciação de gene-específico para analisar quando uma célula mesenquimal mudou seu destino para uma linhagem de adipogenic. Imuno-rotulagem contra ácidos graxos ligação proteína-4 (FABP4), um marcador de linhagem específica de adipogenic diferenciação, permitiu a visualização e quantificação de células diferenciadas. A capacidade de quantificar adipogenic potencial de diferenciação das células mesenquimais em um formato de 96 microplacas bem tem implicações promissoras para um número de aplicações. Centenas de ensaios clínicos envolvem o uso de células estromais mesenquimais adultas e é actualmente difícil correlacionar os resultados terapêuticos dentro e especialmente entre tais ensaios clínicos. Este ensaio de FABP4 simples do elevado-throughput fornece um ensaio quantitativo para avaliar o potencial de diferenciação das células do paciente-derivado e é uma ferramenta robusta para comparar diferentes métodos de isolamento e expansão. Isto é particularmente importante dado o reconhecimento crescente da heterogeneidade das células sendo administrado a pacientes em produtos de células mesenquimais. O ensaio também tem potencial utilidade na triagem de drogas de alto throughput, particularmente na obesidade e pré-diabetes pesquisa.

Neste estudo, foram medidos o potencial de diferenciação de adipogenic de ASCs com 3 métodos diferentes. Imunofluorescência rotulagem de FABP4, mostrou que este marcador localizadas para o citoplasma de células diferenciadas, e a rotulagem sobreposto com núcleos com rótulo DAPI (figura 1A). A análise automatizada de imagem revelou um aumento de 24,6 vezes no % de células positivas FABP4 no grupo diferenciada em células de passagem antecipada em relação ao aumento de 6,9 vezes nas células de passagem final (figura 1B). Manchando de vermelho O óleo era localizada, gotículas de gordura dispersadas por todo o citosol de células diferenciadas, e raramente a rotulagem sobreposto com núcleos com rótulo DAPI; no entanto, de inspeção visual, existem menos núcleos de célula associados com gotículas de óleo vermelho O de gordura nas células de passagem atrasado em comparação com as células de passagem antecipada (Figura 2A). Análise automatizada de imagem revelou um aumento de 11,1 dobra na área de óleo vermelho O manchamento por célula em células de passagem antecipada e um aumento de 53.9 vezes na coloração de área por célula em células de passagem final (Figura 2B). Imagem de ambas as manchas foi realizada e em seguida quantificado usando celular marcando (FABP4) ou Transfluor (óleo vermelho O) módulo no software (complementar a Figura 1, tabela complementar 2-5). O upregulation de expressão FABP4 foi confirmado pela análise ocidental do borrão (Figura 3, complementar a Figura 5). Todos os métodos de análise 3 revelaram que cedo passagem ASCs tem maior diferenciação de adipogenic potencial do que as células de passagem final. A diferenciação de adipogenic não afetou o número total de células por poço (complementar a Figura 2, 3). No entanto, o tamanho de núcleos de células diferenciada FABP4-positivo foi significativamente menor do que células de controle para a passagem final ASCs somente (complementar a Figura 3).
Demonstrámos que, como células foram expandidas em cultura, ou passadas, a percentagem de células em uma cultura capaz de diferenciação adipogenic diminuída, consistente com dados previamente publicados11. É importante observar que fatores como idade, índice de massa corporal ou de histórico médico anterior12 não podem ser controlados por este estudo e provavelmente contribuiu para a variabilidade observada entre amostras diferentes doadores (complementar a tabela 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig1.jpg"> Figura 1 : FABP4 encontrava mostra que células de passagem precoce têm maior potencial de diferenciação do que as células de passagem posteriores. A) imagens representante de passagem cedo e tarde, de controle e de células diferenciadas rotuladas com DAPI (mancha nuclear) e FABP4 são mostradas ao lado de Mesclar e segmentação de imagens. A segmentação de imagens Exibir células com uma camada verde e células indiferenciadas com uma sobreposição vermelha diferenciados. B) um aumento significativo no FABP4 expressando células foi observado com adipogenic diferenciação em células de passagem cedo e tarde, no entanto, as células de passagem antecipada demonstraram aumento significativamente maior na diferenciação de células de passagem final (Mann Whitney teste * denota P < 0,05 e * * * denota P < 0,001). Os dados mostrados são a média em toda a passagem precoce (p4; n = 8) ou passagem final (p10; n = 4) amostras do doador, ± SEM. <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig2.jpg"> Figura 2 : Óleo vermelho O coloração mostra que células de passagem antecipada têm maior potencial de diferenciação do que as células de passagem posteriores. A) as imagens representativas de DAPI (mancha nuclear) e O vermelho de óleo (cinzento, mancha de gotículas de lipídios) são mostradas ao lado de Mesclar e segmentação de imagens. As imagens de segmentação retratam todos os núcleos com sobreposição de verde e óleo vermelho O manchado gotículas lipídicas com uma sobreposição de vermelha. B) um aumento significativo na área de mancha de óleo vermelho O observou-se com diferenciação de adipogenic. Células de passagem cedo mostrou maior área de mancha de óleo vermelho O por célula, em comparação com as células de passagem final. A área da mancha de óleo vermelho O por célula (μm2) é usada aqui como uma medida de adipogenic diferenciação potencial. Os dados mostrados são a média em toda a passagem precoce (p4; n = 8) ou passagem final (p10; n = 4) amostras do doador, ± SEM (teste de Mann-Whitney * denota P = < 0,05 e * * * denota P = < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57153/57153fig3.jpg"> Figura 3 : Análise ocidental do borrão do nível de expressão de proteínas FABP4 de passagem diferenciada cedo e tarde ASCs. Análise semi-quantitativa da densidade óptica de FABP4 bandas como uma relação de controle de carregamento de proteína total, actina beta (ACTB), mostrou que encontrava FABP4 aumentou significativamente na passagem precoce e a uma menor grau tarde passagem diferenciadas células. Os dados mostrados são a média em toda a passagem precoce (p4; n = 8) ou passagem final (p10; n = 4) amostras do doador, ± SEM (teste de Mann-Whitney * denota P = < 0,05 e * * * denota P = < 0,001). <a href="/files/ftp_upload/57153/57153fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antígeno alvo</td>
			<td>ISOTYPE (clone)</td>
			<td>Espécies</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td>FABP4</td>
			<td>Polyclonal</td>
			<td>Coelho</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Anticorpo primário
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Direcionamento de anticorpo</td>
			<td>Rótulo de fluoróforo</td>
			<td>Espécies</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td>IgG de coelho</td>
			<td>Alexa fluor 488</td>
			<td>Cabra</td>
			<td>1: 200</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Anticorpo secundário
Complementar Figura 1: visão geral sobre o ambiente virtual de análise de imagem. As células coradas foram fotografadas usando um microscópio fluorescente automatizado, de alta produtividade para evitar qualquer fonte de viés. Imagens adquiridas usando ImageXpress Micro XLS, foram salvas diretamente para o banco de dados do Gerenciador de dados MDCStore e feitas disponíveis para visualização através de conexões de área de trabalho virtual, que os usuários utilizam para otimizar e testar seus parâmetros de análise específico. Imagens foram analisadas com uma instância dedicada 'autorun' que permite que vários usuários diferentes enviar 'empregos' para a fila de autorun. Os usuários podem recuperar seus dados através da instância virtual quando seus 'empregos' forem concluídos. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_1.jpg" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 2: comparação do total contagem por poço de controle de células e diferenciadas poços para cedo e tarde passagem ASCs, usando FABP4 manchado placa. Os dados mostrados são a média em toda a passagem precoce (p4; n = 8) ou passagem final (p10; n = 4) amostras do doador, ± SEM. Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa entre o controle e as células diferenciadas para a passagem de cedo e tarde ASCs. Havia mais células por poço para células de passagem precoce em comparação com as células de passagem final. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_2.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 3: comparação do total contagem por poço de controle de células e diferenciadas poços para cedo e tarde passagem ASCs, usando óleo vermelho O manchado placa. Os dados mostrados são a média em toda a passagem precoce (p4; n = 8) ou passagem final (p10; n = 4) amostras do doador, ± SEM. Não houve nenhuma diferença estatisticamente significativa entre o controle e as células diferenciadas para a passagem de cedo e tarde ASCs. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_3.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 4: passagens posteriores, células diferenciadas que foram FABP4 positivo tinham área de núcleos significativamente menor do que as células em poços controle. Não havia nenhuma diferença estatisticamente significativa na área de núcleos entre controle e células diferenciadas na passagem antecipada. Os dados mostrados são a média em toda a passagem precoce (p4; n = 8) ou passagem final (p10; n = 4) amostras do doador, ± SEM. (teste t não pareado * * * denota P = < 0,001). Média ± SEM são mostrados.) <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_4.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Complementar Figura 5: imagens de Western blot géis. Canal vermelho retrata beta-actina. Canal verde retrata encontrava FABP4. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_Figure_5.tiff" target="_blank">Clique aqui para baixar esta figura.</a>
Suplementares tabela 1: informações clínico dos doadores <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_1.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementares tabela 2: Imaging configurações (FABP4) <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_2.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementares tabela 3: Imaging configurações (óleo vermelho O) <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_3.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementares tabela 4: tabela de parâmetros de análise utilizado (FABP4). Módulo de pontuação da célula. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_4.xlsx" target="_blank">, Por favor clique aqui para baixar esta tabela.</a>
Suplementares tabela 5: tabela de parâmetros de análise utilizado (O vermelho de óleo). Módulo trans Fluor. <a href="/files/ftp_upload/57153/Supplementary_table_5.xlsx" target="_blank">, Por favor clique aqui para baixar esta tabela.</a>

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Visualization and Quantification of Mesenchymal Cell Adipogenic Differentiation Potential with a Lineage Specific Marker

Os métodos tradicionais de avaliação adipogenic diferenciação são baratos e fáceis de usar, mas não são específicos para alterações na expressão gênica. Nós desenvolvemos um ensaio para quantificar a diferenciação de células mesenquimais em adipócitos maduros, usando um marcador específico de linhagem. Este ensaio tem diversas aplicações através de pesquisa básica e clínica médica.

Visualização e quantificação de células mesenquimais Adipogenic diferenciação potencial com um marcador específico da linhagem

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Marcador de superfície celular Purificação Mediada de iPS Intermediários celulares a partir de um modelo Reprogramável mouse

Mature cells can be reprogrammed to a pluripotent state. These so called induced pluripotent stem (iPS) cells are able to give rise to all cell types of ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

Manipulando o Murino lacrimais Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

Visualization and Quantification of the Cell-free Layer in Arterioles of the Rat Cremaster Muscle

Visualização e quantificação da Camada de livre-Cell nas arteríolas do músculo Rat Cremaster

The cell-free layer is defined as the parietal plasma layer in the microvessel flow, which is devoid of red blood cells. The measurement of the in vivo ...

Extraction, Labeling, and Purification of Lineage-Specific Cells from Human Antral Follicles

Extração, marcação e purificação de células específicas de linhagem de folículos antrais humanos

The activation, growth, development, and maturation of oocytes is a complex process that is coordinated not just between multiple cell types of the ovary ...

Adipose Tissue-Derived Stem Cell Isolation and Characterization

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats

Isolation and Identification of Mesenchymal Stem Cells Derived from Adipose Tissue of Sprague Dawley Rats (Video) | JoVE 

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Adult mesenchymal cells have revolutionized molecular and cell biology in recent decades. They can differentiate into different specialized cell types, in ...

Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells

Fluorescence-Based Quantification of Mitochondrial Membrane Potential and Superoxide Levels Using Live Imaging in HeLa Cells (Video) | JoVE 

Quantificação Baseada em Fluorescência do Potencial de Membrana Mitocondrial e Níveis de Superóxido Usando Imagem Viva em Células HeLa

Mitochondria are dynamic organelles critical for metabolic homeostasis by controlling energy production via ATP synthesis. To support cellular metabolism, ...

Artificial Cartilage Implants for Bone Regeneration via Endochondral Ossification

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Enhancing Bone Regeneration with Vascularized Artificial Cartilage Integration (Video) | JoVE

Formação Óssea Integrada Através da Ossificação Endocondral In Vivo Usando Células-Tronco Mesenquimais

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...